红车轴草提取物对破骨细胞骨吸收及分化的作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3129-3134.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.003

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红车轴草提取物对破骨细胞骨吸收及分化的作用机制

李扬¹，王德平²，艾东³，魏鑫³，关利新³，关悦²

牡丹江医学院附属红旗医院，¹骨科，²内分泌科，黑龙江省牡丹江市 157011；³牡丹江医学院，黑龙江省牡丹江市 157011

修回日期:2017-05-23 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 关悦，硕士，主治医师，牡丹江医学院附属红旗医院内分泌科，黑龙江省牡丹江市 157011
作者简介:李扬，男，1983年生，黑龙江省牡丹江市人，汉族，2007年佳木斯大学毕业，硕士，主要从事骨质疏松研究。

Effect of Trifolium pratense L. extracts on the bone resorption and osteogenic differentiation of osteoclasts and the underlying mechanisms

Li Yang¹, Wang De-ping², Ai Dong³, Wei Xin³, Guan Li-xin³, Guan Yue²

¹Department of Orthopedics, ²Department of Endocrinology, Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China; ³Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China

Revised:2017-05-23 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Guan Yue, Master, Attending physician, Department of Endocrinology, Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China
About author:Li Yang, Master, Department of Orthopedics, Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
红车轴草：红车轴草为豆科三叶草草本植物，主要含有黄酮类、多糖和蛋白质等化学成分。黄酮类中异黄酮为主要成分，现代研究发现红车轴草异黄酮具有抗癌、植物雌激素样作用、降血脂和抗炎等作用；民间采用红车轴草花序煎剂祛痰、治感冒和肺结核、利尿和消炎，外敷治脓肿、烧伤和眼疾等，并有应用花、种子、植株及根部制膏、浸膏、糊剂、煎剂和泡茶饮用，对于骨质疏松有一定的防治作用。
破骨细胞：破骨细胞来源于骨髓单核髓系造血干细胞，是唯一的骨吸收细胞，在骨代谢过程中起着至关重要的作用，骨代谢中骨吸收受到细胞因子、转录因子和淋巴细胞对破骨细胞的直接调节，也可以通过成骨细胞间接调节破骨细胞分化；在临床中破骨细胞与骨质疏松、类风湿性关节炎等许多疾病发生有关，阐明破骨细胞的分化及功能机制，可以为相关临床疾病的治疗提供新的靶点和思路。

摘要
背景：最近研究发现红车轴草异黄酮能够通过提高雌激素作用，有效抑制骨吸收，降低骨转化率，增强成骨细胞活性及骨密度，对骨质疏松具有一定的防治作用。
目的：观察红车轴草提取物对破骨细胞骨吸收及分化的作用影响。
方法：提取大鼠骨髓腔细胞，用淋巴细胞分离液分离细胞，培养5 h后，取未贴壁细胞加入30 μg/L巨噬细胞集落刺激因子和75 μg/L核因子κB受体活化因子配体诱导细胞(对照组)，将不同质量浓度(0.3，0.6和1.2 g/L)的红车轴草提取物加入诱导的破骨细胞中，观察不同质量浓度的红车轴草提取物对破骨细胞分化与骨吸收作用；采用Western bloting法测定破骨细胞分化相关蛋白c-fos和NFATcl的含量。
结果与结论：①与对照组比较，不同质量浓度的红车轴草提取物能够不同程度的抑制破骨细胞分化和骨吸收；②抗酒石酸酸性磷酸酶染色发现红车轴草提取物能够明显降低破骨细胞数目；③Western blotting 结果表明红车轴草提取物能够抑制破骨细胞分化相关蛋白c-fos和NFATC1表达；④结果提示，红车轴草提取物能够抑制破骨细胞分化及骨吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0395-6692(李扬)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨质疏松, 破骨细胞分化, 骨吸收, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 骨陷窝, NFATC1, c-fos, 红车轴草

Abstract:

