自体红骨髓一期移植治疗股骨粉碎型骨折

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 4013-4019.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.013

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自体红骨髓一期移植治疗股骨粉碎型骨折

潘琳琳¹，吴昊¹，刘广辉¹，赵振群²

内蒙古医科大学第二附属医院，¹创伤骨科，²小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

修回日期:2017-08-07 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 赵振群，硕士，主治医师，内蒙古医科大学第二附属医院小儿骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；共同通讯作者：刘广辉，主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院创伤骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:潘琳琳，女，1983年生，吉林省怀德县人，汉族，内蒙古医科大学第二附属医院在读硕士，主要从事骨科方面的研究。共同第一作者：吴昊，男，汉族，1983年生，内蒙古自治区包头市人，博士，主治医师，主要从事骨科方面的研究。
基金资助:
内蒙古医科大学第二附属医院院基金(2015YJJ24)

One-stage treatment with autologous red bone marrow transplantation for femoral comminuted fracture

Pan Lin-lin¹, Wu Hao¹, Liu Guang-hui¹, Zhao Zhen-qun²

¹Department of Traumatic Orthopedics, ²Department of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2017-08-07 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Zhao Zhen-qun, Master, Attending physician, Department of Pediatric Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; Liu Guang-hui, Chief physician, Department of Traumatic Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Pan Lin-lin, Studying for master’s degree, Department of Traumatic Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China； Wu Hao, M.D., Attending physician, Department of Traumatic Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the Foundation of the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, No. 2015YJJ24

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨不连：指经影像学检查(通常为X射线检查)以及临床检查，骨折已停止愈合，并且估计不会再连接。骨不连的原因主要有局部因素、全身因素、手术以及感染等几个方面，对于骨不连的治疗现在基本上依然使用断端刷新植骨手术方案治疗，根据植入骨成分不同，可将其分为自体骨移植、异体骨植骨或人工合成骨替代物移植等。其中多数的替代材料以骨髓间充质干细胞及生长因子为细胞学基础。
自体红骨髓移植：是基于骨髓间充质干细胞及生长因子基础上的一种微创移植技术。扁骨内的红骨髓富含具有成骨潜力的多种生长因子，骨髓间充质干细胞以及未分化间叶细胞，故成骨能力较强。另外髂骨处抽取骨髓会诱发局部和全身的成骨反应。与骨移植相比较，自体红骨髓移植有明显的优势。且移植的自体红骨髓在周围组织未能建立周围营养的情况下便可以迅速参与到骨折组织的修复与重建，更不存在免疫排斥及伦理学方面的问题。

摘要
背景：骨折愈合是否需要一期红骨髓移植，是否植入间充质干细胞？当股骨粉碎性骨折时进行闭式复位髓内钉内固定术，同期进行自体红骨髓一期移植是否可促进骨折处成骨的作用，尚处于研究阶段。
目的：探讨采取闭式复位髓内钉内固定方法，一期治疗同时给予自体红骨髓移植对骨折愈合的影响。
方法：选择健康新西兰兔20只，麻醉后以30 cm高度质量为5 kg重锤自由下落的做功条件制作兔股骨粉碎型骨折模型。给予2.0 mm直径克氏针髓内固定系统模仿股骨髓内钉内固定术对其进行固定。将兔股骨粉碎性骨折内固定造模成功的右侧股骨定义为骨折内固定组，将其左股骨定义为红骨髓移植组。红骨髓移植组将提取的1 mL自体红骨髓注射于骨折处。于造模后第14，28天分批处死10只兔，测量X射线片上骨折周围骨痂最厚处骨痂厚度；苏木精-伊红染色后光镜观察2组骨折处组织切片中软骨细胞数量及骨小梁相对面积。
结果与结论：①骨折后14 d，骨折内固定组较红骨髓移植组骨折周围骨痂生成厚度明显减小(P < 0.01)，差异有显著性意义；②骨折后14 d，红骨髓移植组骨折处软骨细胞生成数量大于骨折内固定组(P < 0.01)，骨折愈合速度快于骨折内固定组；③骨折后28 d，骨折内固定组较红骨髓移植组骨折处骨小梁相对面积明显缩小(P < 0.01)；④结果提示，红骨髓移植对于闭式复位髓内钉内固定修复兔股骨干粉碎型骨折的愈合具有促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8292-9950(潘琳琳)

