改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶人工角膜材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

人工角膜：是用医用高分子材料制成的类似人体角膜的产品，人工角膜一般包括光学镜柱和周边支架两部分。光学镜柱一般采用光学特性优良、物理化学性质稳定的透明材料制成，用以替代病变后阻碍眼球光学通路的浑浊角膜；周边支架一般采用组织相容性良好的生物材料制成。

改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶：通过改进冷凝和加热温度、搅拌时间和反复冷冻-融化次数的工艺制备改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇水凝胶，具备良好的生物相容性和力学性能。

背景：如何提高人工角膜在宿主体内的稳定性，减少并发症仍是当前需要解决的关键问题。因此寻找一种理想的生物相容性高的支架材料仍是研究的重点。

目的：探讨改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合物水凝胶和单纯聚乙烯醇水凝胶作为人工角膜材料的生物相容性。

方法：①倒置显微镜观察改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇和单纯聚乙烯醇提取液培养48 h后兔角膜基质成纤维细胞生长情况；②MTT法检测改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇和单纯聚乙烯醇提取液培养不同时间兔角膜基质成纤维细胞的相对增殖率；③新西兰白兔进行人工角膜移植实验，于植入48 h后观察过敏、热原反应以及死亡情况；④人工角膜植入4周后取角膜进行苏木精-伊红染色；⑤人工角膜植入4周后，采用ELISA检测血清炎症因子水平；⑥人工角膜植入1-4周，裂隙灯观察角膜、结膜充血水肿、角膜新生血管变化，并统计新生血管出现时间以及新生血管生长面积评分。

结果与结论：①与空白对照组相比，加入2种人工角膜材料提取液培养细胞48 h后，细胞均稀疏，生长速度缓慢，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组细胞较聚乙烯醇组生长较快，呈梭形，拉丝现象不明显；②与空白对照组相比，加入2种材料提取液培养细胞不同时间后，细胞相对增殖率均明显降低(P < 0.05)，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的细胞增殖率高于聚乙烯醇组(P < 0.05)；③植入2种材料48 h后，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组仅有2只兔子发生过敏反应，无热原反应和死亡，而聚乙烯醇组有2只兔发生过敏反应，2只发生热原反应，无死亡；④植入4周后，与空白对照组比较，两组兔血清炎性因子水平明显增加(P < 0.05)，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的炎性因子水平少于聚乙烯醇组(P < 0.05)；⑤改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组新生血管出现时间晚于聚乙烯醇组，新生血管生长面积小于聚乙烯醇组(P < 0.05)；⑥结果表明，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶作为人工角膜材料，在细胞生物相容性方面均优于单纯聚乙烯醇水凝胶，这为临床上人工角膜材料的应用提供了科学依据。

ORCID: 0000-0003-1214-7678(杜倩)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 纳米羟基磷灰石, 聚乙烯醇, 水凝胶, 人工角膜, 生物相容性

Abstract:

BACKGROUND: How to improve the stability of artificial cornea in the host and reduce the complications is the current key issues to be solved. Therefore, looking for an ideal biocompatible scaffold material is still the focus of the study.

OBJECTIVE: To explore the biocompatibility of nano-hydroxyapatite (nHA)/polyvinyl alcohol (PVA) porous composite hydrogel and pure PVA hydrogel as artificial corneal materials.

METHODS: Inverted microscope was used to observe cell growth of rabbit corneal stromal fibroblasts when cultured with nHA/PVA composite hydrogel extract or PVA extract for 48 hours. MTT method was used to detect the relative proliferation rate of rabbit corneal stromal fibroblasts cultured with nHA/PVA composite hydrogel extract or PVA extract. Systemic toxicity, allergies, pyrogen reaction and deaths were observed in New Zealand white rabbits at 48 hours after artificial corneal implantation. ELISA and hematoxylin-eosin staining were used to detect changes in serum inflammatory factors at 4 weeks after artificial corneal implantation. Slit-lamp examination was performed to observe corneal or conjunctival hyperemia/edema and corneal neovascularization at 1-4 weeks after corneal implantation. Corneal neovascularization time and neovascularization area were detected after the two materials were implanted.

