股骨延迟愈合外固定模型兔的建立与评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3190-3195.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.013

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股骨延迟愈合外固定模型兔的建立与评估

张志天¹，王淑民²，赵景新³，张猛³

¹河北省承德县三沟中心卫生院骨外科，河北省承德市 067000；²河北省承德县妇幼保健计划生育服务中心，河北省承德市 067000；³承德医学院附属医院创伤骨科，河北省承德市 067000

修回日期:2017-02-03 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 张猛，硕士，医师，承德医学院附属医院创伤骨科，河北省承德市双桥区 067000
作者简介:张志天，男，1970年生，河北省承德县人，汉族，2012年承德医学院毕业，主治医师，主要从事创伤骨科方面的研究。

Establishment and evaluation of a rabbit model of femoral delayed union using external fixation

Zhang Zhi-tian¹, Wang Shu-min², Zhao Jing-xin³, Zhang Meng³

¹Department of Orthopaedics, Sangou Central Health Center of Chengde County of Hebei Province, Chengde 067000, Hebei Province, China;²Maternal and Child Health Care and Family Planning Service Center, Chengde 067000, Hebei Province, China; ³Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China

Revised:2017-02-03 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Zhang Meng, Master, Physician, Department of Traumatic Orthopedics, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Zhang Zhi-tian, Attending physician, Department of Orthopaedics, Sangou Central Health Center of Chengde County of Hebei Province, Chengde 067000, Hebei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨折延迟连接：骨折在正常愈合所需的时间(一般为4个月内)，仍未达到骨折完全愈合的标准，称为骨延迟连接。X射线显示骨折端骨痂少，轻度脱钙，骨折线明显，但无骨硬化表现。
骨外固定：是利用外固定架(器)对骨折端进行复位和固定的一种治疗手段。它经软组织将内植物(针或钉)穿过骨折的远、近段，然后再通过连杆和固定夹将裸露于皮肤外的内植物彼此连接起来，在骨折端起到加压、牵拉和中和作用以达到复位和固定骨折，重建骨骼并校正畸形的目的。

摘要
背景：关于骨折及骨折不愈合的研究已经较为清晰，对于骨折延迟愈合由于时间概念及治疗方法界定的争议较多。
目的：以新西兰大白兔为实验动物，以股骨为实验部位，选择外固定方式，建立一个可靠的骨折延迟愈合模型。
方法：新西兰长耳大白兔72只，随机分成3组，将实验A组及B组实验兔左侧股骨中段截除10 mm皮质骨，同时去除内外骨膜及骨髓，使用单边微型可调节外固定架固定，A组固定后保证骨折断端1 mm的间隙，B组固定后使用骨蜡封堵骨折断端同时保持骨折断端接触。对照组仅截断骨皮质不需截除内外骨膜及骨髓，然后进行固定并直接保持骨折断端接触，不做其他处理。造模后4，8，12周进行大体观察、影像学观察及组织学观察骨折断端的愈合情况。
结果与结论：①对照组骨性愈合时间为4周，A组及B组愈合时间均为12周，对照组只对大白兔进行了骨折处理，因此愈合时间即为骨折正常愈合时间，A组及B组的愈合时间明显长于对照组；②实验建立的兔股骨骨折延迟愈合模型具有延迟愈合的X射线及病理特征，结果表明模型是合理、可靠的，可以为临床研究提供一定的参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-2905-3977(张志天)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 模型, 动物, 外固定架, 新西兰大白兔, 股骨, 骨折, 延迟愈合

Abstract:

BACKGROUND: Mechanisms related to bone fracture and nonunion have been clarified, but the healing time and treatment strategy of delayed union remain controversial.

OBJECTIVE: To establish a reliable model of femoral delayed union using external fixation in the New Zealand white rabbit.

METHODS: Seventy-two New Zealand white rabbits were randomized to three groups. After removal of 10-mm femoral middle bone cortex with internal and external periosteum and bone marrow, a uniplanar external fixator was used. There was a 1 mm gap between broken ends (group A), and the broken ends were sealed by bone wax (group B). For controls, only bone cortex was cut and then fixed to contact the broken ends. The gross, radiological and histological observations were performed to observe the bone healing at 4, 8 and 12 weeks after modeling.