BACKGROUND: Isoflavone isolated from Trifolium pratense L. has been found to be able to effectively inhibit bone resorption, reduce bone turnover rate, improve osteocyte activity and bone mineral density by enhancing the effect of estrogen, which is helpful for the prevention and treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Trifolium pratense L. extracts on the bone resorption and differentiation of osteoclasts.
METHODS: Rat bone marrow cells were extracted, isolated by lymphocyte separation and cultured for 5 hours; then, the non-adherent cells were selected followed by induced by 30 μg/L macrophage colony stimulating factor and 75 μg/L RANKL (control groups), or different concentrations of Trifolium pratense L. extracts (0.3, 0.6 and 1.2 g/L) to observe their effect on the osteoclast differentiation and bone resorption. The levels of osteoclast differentiation-associated proteins c-fos and NFATcl were determined by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, different concentrations of Trifolium pratense L. extracts could suppress osteoclast differentiation and bone resorption to different degrees. Tartrate-resistant acid phosphatase staining showed that Trifolium pratense L. extracts could significantly reduce the number of osteoclasts. Western blot assay results suggest that Trifolium pratense L. extracts significantly inhibited the expression levels of c-fos and NFATcl. These results reveal that Trifolium pratense L. extracts can inhibit osteoclast differentiation and bone resorption.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoclasts, Cell Differentiation, Lotus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李扬，王德平，艾东，魏鑫，关利新，关悦. 红车轴草提取物对破骨细胞骨吸收及分化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3129-3134.

Li Yang, Wang De-ping, Ai Dong, Wei Xin, Guan Li-xin, Guan Yue. Effect of Trifolium pratense L. extracts on the bone resorption and osteogenic differentiation of osteoclasts and the underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3129-3134.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年8月至12月在黑龙江中医药大学妇科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 5周龄SD大鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.3.2 药品及试剂 α-MEM基础培养基(Hyclone公司)；FBS胎牛血清(GIBCO公司)；康宁公司骨表面多孔板；红车轴草提取物购自西安昌岳植物化工有限公司(黄酮类化合物含量在80%以上)；核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)因子(PEPROTECH公司)，巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF) (PEPROTECH，公司)；青霉素-链霉素溶液(北京夏斯生物科技有限公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色(sigma-aldrich. NO387)；Anti-c-Fos抗体(abcam公司)，Anti-NFATC1抗体(rockland公司)。

1.4 方法

1.4.1 破骨细胞的分离、培养^[14-15] 5周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，用体积分数75%的乙醇浸泡10 min，相对无菌条件下取双侧股骨及胫骨，置入PBS中清洗3次，去其两端，用含体积分数15%胎牛血清及30 μg/L M-CSF的α-MEM培养液5 mL，冲洗骨髓腔至其内表面颜色发白；反复吹打冲洗液制备细胞悬液。上述细胞悬液按1∶1比例缓慢铺于淋巴细胞分离液上，1 800 r/min离心10 min，取中间单个核细胞层加入等量无血清α-MEM，1 000 r/min离心5 min，弃上清后以含体积分数10%胎牛血清及30 μg/L M-CSF的α-MEM培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁷L^-1，接种于25 cm²培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO₂，饱和湿度条件下孵育5 h；收集上述孵育后的非黏附细胞，换用体积分数15%的胎牛血清、30 μg/L M-CSF、75 μg/L RANKL、1%青链霉素的α-MEM培养液继续培养14 d后抗酒石酸酸性磷酸酶染色证实所培养的细胞为破骨细胞。

1.4.2 破骨细胞计数与抗酒石酸酸性磷酸酶染色 取96孔板培养接种破骨细胞，共4组，每组8孔。静置5 h，去上清液，用30 μg/L M-CSF加75 μg/L RANKL细胞因子诱导培养，并分别加入质量浓度0.3，0.6和1.2 g/L 的红车轴草提取物，14 d培养后，观察细胞核≥2个的细胞为破骨细胞，进行破骨细胞计数，40 g/L多聚甲醛固定5 min，用双蒸水反复冲洗，后加5 µL Fast garnet GBC Base solution和5 µL Sodium Nitrite Solution，混匀30 s，室温静置2 min，滴入450 µL 37 ℃重蒸水，Naphthol AS-BI Phosphate Solution5 µL，滴入Acetate Solution20 µL，Tartrate Solution 10 µL，均入孔板后避光静置2 h后用双蒸水彻底冲洗，在镜下观察。

1.4.3 骨吸收陷窝计数和面积测量 使用康宁公司的骨表面多孔板，加入未诱导的破骨细胞，后在培养箱条件下共2 d后，加入30 μg/L M-CSF+75 μg/L RANKL细胞因子并分别加入质量浓度0.3，0.6和1.2 g/L 的红车轴草提取物，随后继续培养14 d后超声去除细胞，自然干燥24 h后照相并采用软件分析，图像分析采用Media Cybernetics，Silver Spring，MD，U.S.A.。