RESULTS AND CONCLUSION: The cells were sparse and grew slowly at 48 hours after culture in nHA/PVA composite hydrogel or PVA extract as compared with the blank control group. The cell growth in the nHA/PVA composite hydrogel group was better than that in the PVA group. The relative cell proliferation rate was significantly decreased at different time after culture in nHA/PVA composite hydrogel or PVA extract compared with the blank control group (P < 0.05), and the relative cell proliferation rate in the nHA/PVA composite hydrogel group was significantly higher than that in the PVA group (P < 0.05). There were two rabbits appearing to have allergic reaction, but no one presenting with pyrogen reaction and death in the nHA/PVA composite hydrogel group; and there were two rabbits appearing to have allergic reaction, and two appearing to have pyrogen reaction, but no death in the PVA group at 48 hours after implantation. The inflammatory factor levels were increased significantly in the nHA/PVA composite hydrogel group and PVA group compared with the control group (P < 0.05), and inflammatory infiltration was milder in the nHA/PVA composite hydrogel group than the PVA group at 4 weeks after implantation (P < 0.05). Corneal neovascularization appeared later in the nHA/PVA composite hydrogel group than the PVA group, and the neovascularization area was also smaller in the nHA/PVA composite hydrogel group than the PVA group (P < 0.05). Taken together, the biocompatibility of nHA/PVA composite hydrogel is superior to that of pure PVA when they are used as artificial cornea materials, which provides a scientific basis for artificial cornea material innovation and extensive clinical application.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Polyvinyl Alcohol, Hydrogel, Corneal Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杜倩，杜琛，金贵玉，田华. 改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶人工角膜材料的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(22): 3541-3546.

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[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(22): 3541-3546.

图/表（结果） 6

2.1 人工角膜材料浸提液培养兔角膜基质成纤维细胞的形态学差异与空白对照组相比，加入2种材料提取液培养细胞48 h后，细胞均稀疏，生长速度缓慢，其中纳米羟基

磷灰石/聚乙烯醇组细胞拉丝现象不明显(图1)。

2.2 人工角膜材料浸提液对兔角膜基质成纤维细胞的毒性评价与空白对照组相比，加入2种材料提取液培养细胞不同时间后，细胞相对增殖率均明显降低(P < 0.05)，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的细胞增殖率高于聚乙烯醇组(P < 0.05)；除了单纯聚乙烯醇组培养24 h后的毒性属待定，其余均属合格，见表2。

2.3 两种材料植入后实验兔过敏、热原、死亡发生情况植入2种材料后，纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组仅有2只兔子发生过敏反应，无热原反应和死亡，而聚乙烯醇组有2只兔子发生过敏反应，2只发生热原反应，无死亡。

2.4 两种材料植入后角膜苏木精-伊红染色以及血清中炎性因子水平植入4周后，与空白对照组比较，两组实验兔血清炎性因子水平明显增加(P < 0.05)，纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组炎性因子少于聚乙烯醇组(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示，与空白对照组相比，植入2种材料组炎性浸润明显增加，而改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的炎性反应较聚乙烯醇组轻，见表3，图2。

2.5 两种人工角膜材料植入后角膜新生血管出现的时间以及新生血管生长面积评分比较植入人工角膜材料术后第1周，纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组和聚乙烯醇组均有球结膜充血水肿、房水闪辉及前房炎性渗出。术后第2周，两组球结膜充血减轻，房水闪辉减少。术后第3周，聚乙烯醇组出现点状炎症浸润，角膜上皮出现缺损，且4只出现角膜血管新生情况。术后4周，纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组有2只出现血管新生情况，且发生角膜新生血管生长面积小于聚乙烯醇组(图3)。纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的兔新生血管出现时间晚于聚乙烯醇组(P < 0.05)，新生血管生长面积评分小于聚乙烯醇组(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计完全随机异源配对实验。

1.2 时间及地点动物饲养和动物实验于2015年6月至2016年3月在南阳市城区动物检疫站动物实验室完成，细胞实验于2015年12月至2016年5月在南阳市中心医院眼科中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 两种人工角膜材料改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶由卡勒特纳米材料有限公司制备，单纯聚乙烯醇水凝胶购于南京埃普瑞材料有限公司。人工角膜设计成直径6.5 mm的圆盘状，其中心光学区域直径4 mm，支架宽3 mm，厚490 μm，孔隙率50%，曲率半径7.5 mm。