关键词: 干细胞, 移植, 自体红骨髓, 股骨干, 粉碎型骨折, 一期移植, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Whether one-stage bone healing with red bone marrow or mesenchymal stem cell transplantation is needed? Whether closed reduction with intramedullary interlocking nailing combined with autologous red bone marrow transplantation can promote osteogenesis in the one-stage treatment of femoral comminuted fracture still remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the effects of closed reduction with intramedullary interlocking nailing and one-stage treatment with autologous red bone marrow transplantation on fracture healing.
METHODS: Twenty healthy New Zealand rabbits were selected and anesthetized, and then the models of femoral comminuted fracture were established at the hinder limbs after throwing a 5 kg of hammer from 30 cm height. All rabbits underwent intramedullary fixation using Kirschner wire (diameter: 2 mm); the right limbs served as control groups, and the left limbs as transplantation group, subjected to the injection of autologous red bone marrow (1 mL) into the fracture region. Then the rabbits were respectively killed at 14, and 28 days after modeling, the thickness of thickest callus was measured on X-ray films, and the number of chondrocytes and relative area of bone trabecula in the fracture region were observed through hematoxylin-eosin staining under light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The thickness of callus formation in the control group was significantly less than that in the transplantation group at 14 days after modeling (P < 0.01). (2) The number of chondrocytes in the transplantation group was significantly more than that in the control group at 14 days after modeling (P < 0.01), and the fracture healing in the transplantation group was faster that in the control group. (3) Compared with the transplantation group, the relative area bone trabecula in the fracture region in the control group was significantly reduced at 28 days after modeling (P < 0.01). (4) These finding indicate that red bone marrow transplantation promotes fracture healing in the intramedullary fixation for femoral comminuted fracture in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Femoral Fractures, Models, Animal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

潘琳琳，吴昊，刘广辉，赵振群. 自体红骨髓一期移植治疗股骨粉碎型骨折[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 4013-4019.

Pan Lin-lin, Wu Hao, Liu Guang-hui, Zhao Zhen-qun. One-stage treatment with autologous red bone marrow transplantation for femoral comminuted fracture[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 4013-4019.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 纳入健康新西兰兔20只，将兔股骨粉碎性骨折内固定造模成功的右侧股骨定义为骨折内固定组，将其左股骨定义为红骨髓移植组。全部进入结果分析，无脱失。

2.2 骨折周围骨痂比较 兔股骨骨折髓内钉内固定造模后，对2组兔骨折后及骨折2周时进行X射线检查(图1)，即应用游标卡尺(精确度0.02 mm)测量X射线片上骨折周围骨痂最厚处骨痂厚度，并以影像检查标尺为换算标准，进行计算对应最宽处骨痂厚度，结果显示，骨折内固定组于术后14 d较红骨髓移植组骨折周围骨痂生成厚度明显减小(P < 0.01)，差异有显著性意义，即红骨髓移植组骨折愈合速度快于骨折内固定组，见表1。

2.3 苏木精-伊红染色组织学观察

2.3.1 骨折14 d骨折处组织学变化及软骨细胞生成情况 在骨折内固定组，骨折14 d的组织标本中，200倍镜下见局部无菌性炎症反应(图2A)，骨髓腔内出血形成血肿(图2B)，可见新生毛细血管，进而形成肉芽组织，部分标本可见纤维组织(图2C)；400倍镜下见纤维组织中见少量幼小软骨细胞生成。骨折内固定组骨折14 d皆属于处于血肿激化演进期。

在红骨髓移植组，骨折14 d的组织标本中，200倍镜下继续可见纤维组织，纤维组织中较多软骨细胞形成(图2D，E)。红骨髓移植组骨折14 d组正处于血肿激化演进期向原始骨痂形成期发展阶段。

光镜观察2组骨折14 d骨折处组织切片中软骨细胞数量，计算对应时间点2组骨折处组织切片的软骨细胞浓度，依据前述Pareek的计数方法进行^[6]，即每张切片的软骨细胞浓度=5个高倍镜视野(×400)下的软骨细胞数目总和/5。结果显示，骨折内固定组于术后14 d较红骨髓移植组骨折处软骨细胞生成浓度明显稀少(P < 0.01)，差异有显著性意义，即红骨髓移植组骨折处软骨细胞生成数量大于骨折内固定组，骨折愈合速度快于骨折内固定组(见表1)。

2.3.2 骨折28 d骨折处组织学变化及骨小梁生成情况 在骨折内固定组，骨折28 d的组织标本中，400倍镜下见骨内外膜可见成骨细胞(图3A)，骨髓腔内的纤维组织及软骨细胞(图3B)，可见纤维组织及软骨组织演进(图3C)。骨折内固定组28 d组皆属于处于原始骨痂形成期初期。

