新西兰大白兔距骨软骨细胞的分离培养与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (28): 4475-4480.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.008

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新西兰大白兔距骨软骨细胞的分离培养与鉴定

王勇平^1，2，朱兆金¹，徐向阳¹

¹上海交通大学附属瑞金医院骨科，上海市 200025；²兰州大学第一医院骨科，甘肃省兰州市 730000

修回日期:2017-06-27 出版日期:2017-10-08 发布日期:2017-11-10
通讯作者: 徐向阳，博士，主任医师，博士生导师，上海交通大学附属瑞金医院骨科，上海市 200025
作者简介:王勇平，男，1975年生，甘肃省宁县人，汉族，2013年上海交通大学毕业，博士，副主任医师，主要从事关节外科及骨科生物材料的研究。
基金资助:
兰州大学第一医院科研基金项目(ldyyyn2017-21)

Isolation, culture and identification of New Zealand white rabbit talar chondrocytes

Wang Yong-ping^{1, 2}, Zhu Zhao-jin¹, Xu Xiang-yang¹

¹Department of Orthopedics, Ruijin Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; ²Department of Orthopedics, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Revised:2017-06-27 Online:2017-10-08 Published:2017-11-10
Contact: Xu Xiang-yang, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Ruijin Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China
About author:Wang Yong-ping, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Ruijin Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China; Department of Orthopedics, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Fund of the First Hospital of Lanzhou University, No. ldyyyn2017-21

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
软骨细胞：位于软骨基质内的软骨陷窝中。在陷窝的周围，有一层染色深的基质，称软骨囊。软骨细胞在软骨内的分布有一定的规律性，靠近软骨膜的软骨细胞较幼稚，体积较小，呈扁圆形，单个分布。当软骨生长时，细胞渐向软骨的深部移动，并具有较明显的软骨囊，细胞在囊内进行分裂，逐渐形成有2-8个细胞的细胞群，称为同源细胞群。软骨细胞核椭圆形，细胞质弱嗜碱性，生活时充满软骨陷窝内。
软骨基质：透明软骨基质的化学组成主要为大分子的软骨黏蛋白，其主要成分是酸性糖胺多糖(glycosaminoglycan)。软骨黏蛋白的主干是长链的透明质酸分子，其上结合了许多蛋白质链，蛋白质链上又结合了许多硫酸软骨素和硫酸角质蛋白链，故染色呈碱性。这种羽状分支的大分子结合着大量的水，大分子之间又相互结合构成分子筛，并和胶原原纤维结合在一起形成固态的结构。软骨内无血管，但由于软骨基质内富含水分(约占软骨基质的75%)，营养物质易于渗透，故软骨深层的软骨细胞仍能获得必需的营养。

摘要
背景：课题组在前期研究的基础上，体外分离、培养及鉴定新西兰大白兔距骨软骨细胞。
目的：探讨新西兰大白兔距骨软骨细胞体外分离、培养及鉴定的实验方法。
方法：课题组采用单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离新西兰大白兔距骨软骨细胞，进行体外培养，通过形态学观察、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色对软骨细胞进行鉴定。
结果与结论：①倒置相差显微镜观察3代以内新西兰大白兔距骨软骨细胞呈多角形或三角形，核为圆形或椭圆形；②甲苯胺蓝染色可见新西兰大白兔距骨软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色；③Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色可见新西兰大白兔距骨软骨细胞胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒；④实验成功建立了新西兰大白兔距骨软骨细胞体外分离、培养及鉴定体系；实验结果提示3代以内软骨细胞生长良好，保持软骨细胞稳定的生物学特征。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID:0000-0001-9825-2801(王勇平)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 距骨, 兔, 细胞分离, 细胞培养, 鉴定

Abstract:

