脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球在脊柱结核动物模型中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.016

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (26): 4192-4198.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.016

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脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球在脊柱结核动物模型中的应用

黄正辉，刘炜，王静丽

武汉市医疗救治中心结核科，湖北省武汉市 430023

收稿日期:2017-04-06 出版日期:2017-09-18 发布日期:2017-09-28
通讯作者: 刘炜，主治医师，武汉市医疗救治中心结核科，湖北省武汉市 430023
作者简介:黄正辉，男，1977年生，湖北省武汉市人，汉族，主治医师，主要从事骨结核研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30973087)；湖北省自然科学基金(2013CFB513)

Application of adipose-derived mesenchymal stem cells/sustained-release rifampin-loaded microsphere complex in an animal model of spinal tuberculosis

Huang Zheng-hui, Liu Wei, Wang Jing-li

Department of Tuberculosis of Wuhan Medical Treatment Center, Wuhan 430023, Hubei Province, China

Received:2017-04-06 Online:2017-09-18 Published:2017-09-28
Contact: Liu Wei, Department of Tuberculosis of Wuhan Medical Treatment Center, Wuhan 430023, Hubei Province, China
About author:Huang Zheng-hui, Attending physician, Department of Tuberculosis of Wuhan Medical Treatment Center, Wuhan 430023, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30973087; the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2013CFB513

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

海藻酸钠-壳聚糖微球：是具有生物黏附性且能结合和传递大分子药物的天然高分子材料，在生物医学领域具有广阔应用前景的药物载体。以壳聚糖-海藻酸钠作为药物载体的缓释给药系统可有效减少药物用量和不良反应，提高药物的生物利用度、延长药物作用时间，并具有可生物降解、不需二次手术取出、缓释抗组织纤维化和价格便宜等优点。

脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球：实验首先以壳聚糖和海藻酸钙为高分子载体，通过离子交联法制备新型利福平-壳聚糖-海藻酸钙缓释微球，再将脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球共培养复合，构建一种抗结核性骨组织工程复合体，并初步探讨其在兔脊柱结核动物模型中的治疗作用，以期为骨结核的临床治疗提高新的方法。

背景：制备一种可直接植入骨结核病灶内且在骨结核周围组织能够长期保持一定抗结核药物浓度，增强骨缺损修复的新型生物材料，成为骨结核临床研究的热点。

目的：制备脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合物，初步探讨其对兔脊柱结核模型的治疗作用。

方法：合成利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球，将其与脂肪间充质干细胞复合培养，制作抗结核性骨组织工程复合体。取40只取新西兰大白兔，制作L₆椎体结核模型，造模成功后随机分4组干预，对照组不进行任何干预；利福平组每天灌胃给予利福平；干细胞组在椎旁注射脂肪间充质干细胞，每天灌胃给予利福平；实验组在椎旁植入抗结核性骨组织工程复合体，每天灌胃给予利福平。给药8周后，通过X射线、CT初步观察病灶情况。

结果与结论：对照组L₅、L₆椎体都有明显骨质破坏，形成炎性肉芽组织，椎间隙变窄，2只出现明显后凸畸形，5只兔腰大肌肿胀，腰大肌内可见低密度暗区。利福平组兔模型中5只兔L₅和L₆椎体有中度骨质破坏，2只兔腰大肌肿胀。干细胞组兔模型中2只兔L₅和L₆椎体有中度骨质破坏，3只兔L₆椎体上部有轻度骨质破坏，3只兔腰大肌肿胀。实验组中4只兔L₆椎体上部有轻度骨质破坏，L₅、L₆椎间隙无明显改变，无腰大肌肿胀发生。结果表明，脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合物可抑制结核杆菌生长，减少椎体骨质破坏，对动物脊柱结核模型具有一定的治疗作用。

ORCID: 0000-0002-3600-6397(黄正辉)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 缓释微球, 脂肪间充质干细胞, 利福平, 兔, 脊柱结核, 骨质破坏, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: To prepare a novel biological material that can be implanted into the lesion of bone tuberculosis, keep sustained release of anti-tuberculosis drugs around bone tuberculosis tissues for a long time, and enhance the effect on bone repair has become a hot spot for clinical studies on bone tuberculosis.