在红骨髓移植组，骨折28 d组织的标本中，400倍镜下可见不同成熟程度的骨小梁排列成网梁状(图3D)，与周围纤维软组织相连(图3E)，软骨细胞增生钙化而骨化——软骨内化骨(图3F)。

随着软骨细胞钙化成骨，钙化点连接成网状，形成骨小梁，通过骨组织形态计量学分析，镜下观察组织切片，每例均检测新生骨的3个截面，取平均值用于数据分析。测定骨小梁相对面积，指骨小梁(包括矿化骨及类骨质)占全部松质骨(包括骨小梁及髓腔)的面积百分比，属骨量静态参数。结果显示，术后28 d骨折内固定组较红骨髓移植组骨折处骨小梁相对面积明显缩小(P < 0.01)，差异有显著性意义，即红骨髓移植组骨折处骨小梁生成较多，相对面积大于骨折内固定组，骨折愈合速度快于骨折内固定组，见表2。

参考文献

[1] 童培建,厉驹,瞿杭波,等.经皮自体骨髓间充质干细胞移植治疗四肢骨折骨不连[J].中华创伤杂志,2007,23(7):499-501.

[2] 贺永祥,谢斌.金属植入物内固定治疗四肢骨折后的骨不连临床分析[J].吉林医学,2014,35(2):326-327.

[3] 褚秀成,成帅,燕树义.干细胞移植修复骨折骨不连的效果评价[J].中国组织工程研究,2015,19(19):3112-3116.

[4] 卢永.更换髓内钉和保留髓内钉、附加侧板治疗股骨干骨折髓内钉固定术后非感染性骨不连的疗效[J].中国医学工程,2015, 23(3):86-87.

[5] 李曙光,王志文,袁强,等.可控性骨折模型早期内分泌改变的对照研究[J].第四军医大学学报,2005,26(16):1519.

[6] Gallagher KA, Liu ZJ, Xiao M, et al. Diabetic impairments in NO-mediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha. Clin Invest. 2007;117(5):1249-1259.

[7] 殷俊辉,高悠水,张长青.骨髓干细胞治疗骨不连研究进展[J].国际骨科学杂志,2011,32(2): 111-112.

[8] Kawaji H, Uematsu T, Oba R, et al.Treatment for Trochanteric Fracture of the Femur with Short Femoral Nail: A Comparison between the Asian Intramedullary Hip Screw (IMHS) and the Conventional IMHS.J Nippon Med Sch.2016;83 (3):113-117.

[9] 沈强,黄诗博,朱建国.自体骨髓浓缩干细胞在治疗股骨干骨折中的应用[J].中国民康医学,2011,23(12):1460-1477.

[10] Herberg S, Kondrikova G, Hussein KA,et al.Mesenchymal stem cell expression of stromal cell-derived factor-1β augments bone formation in a model of local regenerative therapy.J Orthop Res.2015;33(2):174-184.

[11] Emara KM, Diab RA, Emara AK. Recent biological trends in management of fracture non-union.World J Orthop. 2015; 6(8):623-628.

[12] Dimitriou R, Tsiridis E, Giannoudis PV. Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury. 2005;36(12): 1392-1404.

[13] Tawonsawatruk T, Kelly M, Simpson H.Evaluation of native mesenchymal stem cells from bone marrow and local tissue in an atrophic nonunion model.Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(6):524-532.

[14] 邵擎东,李宇飞,许天明,等.自体红骨髓移植治疗鼠胫骨骨不连[J]. 中华实验外科杂志,2015,32(6):1375-1377.

[15] 刘俊宾,亓向同.ECM修复兔桡骨缺损的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2007,15(23):1818-1821.

[16] Ozeki N, Jethanandani P, Nakamura H,et al. Modulation of satellite cell adhesion and motility following BMP2-induced differentiation to osteoblast lineage. Bio-chem Biophys Res Commun.2007; 353(1):54-59.

[17] Tsuji K, Bandyopadhyay A, Harfe BD, et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 2006;38(12): 1424-1429.

[18] Xiong DH, Shen H, Zhao LJ, et al.Robust and comprehensive analysis of 20 osteoporosis candidategenes by very high-density single-nucleotide polymorphism screen among 405 white nuclear families identified significant associationand gene-gene interaction. J Bone Miner Res. 2006;21(11):1678-1695.

[19] Edgar CM, Chakravarthy V, Barnes G, et al. Autogenous regulation of a network of bone morphogenetic proteins (BMPs) mediates the osteogenic differentiation in murine marrow stromal cells. Bone .2007;40(5):1389-1398.

