高仿真壳聚糖支架修复腹壁缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.018

摘要/Abstract

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文题释义：

壳聚糖：属于是一种天然聚阳离子的生物多糖，能被人体自行吸收。同时，壳聚糖溶于酸性介质中，带正电荷，是目前临床使用较多的高分子材料。文献报道显示壳聚糖在人体中能发挥抗菌活性、生物黏附作用及抗癌活性等多种功能，能促进神经和缺损组织再生。此外，壳聚糖的来源相对广泛，价格低廉，能提高缺损部位的修复，并且材料植入机体后生物相容性较高，避免了免疫排斥反应。

背景：研究显示，壳聚糖能提高纤维细胞增殖、迁移速度，促进细胞外基质的合成，能为缺损部位营造良好的愈合环境。

目的：观察高仿真壳聚糖支架修复大鼠腹壁缺损的效果。

方法：取成年SD大鼠60只，建立腹壁缺损模型，随机分2组修复，实验组于缺损部位植入高仿真壳聚糖支架，对照组植入聚丙烯补片，修复后2，4周，进行修复部位大体、粘连及病理组织学观察。

结果与结论：①大体观察：对照组修复后2周缺损部位与网膜存在粘连现象，修复4周后补片部位明显增厚，与周围组织界限比较清晰，补片区域色泽一般，整合一般；实验组修复2周后缺损部位与支架轻微粘连，修复后4周补片增厚，缺损部位未见明显隆起、红肿、感染，伤口愈合较好；②粘连：实验组修复后4周Kadata粘连评分低于对照组(P < 0.05)；③病理组织学观察：对照组修复4周后可见毛细血管生长，存在大量的成纤维细胞，缺损部位存在大量炎细胞浸润；实验组修复4周后可见少许炎症细胞，存在大量胶原纤维、毛细血管，肉芽组织成熟度较高；④结果表明：高仿真壳聚糖支架可促进缺损腹壁的修复，减轻炎性反应。

ORCID: 0000-0003-4956-4504 (刘洪泽)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 高仿真壳聚糖支架, 生物相容性, 腹壁缺损, 梯度冷淋技术, 壳聚糖, 聚丙烯补片

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that chitosan can improve the proliferation and migration of fibroblasts, promote the synthesis of extracellular matrix, and create a favorable environment for defect healing.

OBJECTIVE: To observe the effect of highly simulated chitosan scaffolds in repairing abdominal wall defects in rats.

METHODS: Sixty adult Sprague-Dawley rats were used to make animal models of abdominal wall defects, and then model rats were randomly divided into two groups: experimental group and control group followed by implantation with the highly simulated chitosan scaffold and polypropylene mesh, respectively. At 2, 4 weeks after repair, gross, adhesion and histopathological observations of the repair part were performed.

RESULTS AND CNCLUSION: Gross observation: in the control group, omental adhesion was found at 2 weeks after repair; and at 4 weeks after repair, the mesh was thickened and exhibited clear boundaries with the surrounding tissue, but common color and integration. In the experimental group, there was mild adhesion between the scaffold and the defect site at 2 weeks after repair, and the mesh was thickened, but the wound healed well with no prominence, swelling, and infection at 4 weeks after repair. Kadata adhesion score in the experimental group was lower than that the control group at 4 weeks after repair (P < 0.05). Pathological observation showed that at 4 weeks after repair, there were a large number of infiltrated inflammatory cells, capillary growth, and a large number of fibroblasts at the defect site in the control group; and meanwhile, a small amount of infiltrated inflammatory cell infiltration and a large number of collagen fibers and capillaries, with better granulation tissue maturity, were found in the experimental group. To conclude, the highly simulated chitosan scaffold can promote the repair of abdominal wall defects and reduce inflammatory reactions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Polypropylenes, Tissue Adhesions, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘洪泽，魏洁. 高仿真壳聚糖支架修复腹壁缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(26): 4205-4209.

Liu Hong-ze, Wei Jie.

Repair of abdominal wall defects by highly simulated chitosan scaffolds

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(26): 4205-4209.

