氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对人牙周膜细胞增殖、凋亡和骨诱导活性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.26.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

氧化锆氧化铝陶瓷复合材料：是近年来新出现的一类修复材料，多项研究显示氧化锆氧化铝陶瓷复合材料已被初步应用于组织工程研究中。相比于传统材料，氧化锆氧化铝陶瓷复合材料有较高的机械强度及韧性。

碱性磷酸酶：作为机体一种重要酶类，广泛分布于体内几乎所有重要器官，其活性可反映相应细胞向成骨方向转化的趋势，因此，检测牙周膜细胞分泌碱性磷酸酶活性具有重要意义。实验将氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞直接接触培养，以更好的对牙周膜细胞成骨分化能力进行检测。

背景：氧化锆氧化铝陶瓷复合材料具有优良的抗腐蚀性、较高的强度和韧性，具有广泛的应用前景。

目的：探究氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对人牙周膜细胞增殖、凋亡和骨诱导活性的影响。

方法：将第3-5代人牙周膜细胞分2组培养，对照组细胞常规培养，实验组与氧化锆氧化铝陶瓷复合材料共培养，培养1-5 d，MTT法检测细胞增殖，Tunel法检测细胞凋亡，免疫组织化学法检测细胞Ⅰ型胶原蛋白表达，碱性磷酸酶染色检测细胞成骨活性。

结果与结论：培养1-5 d内，两组细胞增殖、凋亡、碱性磷酸酶活性比较差异均无显著性意义；培养5 d时，两组Ⅰ型胶原表达比较差异无显著性意义；结果表明，氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对牙周膜细胞增殖、凋亡和骨诱导活性均无影响。

ORCID: 0000-0002-2702-004X(王佳宁)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 氧化锆氧化铝陶瓷复合材料, 牙周膜细胞, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: Zirconia/alumina ceramic composite with excellent corrosion resistance, high strength and toughness has wide application prospect.

OBJECTIVE: To investigate the effect of zirconia/alumina ceramic composite on proliferation, apoptosis and bone induction activity of human periodontal ligament cells.

METHODS: Human periodontal ligament cells at passages 3-5 were cultured routinely as control group and co-cultured with zirconia/alumina ceramic composite as experimental group. After 1-5 days of culture, MTT, TUNEL, immunohistochemical detection, and alkaline phosphatase staining were used to detect cell proliferation, apoptosis, type I collagen expression and osteogenic activity, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Within 1-5 days of culture, there were no differences in cell proliferation, apoptosis and alkaline phosphatase activity between the two groups. At 5 days of culture, the type I collagen expression showed no difference between the two groups. Taken together, the zirconia/alumina ceramic composite has no effect on the proliferation, apoptosis and bone induction activity of human periodontal ligament cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Aluminum Oxide, Dental Porcelain, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王佳宁. 氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对人牙周膜细胞增殖、凋亡和骨诱导活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(26): 4155-4159.

Wang Jia-ning.

Effects of zirconia/alumina ceramic composite on proliferation, apoptosis and bone induction activity of human periodontal ligament cells

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(26): 4155-4159.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性细胞实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至6月在白城医学高等专科学校完成。

1.3 材料因正畸拔出的废弃牙体组织，供者年龄25-45岁，均为无炎症、无龋坏的正常牙齿；氧化锆氧化铝陶瓷复合材料购买于四川大学生物材料工程研究中心，直径为14 mm、厚度5 mm；α-MEM细胞培养基和胎牛血清均购买于美国Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗、胰酶、碱性磷酸酶活性检测试剂盒、CCK-8细胞增殖试剂盒购买于碧云天公司。

1.4 实验方法

人牙周膜细胞的分离与培养：将所获取的废弃牙体先用生理盐水清洗，然后放入含有10%双抗的α-MEM培养基中反复清洗，刮下根中1/3的牙周膜组织，剪成0.5 mm× 0.5 mm×0.5 mm左右的小块，以5 mm左右的间隔将组织块接种于25 cm²培养瓶瓶底，翻转培养瓶，加入含有体积分数为10%胎牛血清和10%双抗的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱孵育，待组织块贴壁，再翻转培养瓶培养，每2 d或3 d换液1次，到组织块周围爬出的细胞达到对数生长期时，用胰酶消化并传代培养。后续实验均用第3-5代人牙周膜细胞。

人牙周膜细胞的鉴定：取第3代人牙周膜细胞，制成2×10⁵/cm²的细胞悬液并制备细胞爬片，按常规SP免疫组织化学染色法进行抗角蛋白和抗波形蛋白染色，光镜下观察胞质着色情况，以PBS代替一抗作为阴性对照组。

氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞共培养：实验组将氧化锆氧化铝陶瓷复合材料经高压蒸汽消毒灭菌处理，加入24孔板底层，加入含有体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，过夜平衡pH值，去除培养基，自然风干，加入生长状态良好的人牙周膜细胞悬液，细胞数量为(3.0-4.0)×10⁵，置于培养箱内常规培养，对照组直接将细胞接种于24孔板。

1.5 主要观察指标

CCK-8实验检测细胞增殖情况：于共培养第1，2，3，4，5天，在各孔中加入CCK-8试剂，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内孵育2 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长的吸光度值。

Tunel法检测细胞凋亡情况：于共培养第1，2，3，4，5天进行细胞爬片，吸弃培养液，自然晾干后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，经新鲜配制体积分数3%H₂O₂室温处理，按Tunel试剂盒步骤说明操作，DAB显色，苏木精轻度复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

碱性磷酸酶活性检测：于共培养第1，2，3，4，5天，按照碱性磷酸酶试剂盒所示步骤，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定吸光度值，根据吸光度值评估碱性磷酸酶活性。

免疫组织化学实验检测Ⅰ型胶原表达：共培养第5天，胰酶消化两组细胞，贴壁于玻片上，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，体积分数为20%胎牛血清蛋白封闭20 min，PBS清洗1次，加入Ⅰ型胶原抗体4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，加入生物素化兔抗大鼠IgG二抗，室温孵育1 h，DAB显色，PBS清洗3次，苏木精复染1 min，1%盐酸乙醇分化1 min，中性树脂封固，光学显微镜下观察、拍照。

1.6 统计学分析采用GRAPH PAD 6.0统计分析软件，独立样本t 检验用于均值比较。P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

牙周膜细胞被认为是牙周组织稳定和修复再生的细胞学基础，以其独特的性能和与牙周组织密切相关的特点，使之成为牙周组织工程研究的热点问题。牙周膜细胞的培养主要有酶消化法和组织块法，以组织块法应用较广泛，Amold等^[26]首先系统研究了组织块法培养牙周膜细胞的方法和生长持点，随后这种方法进行了不断完善和改进。此次实验采用组织块法培养牙周膜细胞，最初5代内细胞在3-5 d即可长满培养瓶底，生长状态较活跃，可为实验提供充足的细胞。牙周膜细胞经稳定传代后为梭形成纤维样细胞，免疫组织化学实验显示细胞抗角蛋白染色阴性，抗波形丝蛋白染色阳性，说明培养的细胞为来自中胚层的成纤维细胞。

全瓷牙体修复材料因其色泽逼真的优势及良好的生物相容性，受到越来越多临床的青睐，但机械强度不够和加工工艺复杂的缺陷是限制其广泛应用的主要因素。为提高此类材料机械强度与韧性，多项研究聚焦此方向已成为口腔全瓷修复领域的研究重点。

氧化锆氧化铝陶瓷复合材料是近年来新出现的一类修复材料，其具有较高机械强度与韧性。然而，氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞间的生物相容性目前报道较少。此次研究从细胞增殖、凋亡、碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原表达这4个方面探讨氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞的生物相容性，以期为口腔正畸修复提供新型理论依据。与MTT法相比，CCK-8法具有操作更简便省时，重复性好，灵敏度更高等优点^[21-31]。此次研究采用CCK-8法检测氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对人牙周膜细胞增殖的影响。实验结果显示氧化锆氧化铝陶瓷复合材料不影响人牙周膜细胞的正常增殖，且随着培养时间的延长，细胞增殖呈上升趋势。细胞凋亡检测结果显示，人牙周膜细胞与氧化锆氧化铝陶瓷复合材料复合培养后细胞未出现明显凋亡。

碱性磷酸酶作为机体一种重要酶类，广泛分布于体内几乎所有重要器官，其活性可反映相应细胞向成骨方向转化的趋势^[32-36]，因此，检测牙周膜细胞分泌碱性磷酸酶活性具有重要意义。此次实验将氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞直接接触培养，以更好地对牙周膜细胞成骨分化能力进行检测。实验结果显示氧化锆氧化铝陶瓷复合材料对人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性水平无影响。胶原是构成牙周膜的主要成分，牙齿靠牙周膜固定于牙槽窝中，这对于维持牙齿的正常功能有重要意义，构成牙周膜的胶原成分包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ型胶原，其中主要成分为Ⅰ型胶原。Mergenhagen等^[37-38]发现在牙周膜细胞形成矿化结节前Ⅰ型胶原mRNA转录水平明显增加，因此他们认为Ⅰ型胶原的合成、分泌、沉积可能是牙周膜细胞矿化活性所必需的。实验结果显示，氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞共培养后的Ⅰ型胶原表达与对照组比较差异无显著性意义。

综上所述，从细胞增殖、凋亡、碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原表达这4个方面来看，氧化锆氧化铝陶瓷复合材料与牙周膜细胞具有良好的生物相容性，为进一步的应用研究提供了理论依据。

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