OBJECTIVE: To prepare the adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs)/sustained-release rifampin-loaded microsphere complex, and to preliminarily study its effects in a rabbit model of spinal tuberculosis.

METHODS: Rifampin-chitosan-calcium alginate sustained-release microspheres were synthesized, and co-cultured with ADMSCs to prepare an anti-tuberculosis composite for bone tissue engineering. Forty New Zealand rabbits were used to make lumbar L₆ tuberculosis models. Thereafter, rat models were randomly divided into four groups and given rifampin by gavage in rifampin group, ADMSCs by paravertebral injection+rifampin by gavage in stem cell group, rifampin by gavage+implantation of the anti-tuberculosis composite material in experimental group, and no treatment in control group. The duration time of rifampin administration was 8 weeks. The anti-tuberculosis effect of the composite material was evaluated by X-ray and CT scanning observation.

RESULTS AND CONCLUSION: In the control group, obvious damage to lumbar vertebrae L₅ and L₆ was apparent; inflammatory granulation tissues formed; and the intervertebral space was narrowed. In addition, two rabbits in the control group showed obvious kyphotic deformity and five showed pasoas major swelling with low-density dark region in the psoas muscle. In the rifampin group, there were five rabbits with moderate damage of the lumbar vertebrae L₅ and L₆, and two rabbits with pasoas major swelling. In the stem cell group, there were two rabbits with moderate damage of the lumbar vertebrae L₅ and L₆, three rabbits with mild damage of the upper part of the lumbar vertebra L₆, and three rabbits with pasoas major swelling. In the experimental group, only four rabbits suffered from mild damage of the upper part of the lumbar vertebra L₆ but with no changes in the intervertebral space between the L₅ and L₆, and without pasoas major swelling. These results indicate that the composite material of ADMSCs combined with sustained-release rifampin-loaded microspheres can inhibit mycobacterial growth effectively, and reduce vertebral bone destruction, thereby giving some therapeutic actions for the animal models with spinal tuberculosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Delayed-Action Preparations, Stem Cells, Rifampin, Tuberculosis, Spinal

中图分类号:

R318

黄正辉，刘炜，王静丽. 脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球在脊柱结核动物模型中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(26): 4192-4198.

Huang Zheng-hui, Liu Wei, Wang Jing-li. Application of adipose-derived mesenchymal stem cells/sustained-release rifampin-loaded microsphere complex in an animal model of spinal tuberculosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(26): 4192-4198.

图/表（结果） 5

2.1 脂肪间充质干细胞的鉴定脂肪间充质干细胞形状为梭形或多边形，24 h基本贴壁生长，细胞培养5-7 d后细胞融合度可达80%(图1A)。脂肪间充质干细胞成骨诱导 21 d后可见矿化结节产生，茜素红染色显示矿化结节着深红色(图1B)，成脂诱导6 d后胞浆中出现脂质滴，油红O染呈红色(图1C)，成软骨诱导14 d后细胞聚集明显，逐渐形成软骨样结节，阿利新蓝染呈深蓝色(图1D)。

2.2 利福平对脂肪间充质干细胞生长及成骨活性的影响由表1，2可见，当利福平质量浓度为30 mg/L时，脂肪间充质干细胞生长增殖受到抑制，A_{490 nm}显著变小(P均< 0.05)，且成骨活性减弱，碱性磷酸酶水平相比其他3个低质量浓度明显降低(P均 < 0.05)。故后续制备脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合物时利福平质量浓度选择 20 mg/L。

2.3 利福平缓释微球制备及与脂肪间充质干细胞的复合绝大多数微球呈圆球形，表面较光滑，微球载药量为(38.98±1.65)%，包封率为(65.34±1.72)%，微球的体外释药较平稳，突释期内微球释放度仅为16.53%，42 d后体外累积释放度达到93.68%，在42 d内微球体外缓释作用明显，这说明利福平缓释微球可以在体外实现持久有效释药。脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合7 d后，脂肪间充质干细胞生长良好，圆形微球嵌于细胞间隙，不透光(图2)。