RESULTS AND CONCLUSION: The control group achieved bone healing at the 4^th week, which was considered as the normal time of bone healing. The groups A and B achieved healing at the 12^th week, which was remarkably longer than that in the control group. The rabbit femoral delayed union model showed the typical X-ray imaging and pathological features of delayed union. Our results suggest that the model is reasonable and reliable, which can provide reference for clinical research.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Models, Animal, External Fixators, Femur

中图分类号:

R318

张志天，王淑民，赵景新，张猛 . 股骨延迟愈合外固定模型兔的建立与评估[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3190-3195.

Zhang Zhi-tian, Wang Shu-min, Zhao Jing-xin, Zhang Meng. Establishment and evaluation of a rabbit model of femoral delayed union using external fixation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3190-3195.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 新西兰大白兔72只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组兔月龄和体质量比较 3组兔在体质量及月龄上差异无显著性意义，说明分组对实验结果无干扰。各组兔月龄分布情况见表1；3组兔体质量分布情况见表2。

2.3 大体观察 所有大白兔均在承德医学院附属医院清洁级实验室饲养，手术均在同一清洁环境下完成，大白兔造模前后均可自由活动(图3)。造模后所有实验兔均状态差，患侧肢体跛行，进食及进水较造模前明显减少，手术切口均可见少量血性液体渗出，经定期肌注青霉素及换药后，实验兔3 d后均恢复正常，手术切口干燥结痂，造模后八九天伤口基本愈合。造模后所有动物均未出现感染且均正常健康生长。

2.4 X射线检查 造模后4，8，12周均给予全部大白兔行患肢X射线检查，第4周对照组大白兔均骨折愈合；实验A组有1只大白兔可见骨折愈合，其余实验A组及实验B组大白兔均可见清晰骨折线。第8周时实验B组有1只大白兔可见骨折愈合，其余实验A组及实验B组骨折线模糊，可见较多骨痂。第12周所有大白兔均骨性愈合(图4，5)。

2.5 组织学检查 造模后4周时，对照组实验动物可见骨折断端连接良好，实验A组及实验B组均为纤维瘢痕组织。造模后8周实验A组及实验B组可见骨痂形成，软骨细胞向成骨细胞转化。造模后12周实验A组及实验B组可见骨折连接良好，骨折愈合(图6)。

2.6 各组骨折愈合率比较 造模后第4，8，12周骨折愈合率见表3。

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引言

骨折是指人体的骨骼系统因内力或者外力导致其骨的连续性完全或部分断裂或丧失，是骨科最常见的临床病症。骨折愈合分为3个阶段：血肿炎症机化期、骨痂形成期和骨痂塑形期^[1]。3个阶段的变化及独立又互相影响，最终达到骨折的Ⅰ期愈合或Ⅱ期愈合。由于骨折愈合的阶段体内存在着多种内外环境以及生长因子等的变化，因此在骨折的治疗过程中由于多种因素的共同作用下，可能会影响某一种或者多种体内骨折愈合的变化而出现一系列的并发症，在这些并发症中骨折延迟愈合或不愈合则是最为常见也最为棘手的并发症，若发生了延迟愈合或不愈合将会严重影响骨折患者的预后^[2]。

根据文献报道，骨折患者术后骨折延迟愈合及不愈合的发病率高达8%-10%^[3-5]，如此高的发病率导致了骨折延迟愈合及不愈合顺其自然的成为了骨科研究的热门，但是目前的骨科研究大部分集中于骨折不愈合的病因、发展及治疗，而对骨折延迟愈合的研究则相对较少。现在对于骨折延迟愈合，从定义到时间概念再到治疗都存在着普遍的争议，但有一点不可否认的是骨折延迟愈合相当于骨折不愈合的前驱表现，若不及时处理骨折延迟愈合，则会使病情发展成为骨折不愈合，因此，积极治疗骨折延迟愈合能够有效地避免骨折不愈合的发生。