[20] Hewitt J, Lu X, Gilbert L, et al. The muscle transcri ption factor MyoD promotes osteoblast differentiation by stimulation of the Osterix promoter.Endocrinology. 2008; 149(7): 3698-3707.

[21] Yu PJ, Ferrari G, G alloway AC, et al. Basic fibroblast growth factor(FGF-2): the highmolecular weight forms come of age. J Cell Biochem.2007;100(5):1100-1108.

[22] Jackson RA, Nurcombe V, Cool SM. Coordinated fibroblast growth factor and heparan sulfate regulation of osteogenesis. Gene. 2006;379(1):79-91.

[23] Granchi D, Ochoa G, Leonardi E, et al.Gene expression patterns related to osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells during ex vivo expansion.Tissue Eng Part C Methods. 2010;16(3):511-524.

[24] Kratchmarova I, Blagoev B, Haack-Sorensen M, et al. Mechanism of divergent growth factor effects in mesenchymal stem cell differentiation. Science.2005;308(5727):1472-1477.

[25] Yamashima T,Yoshimura K,Morita O,et al. Histological study of bone regenera- tion using vascular endothelial growth factor on rat mandibular bone defect.Nihon Hotet su Shika Gakkai Zasshi.2005;49 (5):726-735.

[26] Zhou B, Han ZC, Poon MC, et al. Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) transfected with stromal derived factor1(SDF-1) for therapeutic neovascularization: enhancement of cell re- cruit ment and entrapment. Med Hypotheses.2007; 68(6): 1268-1271.

[27] 雨田,张伯勋,卢氏璧,等.经皮自体骨髓移植治疗骨折不愈合[J].中华骨科杂志,1999,19(12):709-711.

[28] 张远成,刘国辉,宓士军,等.应用浓缩骨髓干细胞技术治疗骨折不愈合[J].中国现代医学杂志,2008,18(16):2418-2419.

[29] 袁进国,于明克,周志玲,等.经皮自体骨髓干细胞移植治疗骨不连的临床研究[J].中国康复理论与实践,2007,13(7):661-662.

引言

随着社会的发展，高能量交通损伤及生产伤所致的下肢长骨粉碎型骨折发生率日益增长，已成为创伤专业常见病、多发病。而下肢长骨粉碎型骨折一直以来因其愈合缓慢、骨不连发生概率较大困扰着临床医生。自二战期间Kuntscher发明了髓内钉后，下肢长骨骨折的患者生存率及预后情况逐年的得到了改善。随着髓内钉不断改进和发展，闭式复位髓内钉内固定术已成为治疗下肢骨粉碎型骨折的主要方法。髓内钉内固定恢复骨干长度、防止折断旋转、呈角，达到以二期愈合的方式治疗下肢长骨粉碎型骨折的目的。如骨折伴随出现骨缺损及碎骨丢失等情况发生时，推荐同时一期使用自体松质骨移植治疗；但是，闭式复位髓内钉内固定技术治疗粉碎性骨折，由于以上操作均为间接复位技术和闭式操作，无法使用常规自体松质骨移植治疗，手术时无法对骨折断端进行自体骨或异体骨移植，对于许多粉碎型骨折患者，治疗过程依然较长，不能早期负重，严重影响患者的康复。目前髓内钉治疗下肢长骨骨折的平均愈合时间为5.6个月，但是当骨折粉碎程度严重或伴有骨缺损及碎骨丢失时，骨折愈合的时间往往要达到12-18个月，有时甚至更长，严重的影响着患者的生活。

骨折延迟愈合是指在平均愈合时间内骨折未能愈合，通常3-6个月；骨不连则指经影像学检查(通常为X射线检查)以及临床检查，骨折已停止愈合，并且估计不会再连接^[1]。骨折处并发骨不连的发生率可高达5%-20%。骨不连的原因主要有局部因素、全身因素、手术以及感染等几个方面^[2]，对于骨不连的治疗现在基本上依然使用断端刷新植骨手术方案治疗，根据植入骨成分不同，可将其分为自体骨移植、异体骨植骨或人工合成骨替代物移植等。其中多数的替代材料以骨髓间充质干细胞及生长因子为细胞学基础。自体红骨髓移植也是基于骨髓间充质干细胞及生长因子基础上的一种微创的移植技术。Friedenstein等在 1968年通过对全骨髓标本培养中最早的发现骨髓间充质干细胞。扁骨内的红骨髓富含具有成骨潜力的多种生长因子，骨髓间充质干细胞以及未分化间叶细胞，故成骨能力较强。另外髂骨处抽取骨髓会诱发局部和全身的成骨反应。与骨移植相比较，自体红骨髓移植有明显的优势^[3]。且移植的自体红骨髓在周围组织未能建立周围营养的情况下便可以迅速参与到骨折组织的修复与重建，更不存在免疫排斥及伦理学方面的问题。