2.4 脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球在兔脊柱结核模型中的作用初探兔脊柱结核模型术后2个月出现结核病灶，如椎旁脓肿(图3A)及腰大肌脓肿(图3B)，L₅-L₆椎间盘受累，椎间隙消失且骨质受到破坏(图3C)。

给药8周后检查结果显示，对照组兔模型L₅、L₆椎体均有明显骨质破坏，形成炎性肉芽组织，椎间隙变窄，2只出现明显后凸畸形，5只兔腰大肌肿胀，腰大肌内可见低密度暗区，腰大肌内有1-5 cm的脓肿形成，脓液为淡黄色较浓稠，无明显臭味。利福平组兔模型中5只兔L₅和L₆椎体有中度骨质破坏，2只兔腰大肌肿胀。干细胞组兔模型中2只兔L₅和L₆椎体有中度骨质破坏，3只兔L6椎体上部有轻度骨质破坏，3只兔腰大肌肿胀。实验组中4只兔L₆椎体上部有轻度骨质破坏，L₅、L₆椎间隙无明显改变(图3D)，无腰大肌肿胀发生。

此外，4组兔肝、肺、脾组织未见明显异常，未见结核结节。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年8月在武汉市医疗救治中心实验室完成，实验室的生物安全等级为P2。

1.3 材料

实验动物：健康成年新西兰大白兔50只，雌雄不拘，体质量约2.5 kg；另4只健康成年新西兰大白兔用于分离脂肪间充质干细胞，实验动物购自华中科技大学大学实验动物中心，许可证：SCXK(鄂)2015-0007，动物实验遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

实验试剂：Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)；胎牛血清、DMEM培养基、间充质干细胞骨分化培养基、间充质干细胞软骨分化培养基、间充质干细胞脂肪分化培养基(Hyclone公司，美国)；青霉素、链霉素混合液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(凯基生物公司，中国)；人型结核分支杆菌标准菌株H37Rv菌株(中国生物制品研究所，中国)；CCK-8试剂盒、PBS(碧云天生物技术研究所，中国)；利福平(沈阳双鼎制药，中国)；壳聚糖、海藻酸钠、茜素红染液、油红O染液、阿利新蓝染液(Sigma，美国)；碱性磷酸酶检测试剂盒及染色液(南京建成生物公司，中国)。

实验仪器：酶标仪(Thermo Fisher公司，美国)；UV2550紫外可见分光光度计(岛津公司，日本)；Micro CT系统(Skyscan公司，比利时)；1721型电子天平(Sartorius公司，德国)；CO₂恒温孵育箱(SANYO公司，日本)；CHC-212光学显微镜、CK40倒置显微镜(OLYMPUS公司，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离与培养实验动物新西兰大白兔用3%戊巴比妥钠1 mL/kg (30 mg/kg)耳缘静脉缓慢注射麻醉，无菌条件下获取兔颈后脂肪组织，去除血管及其他组织，用含双抗的PBS溶液(10 g/L青霉素与链霉素混合液)反复漂洗3遍，剪碎成糊状，加入适量的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃消化50 min，过滤，1 000 r/min离心5 min，弃去上层脂肪及上清，沉淀用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于一次性塑料培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度细胞培养箱中培养，24 h后全量换液，此后3 d更换1次培养基。当细胞生长至约90%融合时，进行1∶2传代培养，记P0代。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的分化诱导

成骨分化诱导：取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，待细胞融合度达到50%-60%，加入间充质干细胞骨分化培养基于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养21 d，期间3 d更换培养基1次，培养结束采用0.1%茜素红染液染色6 min，观察并拍照。