不论何种临床研究都脱离不了基础实验的支持，而基础实验中尤以骨科为主，动物实验占据着很大的比例，目前关于骨折造模、骨折不愈合造模已有很多种方法，如赵震宇^[6-7]、Yoshizuka等^[8]、Raggio等^[9]建造的模型都很权威，而关于骨折延迟愈合模型的建立却相对少很多，目前国内较知名的是郭树章教授^[10]使用兔桡骨制作的骨折延迟愈合模型。此外，基本没有其他延迟愈合模型的动物实验研究。因此，关于骨折延迟愈合模型的建立仍有很大的研究空间，从大白兔、实验部位、固定方式、固定时间，由于延迟愈合疾病的概念模糊性，都需要深入探讨。

作者则是在查阅大量文献发现延迟愈合模型的研究较少以后，抓住承德医学院附属医院的张猛医师制作兔股骨骨折及骨折不愈合外固定模型实验的契机，通过对其余两种骨折模型的建立积累的经验，在其基础上继续使用兔股骨作为实验部位，使用外固定架固定，设立对照组与实验组，进行了兔股骨延迟愈合外固定模型的实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物建模实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年9月至2015年6月在承德医学院附属医院动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性4-6月龄新西兰长耳大白兔72只，质量为1.5-2.5 kg，由北京金牧阳大白兔养殖有限责任公司。许可证号：scxk(京)2015-0005。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.3.2 外固定装置 Ⅰ型FK5号指骨型外固定支架，由张家港市医械制造有限公司提供，见图1。

1.4 实验方法

1.4.1 骨折外固定模型的建立 给予72只新西兰大白兔编号，按照随机数字表将72只大白兔随机分为对照组、实验A组和实验B组，每组24只大白兔，根据Brizeno^[11]、郭树章^[10]、张猛^[12-13]和段建伟等^[14]学者的方法总结后制作以兔股骨为实验部位的骨折外固定模型。术前1 d所有大白兔禁食水，术前1 h所有大白兔给予40×10⁴ U青霉素预防感染。青霉素为同一批次药物。所有操作均由同一人进行。

以大白兔的左侧后腿为术侧，左大腿外侧为术区，给予术区以电动褪毛机彻底褪毛，保证术区的清洁。使用3%戊巴比妥钠根据1 mL/kg的剂量注入耳缘静脉进行全身麻醉，麻醉成功后将大白兔取左侧卧位置于兔台上，保持大白兔呼吸通畅，手术过程中注意大白兔的生命体征，保证大白兔术后存活。准备完毕后对术区进行常规0.5%碘伏消毒，常规铺无菌手术单。在大白兔大腿外侧中段切纵行切口，长约4 cm，逐层分离皮肤、皮下、筋膜、肌肉，动作手法轻柔，避免手术副损伤，最大程度保证软组织的完整性，避免毁损软组织，分离到股外侧肌及股后肌时沿两肌肉肌间隙钝性分离，分离后可见兔股骨干，充分暴露术野，最大程度显露股骨，然后分别于股骨近端及远端钉入两枚1.5 mm外固定架螺钉，安装外固定架，保证四枚螺钉在同一水平面上，同时外固定架牢固可靠。用线锯离断股骨，实验A组与实验B组均截取10 mm骨皮质(图2)，去除内外骨膜及骨髓；对照组仅离断股骨，保留内外骨膜及骨髓，不做其他处理。为避免截骨过程中产生的热量灼伤软组织，截骨过程中需反复大量生理盐水冲洗截骨部位。截骨完成后，实验A组保持骨折断端1 mm的间隙，实验B组将骨折断端用骨蜡封堵后保持骨折断端接触，对照组保持骨折断端接触，不做其他处理。然后彻底止血，使用0.9%氯化钠注射液及5%碘伏原液反复冲洗伤口后关闭伤口，缝合，包扎。术后将大白兔于清洁级环境下分笼饲养，自由活动。术后1周每日1次注射青霉素40×10⁴ U预防感染，并用5%碘伏原液进行每日2次手术切口消毒并常规换药预防感染。