BACKGROUND: Based on the previous studies, the New Zealand rabbit talar chondrocyts were isolated, cultured and identified in vitro.
OBJECTIVE: To explore the isolation, culture and identification of New Zealand rabbit talar chondrocyts in vitro.
METHODS: The chondrocyts were isolated from the talar cartilage of New Zealand white rabbits by type II collagen enzyme digestion, and then cultured in vitro. The cells were identified by inverted phase contrast microscope, toluidine blue staining and collagen type II immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the inverted phase contrast microscope, most of passaged chondrocytes presented with polygonal or triangle shape and had round or oval nuclei. Toluidine blue staining showed the hyacinthine chondrocytes and blue cellular matrix. Collagen type II immunohistochemical staining showed that the chondrocytes appeared with brown granules in the cytoplasm and membrane. To conclude, a system that can isolate, culture and identify talar chondrocytes from New Zealand rabbits is successfully established. Talar chondrocytes at passages 1-3 grow well and have stable biological properties.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Talus, Chondrocytes, Collagen Type II, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王勇平，朱兆金，徐向阳. 新西兰大白兔距骨软骨细胞的分离培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4475-4480.

Wang Yong-ping, Zhu Zhao-jin, Xu Xiang-yang. Isolation, culture and identification of New Zealand white rabbit talar chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4475-4480.

图/表（结果） 1

2.1 倒置相差显微镜观察结果 倒置相差显微镜下观察，原代新西兰大白兔距骨软骨细胞在培养瓶中8-12 h开始贴壁；一两天开始伸展，此时细胞体积较小，呈多角形(图1A)；12-15 d形成单层细胞，此时细胞呈梭形，有少量突起，排列紧密，呈“铺路石”样(图1B)。

第1代新西兰大白兔距骨软骨细胞刚接种时呈球形，12 h开始贴壁，24 h开始伸展，多呈三角形、长梭形或多角形；72 h后细胞开始增殖，形成单层细胞，彼此不相接触(图2A)。细胞生长增殖至爬满培养瓶底时，细胞互相连接，呈“铺路石”样(图2B)。长时间培养形成肉眼可见的白色“类软骨样”物质。

2.2 吖啶橙荧光染色结果 吖啶橙荧光染色后荧光显微镜下用蓝紫光激发滤片进行观察，可见新西兰大白兔距骨软骨细胞核呈清晰绿色荧光，第1代软骨细胞贴壁时间较原代软骨细胞短，其生长增殖速度也较原代软骨细胞快(图3 A，B及图4 A，B)。

2.3 甲苯胺蓝染色结果 甲苯胺蓝染色后倒置相差显微镜下观察，可见新西兰大白兔距骨软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒，证明新西兰大白兔距骨软骨细胞合成和分泌蛋白聚糖(图5A)。

2.4 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果 Ⅱ型胶原免疫组化染色后倒置相差显微镜下观察，可见新西兰大白兔距骨软骨细胞胞浆及胞膜被染成棕黄色，胞核不着色，证明软骨细胞表达的特征性Ⅱ型胶原主要分布在细胞胞浆和胞膜上(图5B)。

2.5 细胞生长曲线 第1代新西兰大白兔距骨软骨细胞培养0-3 d，增殖速度相对缓慢，4-6 d增殖速度较快，并迅速达到高峰，7-9 d增殖速度趋于平缓，10-13 d增殖速度呈下降趋势(图6)。

参考文献

[1] 王勇平,朱兆金,徐向阳.距骨骨软骨损伤研究现状.生物骨科材料与临床研究,2016,13(3):63-66.

[2] Looze CA, Capo J, Ryan MK, et al. Evaluation and management of osteochondral lesions of the talus. Nehrer S, Vannini F, eds. Cartilage. 2017; 8(1): 19-30.

[3] Prado MP, Kennedy JG, Raduan F, et al. Diagnosis and treatment of osteochondral lesions of the ankle: current concepts. Revista Brasileira de Ortopedia.2016; 51(5): 489-500.

[4] Gianakos AL, Yasui Y, Hannon CP, et al. Current management of talar osteochondral lesions. World J Orthop. 2017;8(1):12-20.

[5] Baums MH, Schultz W, Kostuj T, et al. Cartilage repair techniques of the talus: An update. World J Orthop .2014; 5(3): 171-179.