成脂分化诱导：取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，待细胞融合度达到70%时，加入间充质干细胞脂肪分化培养基，于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养14 d，培养期间3 d更换培养基1次，培养结束使用油红O染色10 min，染完后再用体积分数75%乙醇脱色，观察并拍照。

成软骨分化诱导：取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，待细胞融合度达到70%，分别加入间充质干细胞软骨分化培养基于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养14 d，期间3 d更换培养基1次，培养结束使用阿利新蓝染液室温染色30 min，观察并拍照。

1.4.3 利福平对脂肪间充质干细胞生长及成骨活性的影响取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，按10³/孔接种于96孔板，24 h后更换含不同质量浓度利福平(0，10，20，30 mg/L)的培养基，连续培养12 d，期间3 d更换培养基1次，每个浓度组每2 d选6孔分别加入CCK-8溶液 10 μL，37 ℃孵育4 h，振荡均匀后使用酶标仪检测490 nm处的吸光度值，绘制生长曲线。

取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，按3.5×10³/孔接种于96孔板，24 h后更换含20 mg/L利福平的成骨分化诱导培养基，成骨诱导第4，9，14天各收集6孔细胞，按碱性磷酸酶检测试剂盒操作说明检测碱性磷酸酶的含量，以金氏单位/100 mL表示。

1.4.4 利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球的制备首先将0.35 g/L利福平与1.5 g/L海藻酸钠预先混合均匀。在室温电磁力搅拌条件下，将10 mL利福平与海藻酸钠的混合液通过恒流泵以1 mL/min的速度滴加到10 mL 0.30 g/L CaCl₂溶液中，滴加完毕后继续搅拌30 min。同法将5 mL 0.6 g/L的壳聚糖溶液(含0.1%乙酸)滴加到上述混合液中，滴加完毕后继续搅拌1 h，自发形成利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球。取纳米微球制备溶液适量稀释，滴于铜网自然干燥后以透射电镜观察微球表面形态，确定制作出的利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球大小均匀，表面形态完整，分散性较好，并进行⁶⁰Co辐射消毒。

利福平缓释微球体外释药效果检测：进行体外溶出度实验，将纳米缓释微球适量稀释，吸取利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球溶液5 mL，置入100 mL 37 ℃恒温PBS中，加酸性乙醇4 mL，旋涡振荡5 min，低温3 000 r/min离心 20 min，取上清液1 mL，用荧光分光光度仪测定其荧光强度，计算标本中利福平含量。

1.4.5 脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，调整细胞浓度达到1×10¹⁰ L^-1。向6孔板中每孔加入1 mL DMEM、3 mg利福平缓释微球和1 mL细胞悬液(1×10¹⁰ L^-1)，再加入3 mL培养基。培养7 d后，取部分材料于显微镜下观察微球表面细胞生长及两者复合情况，其他用于体内实验。

1.4.6 兔脊柱结核模型的构建首先用罗氏培养基将人型结核分支杆菌标准菌株H37Rv菌株进行扩增培养二三周，取生长良好的菌落，研磨后配成5 g/L的均匀菌悬液(10⁷ CFU/mL)。将50只新西兰大白兔左侧腹部脱毛备皮，右侧卧固定在手术板上。用速眠新0.5 mL/kg和氯胺酮 0.1 mL/kg麻醉。常规消毒后取左侧腹膜外入路显露L₅、L₆椎体，于L₆椎体上部近椎间盘处从左前方向右后方钻 0.3 cm×0.8 cm的骨孔，骨孔道止血后填入明胶海绵，注射器在明胶海绵上缓慢浸注1×10⁷ CFU/mL结核菌悬液 0.2 mL，丝线间断关闭切口，建立兔脊柱结核模型后将兔隔离分笼饲养。术后2个月通过影像学分析，可见椎体破坏、椎间隙变窄、椎体旁脓肿者即为造模成功，排除内脏结核及活动性肺结核动物。