1.3.2 实验动物与分组雄性新西兰兔21只，8周龄，体质量1.5-2.0 kg，购于上海生旺实验动物养殖有限公司，许可证编号为SCXK(2013-0013)。所有新西兰兔正常饮食，并通过眼科检查排除眼部疾病。

1.3.3 实验试剂与实验仪器苏木精-伊红染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)；免角膜基质成纤维细胞株、H-DMEM培养基、胎牛血清(上海星科生物科技有限公司)；青霉素、链霉素双抗(碧云天生物技术研究所)；MTT试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；SLM-6手持式裂隙灯显微镜(重庆康华瑞明科技股份有限公司)；眼科手术显微镜(镇江中天光学仪器有限责任公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 材料浸提液的提取将2种水凝胶材料各剪下 50 mm长度，用PBS冲洗3次，放入紫外操作台中照射6 h，置于60 mm培养皿中，加入2 mL H-DMEM培养基，于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中培养48 h，获得浸提液。

1.4.2 细胞培养与形态学观察取第5代兔角膜基质成纤维细胞，以2×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于35 mm培养皿中，分别用正常H-DMEM培养基、H-DMEM+纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇水凝胶提取液、H-DMEM+聚乙烯醇水凝胶提取液各2 mL培养细胞48 h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.4.3 MTT法检测细胞毒性第5代兔角膜基质成纤维细胞以3.5×10⁶ L^-1的细胞浓度铺于96孔板上，加入各材料的浸提液(每孔加入200 μL)分别培养24，48，72 h后，加入MTT稀释溶液各20 μL，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入二甲基亚砜，振荡使结晶物充分溶解，在酶标仪450 nm处读取各孔的吸光度。细胞的相对增殖率=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。合成材料毒性等级^[21]：相对增殖率≥100%为0级(合格)，75%-99%为1级(合格)，50%-74%为2级(待定)，25%-49%为3级(不合格)，1%-24%为4级(不合格)。

1.4.4 人工角膜移植 21只新西兰兔随机分为3组：空白对照组，改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶组，单纯聚乙烯醇水凝胶组，每组7只。新西兰白兔实施麻醉后固定实验台，暴露右眼，在眼科手术显微镜下用隧道刀、虹膜恢复器于鼻下方切口，沿角膜缘后剪除4 mm× 4 mm板层囊袋，分别将改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶人工角膜、聚乙烯醇水凝胶人工角膜植入囊袋内，采用7-0缝线缝合角膜切口，术后1周内使用可乐必妥滴眼液，每天三四次。空白对照组不进行任何处理。

1.4.5 记录实验动物的过敏反应和热原反应 ①热原反应标准：确定空白对照组新西兰兔正常体温后，每隔1 h检测1次植入人工角膜的新西兰兔体温，连续测3次，以3次体温中最高体温减去正常体温，即为该兔体温升高的度数。若体温升高0.6 ℃或以上为热原反应；②过敏反应标准：荧光酶联吸附试验检测各组新西兰兔血清特异性sIgE含量，根据血清sIgE含量判定是否发生过敏反应。

1.4.6 苏木精-伊红染色植入人工角膜4周后，取角膜组织约6 mm×6 mm大小。制备石蜡切片，切片在室温干燥10 min，于37 ℃烘箱烤片90 min，放入苏木精中浸泡 3 min，自来水冲洗1min，1%盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗2 min；1%甲苯胺蓝水溶液返蓝10 s，自来水冲洗 2 min，伊红着色30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，于正置显微镜下观察并拍照。

1.4.7 ELISA检测血清中炎性因子的表达植入人工角膜4周后，耳缘静脉取血1 mL，静置1 h，离心(4 500 r/min，10 min)，取上清，将不同浓度标准品各0.1 mL依次加入一排7孔中，加入稀释的待检测样品0.1 mL，置于37 ℃孵育90 min，甩去酶标板中的液体。按每孔0.1 mL依次加入抗体工作液，置于37℃孵育60 min，PBS洗涤3次；按每孔0.1 mL依次加入ABC工作液，置于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤5次；按每孔90 μL依次加入TMB显色液，置于37℃避光反应15-20 min；按每孔100 μL依次加入TMB终止液，用酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.4.8 裂隙灯显微镜观察植入人工角膜1-4周，通过裂隙灯显微镜观察记录角膜水肿、结膜充血、角膜新生血管生成情况。角膜新生血管面积=C/12×π×[r²-(r-L)²]，C为角膜新生血管圆周钟点数，r为角膜半径，L为角膜边缘垂直的新生血管长度。对比角膜新生血管面积评分^[22]，评分标准见表1。