[6] Badekas T, Takvorian M, Souras N. Treatment principles for osteochondral lesions in foot and ankle. International Orthopaedics. 2013;37(9): 1697-1706.

[7] Zengerink M, Struijs PAA, Tol JL, et al. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 2010;18(2): 238-246.

[8] Ferkel RD, Scranton PE Jr, Stone JW, et al. Surgical treatment of osteochondral lesions of the talus. Instr Course Lect.2013;59: 387-404.

[9] Reilingh ML, van Bergen CJA, Blankevoort L, et al. Computed tomography analysis of osteochondral defects of the talus after arthroscopic debridement and microfracture. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 2016, 24:1286-1292.

[10] Saltzman BM, Lin J, Lee S. Particulated Juvenile Articular Cartilage Allograft Transplantation for Osteochondral Talar Lesions. Nehrer S, Vannini F, eds. Cartilage. 2017, 8(1): 61-72.

[11] 王双利,潘政军,江华,等. 距骨骨软骨损伤手术治疗的研究进展[J]. 中华解剖与临床杂志,2016,21(2):172-175.

[12] 陈俊峰,张家兴,黄剑伟. 踝关节镜下自体骨软骨移植术和微骨折手术治疗距骨骨软骨损伤比较[J]. 现代医院, 2016,16(3): 356-358.

[13] 肖裕春,赵建国,袁涛,等.自体骨软骨移植治疗距骨骨软骨损伤疗效分析[J]．实用骨科杂志,2014,20(12):1092-1095．

[14] Becher C, Zühlke D, Plaas C, et al. T2 -mapping at 3 T after microfracture in the treatment of osteochondral defects of the talus at an average follow-up of 8 years. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc.2015;23(8):2406-2412.

[15] Yasui Y, Wollstein A, Murawski CD, et al. Operative treatment for osteochondral lesions of the talus: biologics and scaffold-based therapy. Cartilage. 2017;8(1):42-49.

[16] Seo SJ, Mahapatra C, Singh RK, et al. Strategies for osteochondral repair: Focus on scaffolds. Journal of Tissue Engineering. 2014;5:1-14.

[17] Phull AR, Eo SH, Abbas Q, et al. Applications of chondrocyte based cartilage engineering: An overview. BioMed Research International. 2016;2016:1-17.

[18] Zhong L, Huang X, Karperien M, et al. The Regulatory Role of Signaling Crosstalk in Hypertrophy of MSCs and Human Articular Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2015;16(8): 19225-19247.

[19] 孙安科,裴国献.软骨组织工程种子细胞的来源、培养和评价[J]. 国外医学:生物医学工程分册,2003,26(4):179-183.

[20] 刘小荣,张笠,高武,等.新西兰兔关节软骨细胞分离培养与鉴定的实验研究[J].国际检验医学杂志,2012,33(19):2307-2308.

[21] 王勇平,蒋垚．软骨细胞体外培养及鉴定[J].生物骨科材料与临床研究,2012,9(4):33-35．

[22] Danisovic L, Varga I, Zamborsky R, et al. The tissue engineering of articular cartilage: cells, scaffolds and stimulating factors. Exp Biol Med (Maywood). 2012；237(1): 10-17.

[23] 关炼雄,段莉,黄江,等. 软骨细胞去分化研究进展[J]．国际骨科学杂志,2014,35(4):250-253．

[24] The Ministry of Science and Technology of the People’ s Republic of China. Guidance suggestions for the care and use of laboratory animals.2006-09-30.

[25] 赵海洋,马子君,路屹,等.兔关节软骨细胞原代培养及生物学鉴定[J].中国老年学杂志,2015,35(4):1049-1051.

[26] 叶蕻芝,李西海,梁文娜,等.软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究[J].福建中医学院学报,2008,18(6):32-37.

[27] 李兵,吴志宏,刘广源,等.三种软骨细胞分离培养方法对细胞骨架影响的比较[J].中华实验外科杂志,2007,24(9):1108-1110.