骨折愈合是否需要一期红骨髓移植，是否植入间充质干细胞？当股骨粉碎性骨折时进行闭式复位髓内钉内固定术，同期进行自体红骨髓一期移植是否可促进骨折处成骨的作用，尚处于研究阶段^[4]。基于以上背景提出，从影像学水平、组织水平对兔股骨粉碎性骨折时进行闭式复位髓内钉内固定术，同期进行自体红骨髓一期移植是否可促进骨折处成骨的变化有全面的认识，探讨骨折二期愈合过程中2周血肿机化演进期，4周原始骨痂形成期的一系列改变，探讨兔股骨粉碎型骨折的情况，采取闭式复位髓内钉内固定方法，一期治疗同时给予自体红骨髓移植干预措施，对于骨折愈合能力，骨折愈合时间的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至6月在内蒙古医科大学分子病理实验室完成(内蒙古自治区重点实验室)。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 3月龄健康新西兰兔20只，雌性10只，雄性10只，体质量(2.25±0.15) kg，标准饮食，室温下单笼喂养。实验用兔由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，实验单位使用许可证编号：SYXK(蒙)：2013-0001，合格证号：No.61001600000083。

1.3.2 主要实验试剂及仪器 组织包埋机(BG-1150H)，上海徕卡仪器有限公司；切片机(EG-1150C)，上海徕卡仪器有限公司；冷却机(RM-2016)，上海徕卡仪器有限公司；生物显微镜(XS-212)，江南光学仪器厂；病理组织漂烘仪(TEC-2500)，常州郝思琳医用仪器有限公司；电热恒温水温箱，上海医疗器械七厂；Milli-Q纯水器，美国Millipore公司；生物洁净工作台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 骨折器 骨折器采用自制改良兔骨折器，依据李曙光等^[5]制造的骨折器进行改良，其原理采用自由落体原理，将楔形铁器末端用橡胶保护，圆钝端黏贴方形木板以增加受力面积，用5 kg重物从30 cm高度处自由落体落下，兔固定于兔夹上，外展后单侧肢以备制模。

1.4.2 兔股骨粉碎性骨折动物模型制作 白兔通过静脉注射5 mg/kg氯胺酮麻醉，助手手执楔形骨折器，其末端置于白兔单侧后肢内侧股骨中下段，用5 kg重物从30 cm高度处自由落体落下，受力于楔形骨折器方形木板处，造成兔股骨干闭合性粉碎型骨折，备用。

1.4.3 髓内钉内固定手术 取兔膝关节备皮，碘伏、乙醇消毒，尖刀沿髌骨下方做纵行3 mm切口，依次切开皮肤、髌腱，显露股骨髁间。患肢曲膝120°，沿兔大腿外侧可触及股骨外轮廓，手法复位骨折断端，在X射线透视机下，显示骨折断端复位对线良好。选取直径为1.0 mm克氏针经股骨髁间凹后1/3处沿股骨轴向由电钻钻入，X射线透视下见克氏针顺利通过骨折远近断端，钻入深度约4 cm。钻出直径1.0 mm克氏针，依次替换直径为1.5 mm、2.0 mm克氏针，最终选择2.0 mm直径的克氏针固定，进针深度约为4.5 cm，此时克氏针与股骨髓腔最狭窄处紧密贴服，克氏针在股骨远、近端松质骨崁插固定。沿膝关节皮肤掐断克氏针尾部，活动患肢膝、髋关节，见骨折固定稳固。兔左、右两侧均采用此法造模固定。

将兔股骨粉碎性骨折内固定造模成功的右侧股骨定义为骨折内固定组，将其左股骨定义为红骨髓移植组。

1.4.4 红骨髓移植 固定后使兔取俯卧位，触及双侧髂骨后棘，备皮，碘伏、乙醇消毒，选用20 mL注射器由双侧髂后上棘3-5点多点穿刺抽吸扁骨内红骨髓1.5-2.0 mL，由1 mL注射器抽取1 mL红骨髓，定量注射于左股骨骨折处周围，拔出针头时乙醇消毒创口。