1.5 主要观察指标 ①两种人工角膜材料浸提液培养兔角膜基质成纤维细胞的形态学差异；②两种人工角膜材料浸提液对兔角膜基质成纤维细胞相对增殖率的影响以及毒性评价；③通过裂隙灯显微镜观察人工角膜植入后1-4周角膜水肿、角膜新生血管变化等；④两种人工角膜植入后兔过敏、热原、死亡发生情况；⑤术后第4周，角膜组织学形态。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件分析，数据服从正态分布，以x(_)±s表示，各组之间的计量资料比较采用F 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

人工角膜移植可用来治疗于酸、碱、烧伤、爆炸伤等严重损伤角膜疾病患者，或病变导致角膜长满新生血管患者，或在活体角膜移植后发生排斥反应再次出现浑浊终末期角膜盲患者^[21]。据世界卫生组织统计，目前全球共有角膜盲患者约6 000万人，而中国就约占500万人之多^[22]。由于角膜移植供者少、成本高、移植后排异反应强烈，所以人工角膜成为了缓解供者紧张的重要替代物^[23]。

高分子聚乙烯醇具有高弹性，性质稳定，无毒副作用和良好的生物相容性，在医用高分子材料领域有广阔的应用前景，如组织工程支架^[24]、人工关节软骨^[25]、人工器官^[26]、人工角膜中光学镜柱部分等^[11]。高分子聚乙烯醇水凝胶具有类似天然软骨的多微孔组织，使得高分子聚乙烯醇具有耐摩擦特性^[27]。高分子聚乙烯醇光学镜柱与周边支架结合性较差，故采用纳米羟基磷灰石复合，增加了良好的组织相容性和结合性能。传统的纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇水凝胶因采用纳米羟基磷灰石与聚乙烯醇搅拌共混，1-3次冷凝加热方法制备，由于冷凝和加热温度差异，使得羟基磷灰石分布不均，造成纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇水凝胶生物相容性和力学性能差异较大^[28]。Mittal等^[19]通过改进冷凝和加热温度、搅拌时间和反复冷冻-融化次数的工艺制备改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇水凝胶，具备良好的生物相容性和力学性能。它以聚乙烯醇水凝胶共聚物作为光学中央部分，支架部分为新型纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶。光学区域与支架通过互穿网络技术结合，使光学区的聚乙烯醇水凝胶与支架内的水凝胶聚合，从而形成光学区域-支架部分一体型的人工角膜^[29]。实验研究结果显示，与空白对照组相比，加入改良纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇和聚乙烯醇提取液培养细胞48 h后，兔角膜基质成纤维细胞均稀疏，生长速度缓慢，但纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组细胞拉丝现象不明显。与空白对照组相比，加入2种材料提取液培养细胞不同时间后，细胞相对增殖率均明显降低，其中纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的细胞增殖率高于聚乙烯醇组。植入材料后，纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组仅有2只兔子发生过敏反应，无热原反应和死亡，而聚乙烯醇组有2只兔子发生过敏反应，2只发生热原反应，无死亡。与空白对照组比较，两组实验兔血清炎性因子明显增加(P < 0.05)，植入纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的炎性因子较聚乙烯醇组少(P < 0.05)；苏木精-伊红染色显示，与空白对照组相比，植入材料组炎性浸润明显增加，而纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组的炎性反应较聚乙烯醇组轻。纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组新生血管出现时间晚于聚乙烯醇组，新生血管生长面积小于聚乙烯醇组(P < 0.05)。

以上研究结果表明，改良的纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔复合水凝胶作为人工角膜材料，在细胞生物相容性方面均优于单纯聚乙烯醇水凝胶，这为临床上人工角膜材料的应用提供了科学依据。

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