图/表（结果） 5

2.1 高仿真壳聚糖支架扫描电镜观察结果扫描电镜结果显示，制备的高仿真壳聚糖支架纵截面可见平行排列的微管样结构，微管内镜相对均匀；横截面为蜂窝样结构，支架的内部结构与正常腹壁缺损结构十分相似，见图3。

2.2 高仿壳聚糖支架性能测定结果制备的高仿壳聚糖支架孔径45-75 μm，平均孔径为(54.31±12.1) μm，孔隙率为(85.12±2.68)%，支架密度为(0.062 3±0.023 1) g/mm³。

许旺细胞接种在支架上后24 h，扫描电镜下细胞伸展性较好，能充分伸展；接种48 h后，细胞表面存在突起部位，能较好的伸展，见图4，提示高仿壳聚糖支架具备良好的细胞相容性。

2.3 动物实验结果

2.3.1 大体观察两组大鼠均取得手术成功，对照组修复后2周缺损部位与网膜存在粘连现象，修复4周后补片部位明显增厚，与周围组织界限比较清晰，补片区域色泽一般，整合一般；实验组修复后2周后缺损部位与支架轻微粘连，修复4周后补片增厚，缺损部位未见明显隆起、红肿、感染，伤口愈合较好，见图5。

2.3.2 缺损部位粘连评分两组修复后2周粘连评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组大鼠修复后4周缺损部位粘连评分低于对照组(P < 0.05)，见表1。

2.3.3 修复4周苏木精-伊红染色结果对照组修复4周后光镜下可见毛细血管生长，并且存在大量成纤维细胞，缺损部位存在大量炎细胞浸润；实验组修复4周后可见少许炎症细胞，存在大量胶原纤维、毛细血管，肉芽组织成熟度较高，见图6。

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引言

腹壁缺损是临床上常见的疾病，其诱因相对较多，包括创伤、腹壁肿瘤及人口老龄化因素等，使得腹壁缺损、腹壁疝发生率呈现上升趋势，严重影响患者健康^[1]。传统方法以腹腔镜无张力修复为主，该手术具有微创性、修复速度较快、复发率低等特点。围术期手术的应用在各种类型胸壁缺损及腹壁疝，包括腹股沟疝、腹壁疝及切口疝等，能有效改善患者症状，提高临床治疗效果^[2-3]。目前，临床上常用的腹壁缺损及腹壁疝修补材料类型较多，包括聚丙烯、聚酯及膨化聚四氟乙烯等，但是这些材料均为不可吸收材料，从而限制了其临床应用^[4-5]。聚丙烯是腹壁缺损中常用的补片，该补片能明显刺激纤维组织增生，能与组织互相嵌入，抗张强度较高。但是，临床应用表明聚丙烯补片粗糙，修复后可引起严重的腹腔粘连，增加肠瘘发生率，不利于患者术后恢复^[6-7]。

随着医疗技术的不断发展，高仿真壳聚糖支架在组织缺损修复中开始运用，该材料以壳聚糖为基础，是一种新型的可降解材料，属于天然聚阳离子生物多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性能^[8]。国外学者以壳聚糖作为原料制备神经导管并运用于大鼠坐骨神经缺损中，修复24周后结果显示壳聚糖导管大部分被吸收，缺损部位可见大量神经纤维，能促进机体神经功能恢复^[9]。同时，随着人们对于壳聚糖神经导管研究的不断深入，将壳聚糖导管与其他材料联合使用能取得更好的修复效果。文献报道显示，壳聚糖支架联合神经营养因子修复机体缺损部位能取得良好的修复效果。由此看出，壳聚糖在机体缺损修复中具有较大的发展潜能^[10-11]。国外学者研究显示，壳聚糖能提高纤维细胞增殖、迁移速度，能促进细胞外基质的合成，能为缺损部位营造良好的愈合环境^[12]。但是，临床上以壳聚糖为材料制备高仿真壳聚糖支架的生物相容性及在大鼠腹壁缺损中的修复效果尚缺乏报道。

实验成功制备高仿真壳聚糖支架并构建大鼠腹壁缺损模型，探讨高仿真壳聚糖支架的制备方法、生物相容性及在大鼠腹壁缺损修复中的应用效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计支架制备及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年1月在青海省肿瘤医院完成。

1.3 材料

实验动物：取清洁级成年SD大鼠60只，雌雄随机，体质量200-280 g，平均(254.9±10.5) g，所选动物均由青海省肿瘤医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK(鲁)2009 0014。实验过程中对裸鼠饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则^[13]。所有实验均通过青海省肿瘤医院动物委员会批准同意。将60只成年SD大鼠随机分为实验组(n=30)和对照组(n=30)。