[28] 匡世军,刘志光,何一青,等.兔颞下颌距骨盘纤维软骨细胞分离培养的实验研究[J].中山大学学报:医学科学版, 2006, 27(3): 318-321.

[29] 张志光,郑卫平,苏凯.兔关节软骨细胞的分离、培养和形态学特征[J].中山大学学报:医学科学版,2004,25(1): 63-66.

[30] Chockalingam PS, Varadarajan U, Sheldon R, et al. Involvement of protein kinase Czeta in interleukin-1beta induction of ADAMTS-4 and type 2 nitric oxide synthase via NF-kappa B signaling in primary human osteoarthritic chondrocytes. Arthritis Rheum.2007;56(12): 4074-4083.

[31] Ho LJ, Lin LC, Hung LF, et al. Retinoic acid blocks pro-inflammatory cytokine-induced matrix metalloproteinase production by down-regulating JNK-AP-1 signaling in human chondrocytes. Biochem Pharmacol. 2005;70(2): 200-208.

[32] 刘雷,韦庆军,陈管雄,等. 乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察[J].广西医科大学学报,2014,31(3):364-368.

[33] Ryu JH, Chun JS. Opposing roles of WNT-5A and WNT-11 in interleukin-1beta regulation of type II collagen expression in articular chondrocytes.J Biol Chem. 2006;281(31): 22039-22047.

[34] 张莉,郭全义,眭翔,等.羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增[J]．中国矫形外科杂志,2006,14(6):446-448．

[35] Schulze-Tanzil G, Muller RD, Kohl B, et al. Differing in vitro biology of equine, ovine, porcine and human articular chondrocytes derived from the knee joint: an immunomorphological study. Histochem Cell Biol.2009；131(2): 219-229.

[36] Fukui N, Ikeda Y, Tanaka N, et al. αvβ5 integrin promotes dedifferentiation of monolayer-cultured articular chondrocytes. Arthritis Rheum.2011;63(7): 1938-1949.

[37] Kang SW, Yoo SP, Kim BS. Effect of chondrocyte passage number on histological aspects of tissue-engineered cartilage. Biomed Mater Eng.2007;17(5): 269-276.

[38] Ahmed N, Gan L, Nagy A, et al. Cartilage tissue formation using redifferentiated passaged chondrocytes in vitro. Tissue Eng Part A.2009;15(3): 665-673.

[39] 王林林,董玉珍.体外兔软骨细胞的分离、培养与鉴定的研究[J].新乡医学院学报,2015,32(4):310-313.

引言

距骨骨软骨损伤(osteochondral lesions of the talus，OLT)是踝关节慢性疼痛的主要病因之一^[1-8]。由于距骨骨软骨是透明软骨，组织代谢活性较低，无血液供应，无神经组织和淋巴回流，因此，距骨骨软骨损伤后自身修复能力较差，难以彻底修复。

以往，距骨骨软骨损伤的治疗方法主要为软骨下钻孔术、自体软骨移植术、异体软骨移植术、软骨细胞移植术等^[8-14]。软骨下钻孔术只能暂时缓解疼痛，距骨软骨不能获得生理性修复；自体软骨移植术由于软骨细胞增殖活性低，且软骨组织来源有限，其临床应用常受到限制。

组织工程技术为距骨骨软骨损伤修复提供了新方向，采用组织工程技术修复距骨骨软骨损伤成为研究热点，然而，目前尚未见临床应用的报道^[15-16]。

软骨细胞是软骨组织工程技术的要素之一^[17-19]。软骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而来，位于软骨基质内的软骨陷窝中，软骨基质主要由胶原纤维蛋白和蛋白聚糖等大分子构成，且呈固态结构，因此体外分离软骨细胞存在一定的困难^[20-21]。软骨细胞体外增殖活性较低，因此在体外培养软骨细胞体时，随着传代代数增多，软骨细胞的标志物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达逐渐减少，从而出现软骨细胞的“去分化”现象^[20-23]，因此体外培养软骨细胞存在一定的难度。