兔制模过程中，由于其周围软组织丰满程度、骨质情况差异，兔股骨骨折类型分为AO分型B型骨折和C型骨折，未出现开放骨折，为防止兔在制模过程中休克，骨折模型建立后，给予静脉缓慢输注聚明胶肽注射液20 mL，30 mg注射用克林霉素、生理盐水溶液10 mL，进行抗休克治疗。造模次日继续给予静脉缓慢输注聚明胶肽注射液20 mL，术后第3天给予30 mg注射用克林霉素、生理盐水溶液10 mL抗炎治疗。

1.4.5 标本制备 所有动物于造模后第14，28天分2批麻醉后用空气栓塞法处死，按随机数字表法每批处死10只兔，动物处死后取出内固定，分别于2组骨折处取样，先行X射线摄片，随后去除骨折周围软组织，取出内固定材料，以骨折处为中心锯下一段1 cm长的股骨，置于体积分数10%中性甲醛溶液固定。

1.4.6 骨组织脱钙

(1)配制成脱钙液：将EDTA 20 g，蒸馏水100 mL，加入氢氧化钠搅拌使之溶解，然后用用稀盐酸调节pH值至7.5。

(2)将兔骨折处骨组织放入盛有脱钙液的小容器中，再将装有标本的小容器放入盛有自来水的微波炉专用容器。微波脱钙温度：50 ℃，每次辐射2 min，2个辐射循环之间室温冷却5 min，30个脱钙循环为最佳脱钙终点。用针头轻松穿入组织内提示脱钙完全。

(3)梯度乙醇脱水，常规组织石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色。

1.5 主要观察指标

1.5.1 骨折周围骨痂厚度测量 对2组兔股骨骨折髓内钉固定模型骨折后及骨折2周时进行X射线片检查，应用游标卡尺(精确度0.02 mm)测量X射线片上骨折周围骨痂最厚处骨痂厚度，并以影像检查标尺为换算标准，计算对应最宽处骨痂厚度，以评估骨折愈合速度。

1.5.2 软骨细胞数量计算 苏木精-伊红染色，光镜观察2组骨折14 d骨折处组织切片中软骨细胞数量，计算对应时间点2组骨折处组织切片的软骨细胞浓度，依据Pareek等的计数方法进行^[6]，先在低倍视野内(×100)选择软骨细胞浓度高的区域，然后在高倍视野内(×400)计数5个视野，取平均值作统计学处理，即每张切片的软骨细胞浓度=5个高倍镜视野(×400)下的软骨细胞数目总和/5。

1.5.3 骨组织形态计量学分析 苏木精-伊红染色，镜下观察组织切片，每例均检测新生骨的3个截面，取平均值用于数据分析。测定骨小梁相对面积，指骨小梁(包括矿化骨及类骨质)占全部松质骨(包括骨小梁及髓腔)的面积百分比，属骨量静态参数。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，SPSS 13.0软件进行统计分析，2组较采用两个独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨折愈合是和组织细胞、病理生理、生物学等紧密联系的一个动态的、复杂的过程。骨折二期愈合分为血肿机化演进期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期3个阶段。这种主动修复过程经常会受到一些生物学因素和理化因素的影响。有些因素可以通过技术的改良、知识的储备从而降低或者避免它的发生；但有些原因却是无法避免出现骨不连的发生^[7]。动物模型是研究人类疾病的重要模拟物。兔股骨新鲜粉碎性骨折是研究股骨新鲜粉碎性骨折愈合过程和观察各因素对新鲜骨折愈合影响常用的动物模型，骨折部位、类型和造模条件的一致性是保证实验结果准确的前提条件。

自Kuntscher发明了髓内钉后，下肢长骨骨折的患者生存率及预后情况逐年的得到了改善。随着髓内钉不断改进和发展，闭式复位髓内钉内固定术已成为治疗下肢骨粉碎型骨折的主要方法。随着穿钉技术的进一步改进，骨折后并发症预防明显改善，治疗效果明显提高，患者出现肺功能异常，合并多发伤的病死率不断降低^[8]。就内固定治疗技术而言交锁髓内钉内固定技术较钢板内固定治疗技术，具有诸多优点^[9]。因扩髓碎屑包含有成骨细胞和骨髓干细胞，从而起到了骨移植的作用，可以加速骨折愈合^[4]。闭式复位髓内钉内固定为骨折愈合提供了必要的血肿。通过实验前进行的兔预实验及相关部位的解剖，经过反复试验选择直径2.0 mm的克氏针模仿人股骨髓内钉，进行闭式复位内固定，创伤小，出血少；克氏针粗细恰当，能与兔股骨髓腔最狭窄处紧密贴服，由直径1.0，1.5，2.0 mm克氏针依次替换钻入，模拟扩髓过程；直径1.0，1.5 mm克氏针均入针深度约4 cm，直径2.0 mm克氏针进针深度约4.5 cm，与股骨远、近端松质骨崁插固定。内固定恢复兔股骨长度、防止折断呈角，保留骨折处血肿，达到以二期愈合的方式治疗下肢长骨粉碎型骨折的目的。