主要仪器和细胞、试剂：壳聚糖、聚丙烯补片(Sigma，USA)；电子冷淋仪(青海省肿瘤医院实验室提供)；倒置相差显微镜(型号：TE2000-U，德国莱卡公司)；冷冻干燥仪(Alphal-2型，Martin Chirist，Germany)；流式细胞仪(美国BD公司)；S-3400N 型扫描电镜(HITACHI，Japan)；许旺细胞(RSC 96，青海省肿瘤医院细胞库提供)。

1.4 实验方法

1.4.1 高仿壳聚糖支架的制备以壳聚糖为原材料，采用改良的梯度冷淋技术制备高仿真壳聚糖支架。采用电子天平精确程度350 mg壳聚糖，溶解于3 g/L的醋酸溶液10 mL中，真空下12 h静置，然后将壳聚糖溶液注入内径为2 mm、长10 cm的硅胶管中，采用铅丝夹住两端，密封。将注模样品沿着顺轴方向缓慢浸入深低温冷淋剂中，采用微型调速仪控制浸入速度，保持下降速度为2×10^-5 m/s，进行梯度冷淋。以相同的方法制备注模后的壳聚糖凝胶，并直接浸入液氮中冷冻。将制备获得的10 cm长的壳聚糖凝胶剪成2.0 cm每段，放入预冷的铝盘中，然后一同放入冷冻干燥仪中冷冻干燥24 h，设置冷冻参数：-60 ℃，13.33 Pa。在冷冻干燥仪真空负压下，支架内的冰晶直接升华，然后将温度调至为0 ℃，静置8 h，持续升温到22 ℃，最后解除真空负压，获得高仿真壳聚糖支架，见图1^[14-15]。

1.4.2 高仿壳聚糖支架的性能测定

细胞相容性：将许旺细胞接种在制备的高仿真壳聚糖支架中，37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱内培养48 h，然后采用扫描电镜观察许旺细胞的形态，了解高仿真壳聚糖支架的细胞相容性。

支架孔隙率：采用液体替代法测定高仿壳聚糖支架的孔隙率。以乙醇作为替换液体，将干燥后高仿壳聚糖支架(干质量Wd)浸润在无水乙醇(体积V₁)容器中，去除支架空隙内的气体，称取乙醇及支架总体积(V₂)，取出支架，称量剩余乙醇体积V₃，根据公式计算支架的孔隙率^[16-17]。孔隙率=(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100.0%；

支架密度测量：利用直尺测量制备的高仿真壳聚糖支架长度(H)，采用游标卡尺测量支架的直径(D)，电子天平称量支架称支架的质量(m)，测定支架密度。

1.4.3 大鼠腹壁缺损模型建立及分组处理取60只清洁级成年SD大鼠，采用浓度为3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后对手术部位进行消毒、铺巾。对腹壁进行脱毛处理，备皮，将腹壁正中作为手术切口，进入腹壁后分离游离的组织，包括腹膜、肌肉、筋膜组织等，做一个直径为1 cm的圆形缺损模型，建立大鼠腹壁缺损模型，见图2A。待大鼠完成腹壁止血后，对腹壁进行冲洗、清理，对照组先放置生物补片，然后将直径为1.5 cm的聚丙烯补片放入缺损部位；实验组将直径为1.5 cm的高仿真壳聚糖支架放入缺损部位，见图2B，然后采用吸收线进行缝合，使得支架与缺损部位吻合，固定，完成切口的缝合，见图2C。两组术后均给予无菌纱布覆盖，动物进行单笼饲养^[18]。

1.5 主要观察指标

高仿真壳聚糖扫描电镜观察：取制备形成的高仿真壳聚糖冷冻干燥后喷金处理，采用扫描观察支架横、纵截面的超微结构^[19]。

高仿壳聚糖支架性能测定：观察制备的高仿真壳聚糖支架的密度、孔隙率及细胞相容性。

动物实验大体观察：观察实验组与对照组大鼠修复后2，4周大体情况，每个时间点处死15只大鼠，观察切口愈合情况、生物支架与腹壁组织粘连情况。

动物实验粘连评分：采用Katada粘连评分对缺损部位粘连情况进行评分，总分4分，得分越高粘连越严重^[20-21]。

动物实验苏木精-伊红染色观察：修复4周后，取缺损部位组织，制备3 μm切片，进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察缺损部位局部病理情况，每个切片取6个视野^[22]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