1.4.2 主要观察指标 ①4，8，12周后给予全部大白兔术侧股骨行X射线检查；②分别于4，8，12周处死8只大白兔，截取骨折断端骨痂软组织，取材包括骨折双侧正常骨端 0.3 cm，行常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木精-伊红染色，于20×20倍显微镜下进行组织学观察。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 19.0软件分析。组间比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨折愈合是一个及其复杂涉及到生物化学、组织学等的过程，受到营养、血运、力学等等一系列因素的影响。骨折在经过系统的治疗以后，尽管大部分都能愈合，但仍有一部分会超过其所需愈合的时间，骨折部位仍未出现骨性连接则称为骨折延迟愈合，其X射线表现一般为骨折断端骨痂少，多为云雾状排列紊乱的刺激性骨痂，这样的表现即为骨折不愈合^[15-17]。骨折延迟愈合的治疗目前仍存在争议，部分学者认为延迟愈合可以观察，因为有骨痂形成，随着时间增加可能不干预即可愈合^[18-19]，也有学者认为发现骨折不愈合即需要干预，如取出原内植物，打通髓腔；对骨折端进行重新固定，适当增加或减少克氏针，或将普通钢板改为加压钢板；植骨治疗等^[20-22]。但无论哪种观点，骨折延迟愈合都是令骨科大夫棘手的一个难题。骨折延迟愈合还可以说是骨折不愈合的前期表现，一旦骨折延迟愈合的骨痂缓慢生长状态停滞那么就发展成了骨折不愈合。因此，骨科大夫对待骨折延迟愈合的问题要谨慎再谨慎，若发展成为骨折不愈合，那么将是更加棘手的难题。

目前对于骨折不愈合的研究比较火热，而且治疗方法基本就是手术治疗，没有其他疑问，但对于骨折延迟愈合的治疗争议短期内仍无法解决，这就需要进行大量的动物实验及临床研究来解决。

目前应用动物进行骨折类实验的不在少数，骨折模型及骨折不愈合模型的建立也五花八门，Lin等^[23]学者利用大白兔制作了骨折不愈合的模型进行骨密度的研究，Chen，Hua等^[24]学者利用大白兔制作骨折模型进行长骨缺损修复方面的研究，Kikuta等^[25]学者利用大鼠制作骨缺损模型进行骨质疏松方面的研究，但对于骨折延迟愈合方面的动物实验却不多见，目前较知名的则是郭树章教授^[10]研究的兔桡骨延迟愈合的造模实验。一个客观的、可靠地模型制作对于后期实验的研究至关重要，因此本实验在总结骨折模型、不愈合模型及延迟愈合模型后尝试利用外固定架制作兔股骨骨折的延迟愈合模型，以期为骨折延迟愈合方面的研究提供参考价值。

目前使用对于骨折的动物研究多以大鼠为主要大白兔，对于体型较大更易于手术操作的新西兰大白兔缺相对较少，而以兔为骨折延迟愈合研究对象的动物实验更是少之又少。郭树章教授^[10]以兔桡骨为研究对象的延迟愈合造模方法使用外固定架制作延迟愈合模型，外固定的方式较内固定具有较强的抗旋转力，本实验采用兔股骨作为试验部位，而股骨作为兔的主要应力骨，外固定架应用于兔股骨的实验方法仍较少。

骨折的愈合时间一般为3个月，超过3个月一般在4-8个月未愈合则为延迟愈合。但该标准为人类愈合标准，通过对照组大白兔可得出兔骨折正常愈合时间为4周^[26-28]。

实验选取的是4-6月龄、1.5-2.5 kg的新西兰大白兔，目前对于骨折类造模选用多大月龄、多大体质量的大白兔仍没有循证医学医学支持，都是在经验使用，目前使用成年新西兰大白兔的实验，认为4-6月龄，体质量在1.5-2.5 kg的适龄适重的实验动物^[29-31]。

实验的创新点在于选用兔股骨使用外固定方式造模，同时使用了骨蜡封堵。在以往的研究中，兔的骨骼以前肢及脊柱研究较多，兔的股骨多是制作股骨头坏死模型^[32-34]。兔的股骨是肢体骨中最粗的^[35]，因此股骨较厚的皮质及较大的直径可以较其他肢体骨更不易劈裂，而且股骨最长，可以保证外固定螺钉的恰当距离，而不会是外固定失效^[36]。外固定方式在日常应用中比内固定要有更强的抗旋转能力，由于实验动物的特殊性，无法保证实验动物术后制动，只能自由活动，因此抗旋转力较强的外固定方式更可以保证骨折断端的稳定，去除不利因素的干扰^[37-40]。本实验的B组在骨折断端使用了骨蜡封堵，然后保持骨折断端接触，也达到了骨折延迟愈合的目的，这是借鉴张猛等学者^[12]在制作骨折不愈合模型时利用骨蜡封堵断端，但为了制作不愈合模型，封堵的断端并未接触，而本实验在在封堵后断端接触，其具体的骨蜡造成不愈合或者延迟愈合的原理仍不清，仍需进一步实验探究。作者认为骨蜡封堵后造成局部骨折断端无法接触成骨，但随着局部的微动，骨蜡会被慢慢从骨折断端移走，从而使骨折断端逐渐接触，随着骨痂逐渐增长，会使更多的断端接触，但由于有骨蜡的存在延缓了骨折断端接触的时间和面积，从而延长了骨折的愈合时间，这只是作者的认为，仍需进一步的实验去证实。