动物模型分组及给药方式：将40只造模成功兔随机分为4组，每组10只，对照组不进行任何处理；其余3组称质量后，将兔左侧腹部脱毛备皮，右侧卧固定在手术板上，用速眠新5 mL/kg+氯胺酮0.1 mL/kg麻醉，取左侧腹膜外腰大肌后侧入路显露L_5、6椎体，于L₅椎体下部，L₆椎体上部左侧开出1.0 cm×0.3 cm×0.5 cm的骨槽，利福平组、干细胞组、实验组局部给药于骨槽内，多出骨槽的用椎旁肌覆盖。利福平组每只兔灌喂利福平12 mg/(kg•d)；干细胞组每只兔灌喂利福平12 mg/(kg•d)，椎旁注射2.5×10⁹ L^-1脂肪间充质干细胞0.1 mL/kg；实验组每只兔椎旁注射脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合物0.1 mL/kg，同时灌喂利福平12 mg/(kg•d)。

1.5 主要观察指标定期观察造模动物活动及进食情况，伤口愈合及有无红肿与感染等发生。给药8周后行X射线片、CT检查，了解病灶进展。各组于给药8周后处死兔模型，取L₆椎体开槽给药部分及L₆左侧椎旁腰大肌组织进行组织学观察。

1.6 统计学分析数据均以x(_)±s表示，应用SPSS 20.0统计软件分析，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；两组独立样本比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

脊柱结核的发病率居全身骨关节结核首位^[8-9]。脊柱结核临床治疗面临复发、耐药病例不断出现、修复不良、病灶不愈等问题，这些问题主要是因为病灶局部抗结核药物浓度达不到杀菌浓度或药物浓度持续时间不足所造成的^[10-11]。制备一种可直接植入骨结核病灶内的且具有在骨结核周围组织能够长期保持一定抗结核药物浓度，增强骨缺损修复的新型生物材料，成为骨结核临床研究的热点^[12-13]。如梁求真等^[14]基于兔脂肪间充质干细胞、利福喷丁聚乳酸微球、同种异体部分脱钙骨支架，构建兔脂肪间充质干细胞-利福喷丁微球-骨支架三维体外抗结核性骨组织工程复合体，研究发现该复合体具有持续缓慢释放药物的性质，且该释药浓度不影响兔脂肪间充质干细胞的增殖及成骨活性。目前，制备抗结核性骨组织工程支架材料的文献报道较多，但还存在一些不足之处，如骨缺损恢复慢；材料吸收降解和成骨填充作用不能达到很好匹配；抗结核药物成分单一，药物释放不稳定；浓度过大影响成骨作用，浓度过小不能杀灭结核杆菌；以及在结核动物模型进行的相关验证实验较少^[15]。实验制备脂肪间充质干细胞与利福平-壳聚糖-海藻酸钠缓释微球复合物，并初步探讨其对兔脊柱结核模型的治疗作用，以期达到促进成骨及药物缓释的双重效应。

海藻酸钠-壳聚糖微球是具有生物黏附性且能结合和传递大分子药物的天然高分子材料，且在生物医学领域具有广阔应用前景的药物载体^[16-17]。以壳聚糖-海藻酸钠作为药物载体的缓释给药系统可有效减少药物用量和不良反应，可提高药物的生物利用度、延长药物作用时间，并具有可生物降解、不需二次手术取出、缓释抗组织纤维化和价格便宜等优点^[18-19]。赛佳明等^[20]制备骨形态发生蛋白2-海藻酸钠-壳聚糖微球，并研究其对兔桡骨骨折愈合的影响，结果发现骨形态发生蛋白2-海藻酸钠-壳聚糖微球具有良好的缓释效果，局部植入能促进骨折修复愈合。李德超等^[21-22]证实壳聚糖-海藻酸钠复合材料成骨细胞生物相容性良好，对新西兰大白兔建立的双侧下颌骨种植模型骨结合具有促进作用。实验使用海藻酸钠与壳聚糖作为利福平药物载体，结果表明具有良好的组织相容性及药物缓释性能，释放周期可达1个多月，释药浓度始终低于临界浓度 20 mg/L，但明显高于最低抑菌浓度。利福平对结核菌的最低抑菌浓度为0.025-0.05 mg/L，一般最低杀菌浓度为最低抑菌浓度的10倍。