1.4.4 Western blotting法检测破骨细胞c-fos，NFATC1蛋白表达 将质量浓度为1.2 g/L的红车轴草提取物作用于破骨细胞，对照组加入正常培养液，培养14 d后，提取各组细胞总蛋白，进行蛋白定量，经SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温孵育2 h后，加入一抗工作液，4 ℃过夜，TBS-T缓冲液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室温孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法显色。凝胶成像系统拍照并分析。

1.5 主要观察指标 ①破骨细胞计数与抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察；②骨吸收陷窝计数和面积测量；③Western blot分析破骨细胞c-fos和NFATC1蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS19.0 进行统计学分析，所有数据用x(_)±s表示，两两比较采用t 检验，组间比较采用ANOVA-One Way检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨质疏松是一种骨代谢疾病，其主要发病机制是破骨细胞的过度激活，导致破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成动态平衡被打破，引起骨量丢失和骨结构改变。破骨细胞的形成和活化是发挥生理作用的基础，其形成受到多方面的调节，包括细胞因子、转录因子及淋巴细胞等^[16-20]。

转录因子NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1)是NFAT转录因子家族成员之一，首次在T淋巴细胞中发现具有调节多种生理活性的作用，其中该转录因子是破骨细胞成熟的关键调节分子，参与破骨细胞的形成和活化，是抵抗破骨细胞过度激活的首要靶点^[21-27]。

c-fos是即刻早期基因(IEGs)家族成员之一，对外界刺激如激素和神经递质等能够迅速做出反应，在破骨细胞分化过程中c-fos是一种不可或缺的RANKL下游调控因子，通过启动下游的NFATc1调节破骨细胞特异性基因表达^[28-30]，促进破骨细胞分化成熟。故本研究以c-fos和NFATc1表达变化评价破骨细胞分化情况。

破骨细胞为多核细胞，在骨吸收过程中扮演着重要的作用，目前检测破骨细胞骨吸收功能的常用检测手段为骨吸收陷窝形态分析法，破骨细胞黏附在骨基质表面形成局部微环境，从而发挥骨吸收功能，进而形成吸收陷窝^[31-32]。该方法能够通过数量、大小及深度直接反映破骨细胞骨吸收能力。

在民间采用红车轴草花序煎剂祛痰、治感冒和肺结核、利尿和消炎，外敷治脓肿、烧伤和眼疾等，并有应用花、种子、植株及根部制膏、浸膏、糊剂、煎剂和泡茶饮用，具有抗肿瘤、胃溃疡、胃癌、乳腺癌及肠癌等功效^[11^，^33-38]。

国内外对红车轴草的提取物的药理作用的研究日益深入，发现其含有雌激素样及黄酮类物质，可以用于治疗更年期综合症、骨质疏松症、乳腺癌、抗氧化、抗病毒及治疗心血管疾病等多种药理作用，同时研究表明心脑血管系统疾病和雌激素异常均对骨质疏松存在着很多联系，血管钙化和骨形成之间也存在很多相似的细胞和分子机制^[39-41]。

本研究通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色的结果表明给予破骨细胞红车轴草提取物能够明显减少抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性结果的数目，随着红车轴草提取物质量浓度的增加抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性结果数目明显减少；同时骨陷窝形态学分析发现红车轴草提取物能够降低破骨细胞骨陷窝吸收数目和面积，且随着红车轴草质量浓度的增加抑制破骨细胞骨吸收作用增强，该结果表明红车轴草能够抑制破骨细胞的骨吸收及降低前体破骨细胞向破骨细胞分化。

本项目在研究红车轴草提物对破骨细胞数目及骨吸收过程中采用0.3 g/L、0.6 g/L和1.2 g/L 3个红车轴草提取物质量浓度，比较不同剂量红车轴草对破骨细胞影响，发现随着红车轴草剂量的增加对破骨细胞的抑制作用增加，因此破骨细胞相关分化蛋白研究采用1.2 g/L红车轴草剂量进行研究。破骨细胞给予红车轴草提取物连续培养14 d，测定破骨细胞分化相关蛋白NFATc-1和c-fos结果发现，给予红车轴草提取物能够明显降低NFATc-1和c-fos蛋白的表达，说明红车轴草提取物可能通过降低NFATc-1和c-fos蛋白的表达，进而抑制破骨细胞分化。

结论：采用破骨细胞作为研究对象，通过观察红车轴草提取物对破骨细胞分化及骨吸收研究发现红车轴草提取物能够抑制破骨细胞分化和骨吸收，可能的机制是红车轴草提取物抑制NFATc-1和c-fos蛋白表达，进而抑制破骨细胞的分化及吸收。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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