目前，细胞体外培养时可以扩增细胞数量，但软骨细胞增殖能力有限，扩增达一定数量后细胞出现复制衰老现象及生物学功能衰退。因此，如何利用有限的供体活组织收获尽可能多而且活性高的原代软骨细胞，显得非常重要。

前期课题组曾采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法体外分离新西兰大白兔膝关节软骨细胞，结果发现获得的原代软骨细胞贴壁较困难，因此课题组采用单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法体外分离新西兰大白兔膝关节软骨细胞，建立新西兰大白兔膝关节软骨细胞体外分离、培养及鉴定体系^[21]。

本研究采用单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离新西兰大白兔距骨软骨细胞，进行体外培养，用形态学观察、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色对距骨软骨细胞进行鉴定，以建立新西兰大白兔距骨软骨细胞体外分离、培养及鉴定体系，并研究其生物学特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年7月至2016年1月在甘肃中医药大学实验中心完成。

1.3 材料

仪器：CO₂ 细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(Wellscan MK3，芬兰)。

试剂：DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)、体积分数10%胎牛血清、吖啶橙(Sigma，美国)、甲苯胺蓝(Amresco，美国)、兔抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、免疫组织化学试剂盒(博士德，中国)、MTT、DMSO。

实验动物：选取健康成年新西兰大白兔4只(由甘肃中医药大学动物实验中心提供)，体质量2.5-3.0 kg，清洁级，实验过程按照《关于善待实验动物的指导性意见》处理实验动物^[24]。

1.4 实验方法

1.4.1 新西兰大白兔距骨软骨细胞的体外分离 在无菌条件下切取新西兰大白兔距骨软骨，并迅速将新西兰大白兔距骨软骨组织转移到超净工作台，用PBS(含100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素)冲洗3次，彻底去除软骨组织上沾染的血液，然后将软骨组织切成约1 mm×1 mm×1 mm大小碎片，收集在20 mL含DMEM培养基的无菌离心管中，按1∶3的比例加入Ⅱ型胶原蛋白酶(0.2 g/L)，37℃过夜，次日向离心管中加入3-5 mL DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)，终止消化，将消化物用200目的细胞筛过滤，收集过滤液并进行离心(1 000 r/min离心5 min)，弃上清液，用PBS漂洗沉淀细胞2次后进行体外培养^[21^，^25]。

1.4.2 新西兰大白兔距骨软骨细胞的体外培养 将体外分离的软骨细胞接种在25 mL培养瓶中，用DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)进行原代培养，每3 d换液1次，当细胞生长覆盖瓶底80%以上时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)进行消化，然后进行传代培养^[21^，^26]。

1.4.3 新西兰大白兔距骨软骨细胞的鉴定

倒置相差显微镜观察：倒置相差显微镜观察体外培养的新西兰大白兔距骨软骨细胞的形态，分析原代及传代软骨细胞的生长状况及其生命活动规律。

吖啶橙荧光染色：取生长状态良好的原代及第1代新西兰大白兔距骨软骨细胞，体积分数95%乙醇固定10 min，干燥后加入足量0.01%吖啶橙染液，染色5 min，PBS洗1 min，0.1 mol/L氯化钙分色1 min，用PBS漂洗3次(每次数秒)，在荧光显微镜下用蓝紫光激发滤片进行观察软骨细胞的生长状况及其生命活动规律。

甲苯胺蓝染色：取生长状态良好的新西兰大白兔距骨软骨细胞进行细胞爬片，PBS清洗3次，体积分数75%的乙醇固定10 min，空气中干燥5 min，PBS清洗3次，1%的甲苯胺蓝进行染色5-10 min，光镜下控制，适时终止染色，PBS漂洗3次，风干爬片，中性树胶封固，倒置相差显微镜观察距骨软骨细胞染色情况^[21^，^27]。

Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色：取生长状态良好的新西兰大白兔距骨软骨细胞进行细胞爬片，每张细胞爬片加50 μL过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次(3 min/次)，去除PBS，加50 μL正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min，去除血清，加50 μL的一抗，室温下孵育60 min，PBS冲洗3次(3 min/次)，去除PBS，加50 μL抗生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次(3 min/次)，去除PBS，加50 μL链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次(3 min/次)，去除PBS，加100 μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察2-10 min，PBS冲洗3次(3 min/次)，干燥，中性树胶封固，倒置相差显微镜观察距骨软骨细胞染色情况^[21^，^28]。

软骨细胞增殖功能测定：取生长状态良好的原代新西兰大白兔距骨软骨细胞，0.25%胰蛋白酶消化，按2×10⁴/L浓度接种于5块96孔培养板中，分5组(每组1块)，每组设6个复孔，每3 d换液1次。分别于培养第1，4，7，10，14 天后随机分组，加入5 g/L MTT液20 μL/孔，孵育4 h，弃去上清液，加DMSO 200 μL/孔，振荡15 min，在酶标仪上测吸光度值(波长为490 nm)，用吸光度平均值绘制细胞生长曲线^[21^，^29]。

1.5 主要观察指标 ①兔距骨软骨细胞形态；②距骨软骨细胞吖啶橙荧光染色和甲苯胺蓝染色结果；③Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果；④细胞生长曲线。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

距骨骨软骨损伤的治疗方法主要为软骨下钻孔术、自体软骨移植术、异体软骨移植术、软骨细胞移植术等^[11-14]，然而这些方法都一定的缺陷。

近年来，组织工程技术日趋成熟，为距骨骨软骨损伤修复提供了新方向，采用该技术修复距骨骨软骨损伤成为目前研究热点。在利用组织工程技术修复距骨骨软骨损伤过程中，对种子细胞软骨细胞的数量要求巨大、生物学功能活性要求高。

由于软骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而来，位于软骨基质内的软骨陷窝中，软骨基质主要由胶原纤维蛋白和蛋白聚糖等大分子构成，且呈固态结构，因此体外分离软骨细胞存在一定的困难。由于软骨细胞体外增殖活性较低，在体外培养软骨细胞体时，随着传代代数增多，软骨细胞的标志物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达逐渐减少，从而出现软骨细胞的“去分化”现象，因此体外培养软骨细胞存在一定的难度。

虽然体外培养可以扩增细胞数量，但软骨细胞增殖能力有限，扩增达一定数量后细胞出现复制衰老现象及生物学功能衰退。因此，如何利用有限的供体活组织收获尽可能多而且活性高的原代软骨细胞，显得非常重要。

3.1 新西兰大白兔距骨软骨细胞体外分离 由于软骨细胞位于软骨基质内的软骨陷窝中，因此体外分离软骨细胞存在一定的困难^[20-21]。

目前，国外多采用链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法体外分离软骨细胞^[30-32]，而国内多采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法体外分离软骨细胞。

序贯消化法通常采用两种酶，因此采用序贯消化法分离软骨细胞时会加重酶对软骨细胞的损伤，而且操作步骤较复杂，故有学者采用单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法分离软骨细胞^[23^，^{33- 34]}。

前期，课题组曾采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法体外分离新西兰大白兔膝关节软骨细胞，结果发现获得的原代软骨细胞贴壁较困难，因此课题组改变软骨细胞分离方法，采用单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法体外分离新西兰大白兔膝关节软骨细胞，建立新西兰大白兔膝关节软骨细胞体外分离、培养及鉴定体系^[21]。

本研究采用单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法体外分离新西兰大白兔距骨软骨细胞，不仅避免序贯消化法采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶对软骨细胞的反复消化，而且避免了对软骨细胞进行反复洗涤及离心，结果发现单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法不仅简化了软骨细胞体外分离的步骤，缩短了细胞分离时间，而且减少了因反复消化、洗涤及离心造成软骨细胞损伤，使分离出的原代软骨细胞具有良好的生物活性。