骨折愈合和胚胎期骨骼形成过程基本相似，其分子机制已经阐明^[10]。在未分化的骨髓间充质干细胞、骨形态发生蛋白以及生长因子的调控作用下^[11-12]，软骨细胞和成骨细胞增殖分化，最后形成骨组织而达到愈合^[13]。间充质干细胞是中胚层组织共同的前体细胞^[7]。间充质干细胞实际上是骨髓中一类既具有极强的多分化潜能，同时具有自我更新能力的组织干细胞。在体内、外特定的条件下，骨髓间充质干细胞可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞进行分化^[14]。骨髓基质干细胞能够向成骨细胞转化，具有明确的成骨能力。但是植入单体间充质干细胞并不能有效地形成新的组织^[15]。在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，仍然需多种生长因子的协调及诱导。目前研究证实在骨折愈合中发挥主要作用的6种成骨性生长因子：骨形态发生蛋白2^[16-20]、胰岛素样生长因子Ⅰ、碱性成纤维细胞生长因子^[21-22]、血小板衍生生长因子、转化生长因子β1^[23-24]、血管内皮生长因子^[25-26]。成骨性生长因子在骨修复过程中诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

在骨缺损的诸多修复材料中，自体骨移植效果确切，但因其来源有限而受到限制，而自体红骨髓不受来源限制，并且具有较强的成骨作用^[27]。成人红骨髓主要存在于扁骨中，红骨髓中富含具有成骨潜力的各种骨生长因子和间充质干细胞，是用于促进骨折修复及加快骨折愈合的首选移植材料。另外，当抽取骨髓时，还会诱发局部和全身的成骨反应。一期植入富含未分化的骨髓间充质干细胞和生长因子的自体红骨髓情况下，为骨折处提供新鲜的种子细胞，促进骨折处增殖分化软骨细胞和成骨细胞^[7]，促进骨折周围成骨反应的发生。所以，在本试验中兔股骨新鲜粉碎性骨折髓内钉内固定的模型中，一期进行红骨髓移植，从细胞学层面解释了实验组骨折愈合明显优于对照组的原因。经皮注射自体骨髓技术具有如下优点：无需体外细胞培养扩增，不存在临床细胞治疗的伦理学争议，浓缩和移植过程均在手术室无菌条件下内完成，保证了及时和无菌^[28]。骨髓干细胞移植技术治疗股骨骨折，取材容易，操作简单，技术要求不高，对患者身体也没有太大影响，很有推广价值^[29]。

本研究发现，在骨折内固定组骨折14 d组织标本中可以在200倍镜下见：局部无菌性炎症反应，骨髓腔内出血形成血肿，可见新生毛细血管，进而形成肉芽组织，部分标本可见纤维组织，400倍镜下见纤维组织中见少量幼小软骨细胞生成。骨折内固定组骨折14 d皆处于血肿激化演进期。在红骨髓移植组骨折14 d组织标本中可以在200倍镜下见：继续可见纤维组织，纤维组织中较多软骨细胞形成。红骨髓移植组骨折14 d正处于血肿激化演进期向原始骨痂形成期发展阶段。2组组织同时处于血肿激化演进期，软骨细胞处于增殖状态，可以通过光镜观察2组骨折14 d骨折处组织切片中软骨细胞数量，来比较骨折愈合进度的快慢。依据Pareek等的计数方法进行，差异有显著性意义，即红骨髓移植组骨折处软骨细胞生成数量大于骨折内固定组，骨折愈合速度快于骨折内固定组。在骨折内固定组骨折28 d组织标本中可以在400倍镜下见：骨内外膜可见成骨细胞，骨髓腔内的纤维组织及软骨细胞，可见纤维组织及软骨组织演进。骨折内固定组骨折28 d皆处于原始骨痂形成期初期。在红骨髓移植组骨折28 d组织标本中可以在200倍镜下见：可见不同成熟程度的骨小梁排列成网梁状，与周围纤维软组织相连，软骨细胞增生钙化而骨化——软骨内化骨。红骨髓移植组28 d正处于相当与原始骨痂形成期末期。此时红骨髓移植组骨折28 d的骨折愈合过程中组织学观察到软骨细胞正在被骨细胞所取代，软骨细胞的数量正在减少，而骨折内固定组骨折28 d是处于软骨细胞增殖过程还是被骨细胞取代的过程，未然而知，无法通过软骨细胞的数量或者浓度判断骨折愈合的进度。软骨细胞浓度的比较在28 d时失去了意义，此时软骨细胞的钙化成点、钙化点连接成网状，形成骨小梁，作者通过骨组织形态计量学分析，镜下观察组织切片，每例均检测新生骨的3个截面，取平均值用于数据分析。测定骨小梁相对面积，指骨小梁(包括矿化骨及类骨质)占全部松质骨(包括骨小梁及髓腔)的面积百分比，属骨量静态参数，差异有显著性意义，对骨小梁生成相对面积进行比较，红骨髓移植组骨折愈合速度快于骨折内固定组。通过据此推断：在兔股骨粉碎性骨折髓内钉内固定模型中使用自体红骨髓移植，起到了促进骨折愈合的作用。