实验的不足之处：①骨折愈合影响因素有年龄、力学因素、局部血运是否丰富及内分泌等，同时临床上骨折有粉碎性、螺旋形、横行骨折等多种，实验仅从横行骨折造模进行实验过程，对轴向应力促进骨折愈合方面进行初步研究，尚不能作为临床治疗各种骨折的参考依据，需要从广度、深度上进一步研究。②该实验的实验对象为新西兰大白兔，虽然该实验达到了预期效果造模成功，但最终该模型的实验成果需应用于临床治疗，新西兰大白兔与人存在物种差异，需在伦理及临床允许下，谨慎的进行部分临床实验，取得显著成果后才可广泛用于临床治疗。

结论：实验提出并进行的制作兔股骨延迟愈合外固定模型造模过程顺利完成，并达到了预期效果，其模型的建立客观可靠，可为延迟愈合相关动物实验提供一定的理论基础及参考价值。

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股骨延迟愈合外固定模型兔的建立与评估

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[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	许新忠, 吴钟汉, 余水生, 赵耀, 徐春归, 张鑫, 郑嵋戈, 荆珏华. 斯氏针置入股骨头不同方式的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1313-1317.
[3]	魏国强, 李云峰, 王一, 牛晓芬, 车丽芳, 王海燕, 李志军, 史国鹏, 白灵, 莫凯, 张晨晨, 许阳阳, 李筱贺. 非均匀材料股骨在不同负荷情况下的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1318-1322.
[4]	李获, 王鹏, 高健明, 蒋浩然, 鲁晓波, 彭江. 股骨头坏死血运重建与内部微观结构改变的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1323-1328.
[5]	李睿, 史文, 杨士彩, 吕林蔚, 张春秋. 夹板外固定与散巴布剂对桡骨骨折模型兔骨愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1329-1333.
[6]	袁加斌, 朱宗东, 唐孝明, 魏丹, 谭波, 肖成伟, 赵淦琳炜, 廖锋. 难复性股骨转子间骨折的解剖分型与复位策略[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1341-1345.
[7]	刘峰, 冯毅. 步态周期下不同克氏针张力带治疗髌骨横行骨折的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1367-1371.
[8]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
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[10]	遇呈祥, 刘乐洪, 李文博, 陈金石, 冉春雷, 王忠平. 脊柱和骨盆矢状位参数与椎体成形治疗胸腰椎骨质疏松性椎体压缩骨折预后的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1412-1417.
[11]	庄至坤, 吴荣凯, 林行会, 龚志兵, 张前进, 魏秋实, 张庆文, 吴昭克. 稳定增强型内衬髋关节系统在偏瘫老年股骨颈骨折全髋关节置换中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1429-1433.
[12]	李灿辉, 吴征杰, 曾焰辉, 何影浩, 司徒晓鹏, 杜雪莲, 洪石, 何家雄. 骨科手术机器人辅助与传统透视下经皮骶髂螺钉置入的优劣分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1434-1438.
[13]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[14]	吕依妍, 李寒冰, 马晓庆, 张晗, 张宇航, 李根林. 采用复合因素建立内热消渴小鼠模型的特点分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1187-1193.
[15]	陈世坚, 李舸, 张钰, 关雅伦, 李雪娇, 刘书华, 李永超, 李韵峰, 高金风, 魏小月, 赵宇红. MPTP诱导帕金森病小鼠亚急性与慢性模型的比较及评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1247-1252.