3.2 新西兰大白兔距骨软骨细胞体外培养 软骨细胞体外增殖活性较低，因此在体外培养软骨细胞体时，随着传代代数增多，软骨细胞的标志物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达逐渐减少，从而出现软骨细胞的“去分化”现象^[22-23]，形态上表现为软骨细胞从最初的多角形和三角形逐渐变为类似成纤维细胞的扁平及长梭形^[35-36]，功能上表现为软骨细胞特异性标志物Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖表达减少或丧失^[22]。

目前普遍认为，体外单层培养软骨细胞3-4代后软骨细胞合成分泌基质能力下降，难以保留软骨细胞原有的表型，从而发生“去分化”现象^[23]。

Kang等^[37]研究结果提示第2代软骨细胞高表达Ⅱ型胶原蛋白，低表达Ⅰ型胶原蛋白；而第5代软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达降低，Ⅰ型胶原蛋白表达升高，表明软骨细胞随着传代代数增多而发生了“去分化”现象，使细胞增殖能力下降，凋亡增加。

Ahmed等^[38]研究结果提示原代软骨细胞体外培养传代到第2代时已发生了“去分化”现象。本研究结果提示第3代以前的新西兰大白兔距骨软骨细胞呈多角形或三角形，没有向扁平及长梭形的成纤维样细胞转变；甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白细胞免疫化学染色结果表明软骨细胞可良好地表达软骨细胞特征性Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖，证明软骨细胞具有良好的生物活性。

3.3 新西兰大白兔距骨软骨细胞鉴定 目前软骨细胞鉴定主要通过测定软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白^[39]。

本研究采用甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖，采用Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白。甲苯胺蓝染色结果显示新西兰大白兔距骨软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒，证明新西兰大白兔距骨软骨细胞合成和分泌蛋白聚糖；Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色结果显示新西兰大白兔距骨软骨细胞胞浆及胞膜被染成棕黄色，胞核不着色，证明软骨细胞表达的特征性Ⅱ型胶原主要分布在细胞胞浆和胞膜上。本研究结果提示第3代以前的软骨细胞均表达软骨细胞特征性的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白，具有良好的生物活性。

综上所述，本研究采用单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法建立了新西兰大白兔距骨软骨细胞体外分离及培养鉴定体系，可在短时间内获得高纯度、高存活率的软骨细胞，通过细胞形态学观察、吖啶橙荧光染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色证实第3代以前的新西兰大白兔距骨软骨细胞具有稳定的细胞表型特征，具有良好的生长增殖活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

新西兰大白兔距骨软骨细胞的分离培养与鉴定

Isolation, culture and identification of New Zealand white rabbit talar chondrocytes

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[1]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[3]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[4]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[5]	王少玲, 汪衍雪, 郑耀超, 余少君, 马超, 伍少玲. 超声引导兔髋关节腔准确注射的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 657-662.
[6]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[7]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[8]	王世辉, 程杨, 朱赟洁, 程少丹, 毛剑莹. 弧刃针刀治疗冻结肩模型兔炎症因子及组织形态的反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 706-711.
[9]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[10]	王钰莹, 余丽梅. 制备人羊膜间充质干细胞制剂与质量控制过程中关键问题的思考[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 4016-4021.
[11]	李石旦, 邢伟, 谢晓瑜, 李又彬, 王绍川, 费军. 提取人骨髓间充质干细胞的新方法与传统方法比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3814-3820.
[12]	陈盛, 杨艳, 丁亮, 叶传进, 张磊, 夏舒, 李慧玲, 黄晓峰. 一株永生化口腔癌相关成纤维细胞系的建立及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3808-3813.
[13]	钟自玲, 瞿申红, 韩星, 吴迪. 兔耳郭软骨细胞的分离培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3633-3637.
[14]	谢艳, 李无阴, 邢伟鹏, 裴圆圆, 王娜. 抑制生长板软骨细胞凋亡药物筛选及白藜芦醇延迟大鼠骨骺闭合的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3644-3649.
[15]	周凡琦, 李宝莹, 王凯涛, 谭荃荃, 运晨霞, 冷静. 树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3721-3727.