在骨折的愈合过程中，血肿机化期及软骨形成均是不显影的，只有骨痂形成才会显影，作者以标尺为基准，参照髓内钉直径为2.0 mm对2组骨折14，28 d 4组骨折术后骨痂的X射线检验中骨痂的厚度进行测量，得出对应骨折内固定组、红骨髓移植组骨折14 d，骨折内固定组、红骨髓移植组骨折28 d的骨痂平均厚度分别为3.01 mm，7.78 mm，8.77 mm，4.42 mm；而骨折线消失情况为未消失、部分消失，消失、消失；参照骨折内固定组、红骨髓移植组骨折28 d，2组在骨折14 d X射线片显示，2组骨痂平均厚度分别为(2.89±0.43) mm、(7.78±0.72) mm。

本实验结果显示，兔股骨粉碎性骨折髓内钉内固定模型建立后，自体红骨髓移植的患肢，骨痂形成的厚度在2周时红骨髓移植组明显宽于骨折内固定组，但在4周时骨折内固定组宽于红骨髓移植组，在骨折模型造模2周时，红骨髓移植组骨折线部分消失，骨折内固定组骨折线可见，在造模4周时2组骨折线皆消失。

然而，骨折愈合取决于成骨细胞及破骨细胞的协调作用，前者完成骨折愈合，后者则实现骨塑形和重构，是一个极其复杂的生物学过程。骨痂改造塑性期，骨痂建成后，由于机能上对应作用的适应过程，随着肢体的活动和负重，在应力轴线上的骨痂不断加强和改造，在应力轴以外的骨痂，逐渐被清除，使得原始骨痂逐渐改造为永久骨痂，后者具有正常的骨结构。综上考虑在自体骨髓移植后实验组已进入骨痂改造塑性期。在此期单纯比较骨痂生成的厚度已经失去比较的意义，骨折28 d 2组骨折线已基本消失，无法判断是否处于骨痂改造塑性期，无法通过骨痂厚度进行比较。2组骨折14 d组正处于血肿机化演进期向原始骨痂塑性期演进过程，骨膜内化骨逐渐加强，成骨细胞增生活跃，所以，可以通过X射线下比较外骨痂形成的厚度比较骨折愈合的程度。

在整个实验骨折的愈合过程中，2组骨折14 d，骨折内固定组骨折28 d兔下肢固定后，患肢始终未能进行正常的负重，红骨髓移植组在骨折术后4周时大部分已经可以进行部分负重活动。虽然没有可靠的试验数据，但从临床角度而言已经具备骨折愈合的表现。总之，在兔股骨粉碎性骨折愈合的不同阶段，一期红骨髓自体移植促进骨折修复及加快骨折愈合，缩短骨折愈合的时间，减少骨不连的发生，为今后下肢新鲜粉碎性骨折的患者早日康复，提高生活质量展现了光明前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

自体红骨髓一期移植治疗股骨粉碎型骨折

One-stage treatment with autologous red bone marrow transplantation for femoral comminuted fracture

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[3]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[4]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[5]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[6]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[7]	朱婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张强, 刘静, 邵明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[8]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[9]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[10]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[11]	轩娟娟, 白鸿太, 张继翔, 王耀权, 陈国勇, 魏思东. 调节性T细胞亚群在肝移植中的作用及临床应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1143-1148.
[12]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[13]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[14]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[15]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.