从人体解剖学角度来说，腹壁在人体中是重要的承重结构，能动态反应腹腔内外的压力，保护内脏器官。但当机体由于肿瘤切除、外伤、组织感染后均会导致腹壁发生缺损或损伤，影响患者健康^[23-24]。目前，临床上对于腹壁缺损多以腹腔镜下修复手术治疗为主，该方法能在腹腔镜的放大作用下完成缺损部位的修复，具有一定的微创性，并且出血量较少、修复速度较快。同时，患者采用腹腔镜下修复时多以聚丙烯网片为主，该材料属于高分子材料，具有自我降解性能，但是该补片的使用容易增加感染、肠粘连发生率，难以达到预期的修复效果^[25]。

为了进一步获得腹壁缺损效果，实验基于材料学的发展以壳聚糖为原料，采用改良梯度冷淋技术完成高仿真壳聚糖支架的制备。实验中扫描电镜结果显示，制备的高仿真壳聚糖支架纵截面可见平行排列的微管样结构，微管内镜相对均匀；横截面为蜂窝样结构，支架的内部结构与正常腹壁缺损结构十分相似。由此看出：制备的高仿真壳聚糖支架具备良好的内部结构^[26-27]。壳聚糖属于是一种天然聚阳离子的生物多糖，能被人体自行吸收。同时，壳聚糖溶于酸性介质中，带正电荷，是目前临床使用较多的高分子材料。文献报道显示壳聚糖在人体中能发挥抗菌活性、生物黏附作用及抗癌活性等多种功能，能促进神经和缺损组织再生。此外，壳聚糖的来源相对广泛，价格低廉，能提高缺损部位的修复，并且材料植入机体后生物相容性较高，避免了免疫排斥反应^[28]。实验中制备的高仿真壳聚糖支架孔径在45-75 μm，平均孔径为(54.31±12.1) μm，孔隙率为(85.12±2.68)%，支架的密度为(0.062 3±0.023 1) g/mm³。血旺细胞接种在支架上后24 h，扫描电镜下细胞伸展性较好，能充分伸展；接种48 h后，细胞表面存在突起部位，能较好地伸展。提示高仿真壳聚糖支架具备良好的细胞相容性，有望成为腹部缺损理想的修复材料。

为了进一步验证高仿真聚丙烯支架的性能及在腹壁缺损中的应用，研究中建立大鼠腹壁缺损模型，并分别植入聚丙烯补片和高仿真壳聚糖支架，结果显示两组大鼠均取得手术成功，对照组修复后2周缺损部位与网膜存在粘连现象，修复4周后补片部位明显增厚，与周围组织界限比较清晰，补片区域色泽一般，整合一般；实验组修复后2周后缺损部位与支架轻微粘连，修复4周后补片增厚，缺损部位未见明显隆起、红肿、感染，伤口愈合较好。由此看出，高仿真聚丙烯支架在腹壁缺损中能发挥良好的效果，能促进缺损部位早期愈合，且不会引起切口感染等并发症，能降低支架植入后肠粘连评分，促进大鼠缺损部位愈合。实验中，2组大鼠修复后2周粘连评分比较差异无显著性意义 (P > 0.05)；实验组大鼠修复后4周缺损部位粘连评分低于对照组(P < 0.05)。高仿真壳聚糖支架还具有良好的成膜、可纺织性，能促进创伤愈合、抑制瘢痕增生。实验中，对照组修复4周后光镜下可见毛细血管生长，并且存在大量的成纤维细胞，缺损部位存在少量炎细胞浸润；实验组修复4周后可见少许炎症细胞，存在大量胶原纤维、毛细血管，肉芽组织成熟度较高。由此看出：制备的高仿真壳聚糖支架能促进腹壁缺损部位愈合，能降低炎症反应，提高修复效果。

综上所述，以壳聚糖作为原料，在改良梯度冷淋技术下完成高仿真壳聚糖支架的制备，其具有良好的生物相容性，将其运用于大鼠腹壁缺损中效果理想，能促进缺损部位修复，减轻炎性反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程