实验造模时选用兔L₆椎体上部近椎间盘处钻孔，骨孔道止血后填入明胶海绵，在明胶海绵上浸注结核菌液，增加结核菌在局部的浓度和作用时间。在给药8周后予以影像学检查，结果显示对照组兔模型L₅、L₆椎体骨质破坏程度及数量、腰大肌肿胀均明显多于其他3组，且实验组无腰大肌肿胀发生。与利福平组、干细胞组比较，实验组兔模型骨质破坏程度减轻，L₅、L₆椎间隙无明显改变，以上结果说明实验组给予的灌喂利福平+椎旁给脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球治疗方案，有效控制了脊柱结核兔模型的结核病情发展，明显减轻了结核杆菌对兔脊柱椎体的破坏。研究表明利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体，使其负载三联抗结核药异烟肼、利福平和吡嗪酰胺制备出复合缓释抗结核药涂层材料，并以自体髂骨作为黏附支架，在兔脊柱结核病灶清除后将其植入骨缺损部位，结果显示抗结核药缓释涂层材料在兔脊柱结核病灶局部可实现三药同时长程、高效、平缓释药^[23-37]。席焱海等^[38]利用静电纺丝等技术制备新型搭载异烟肼、利福平、链霉素三联抗结核药物阶梯缓释纳米人工骨，通过修复兔股骨远端骨缺损模型，发现复合材料有很好的骨传导性和骨再生能力，复合三联抗结核药物后也不影响复合材料的体内成骨能力。

脂肪间充质干细胞具有来源丰富、易于取材、多方向分化潜能(成骨、成软骨、成脂等)、细胞免疫原性低及免疫抑制调节作用等功能，在特定诱导条件下能向软骨细胞分化，在骨组织修复过程中发挥一定的作用^[39-41]。与利福平组组比较，干细胞组兔模型骨质破坏减弱，脂肪间充质干细胞可能在此过程中发挥了一定的骨修复作用，但需要课题组接下来更进一步研究证实。孙玺淳等^[42]研究发现，脂肪间充质干细胞复合纤维蛋白胶加关节腔注射透明质酸钠对早期膝关节骨性关节炎具有治疗效果，蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达均较对照组升高，基质金属蛋白酶3表达较对照组显著下降。另外，对照组兔腰大肌内有1-5 cm的脓肿形成，还可见炎性肉芽组织形成等阳性改变，表明给予抗结核药物是当前结核病治疗的首选方式。有研究使用缓释双药物载体(利福平+异烟肼+聚乳酸-羟基乙酸共聚物)植入兔股骨转子间骨缺损部位可见筋膜、肌纤维之间出现少量中性粒细胞浸润，59 d后肌肉组织中性粒细胞明显减少，X射线平片显示骨缺损明显缩小，说明该载体能够长时间保持骨结核周围组织中一定的药物浓度，弥补血中药物浓度不足，有望在骨结核手术治疗中提供一种新型的双药物缓释载体。

实验尚存在一定的局限性，如对脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合体材料在动物结核模型中的作用不够全面深入。未来将对该复合材料的组织药物分布特征、生物相容性、脂肪间充质干细胞体内成骨活性、抗结核性能及骨质修复性能等进行进一步探讨。

综上所述，实验制备了脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合物，此复合物既可通过控释化疗增加椎旁局部药物浓度抑制结核杆菌生长，也可能通过干细胞的修复作用减少椎体骨质破坏，对动物脊柱结核模型具有一定的治疗作用。脂肪间充质干细胞与利福平缓释微球复合体的组织工程骨移植为结核病灶清除术后骨缺损的修复提供全新思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脂肪间充质干细胞复合利福平缓释微球在脊柱结核动物模型中的应用

Application of adipose-derived mesenchymal stem cells/sustained-release rifampin-loaded microsphere complex in an animal model of spinal tuberculosis

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