低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (18): 2828-2833.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.18.007

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低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响

陈宇雄¹，陈贤哲¹，倪梦杉¹，郭文杰¹，田京²

¹南方医科大学第二临床医学院，广东省广州市 510282；²南方医科大学珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282

收稿日期:2017-04-01 出版日期:2017-06-28 发布日期:2017-07-07
通讯作者: Tian Jing, Professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Orthopedics Center, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
作者简介:陈宇雄，男，1994年生，广东省江门市人，南方医科大学本科在读。
基金资助:
广东省大学生科技创新培育专项资金(pdjh2016b0104)；广东省科技计划项目(2013B021800312)

Effect of low-frequency pulsed electromagnetic fields on proliferation and osteogenic ability of human adipose-derived stem cells in a three-dimensional scaffold

Chen Yu-xiong¹, Chen Xian-zhe¹, Ni Meng-shan¹, Guo Wen-jie¹, Tian Jing²

¹The Second Clinical Medical College, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China; ²Orthopedics Center, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Received:2017-04-01 Online:2017-06-28 Published:2017-07-07
Contact: 田京，教授，副主任医师，硕士生导师，南方医科大学附属珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282
About author:Chen Yu-xiong, the Second Clinical Medical College, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific Innovative Culture Fund for the Undergraduate in Guangdong Province, No. pdjh2016b0104; the Scientific Research Plan of Guangdong Province, No. 2013B021800312

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脉冲电磁场的生物效应：具有一定的场强、频率、时间依赖性，但并非简单的线性关系，另外间充质干细胞对脉冲电磁场不同场强和频率的反应具有“窗口效应”。Cheng 等用1.4-2.2 mT范围场强、50 Hz正弦电磁场暴露大鼠骨髓间充质干细胞，发现1.8 mT具有最强的诱导成骨分化作用。Luo等通过1.1 mT、不同频率的脉冲电磁场诱导人类骨髓间充质干细胞，发现50 Hz诱导其成骨分化效果最显著。Jansen 等认为脉冲电磁场刺激人骨髓间充质干细胞成骨分化具有时间依赖效应，在体外干预间充质干细胞第9，14天骨形态发生蛋白2、骨保护素等多项指标才有所变化。Yang等对SD大鼠的间充质干细胞也持续观察到21 d，才观察到显著的成骨效应，而Tsai等实验中对人骨髓间充质干细胞的照射时间长达28 d才发现成骨活动的峰值。尽管各个实验的结果存在一定的差异性，但都证实了脉冲电磁场的促增殖和成骨分化作用。

背景：目前已有较多实验研究证实低频脉冲电磁场在二维支架下促进多种干细胞向成骨细胞分化，但鲜有研究磁场在三维支架下对干细胞的增殖及成骨分化的影响。
目的：探讨在聚已内酯3D培养支架环境下，外加低频脉冲电磁场对人脂肪源干细胞增殖及成骨分化的影响。
方法：将第3代人脂肪源干细胞接种于聚已内酯3D培养支架上，分2组培养，实验组给予50 Hz、1 mT的低频脉冲电磁场干预，2 h/d，连续干预14 d；对照组不给于低频脉冲电磁场干预。培养7 d后，Live/Dead染色观察细胞存活情况；培养1，3，5，7 d后，MTT法检测细胞增殖；培养7，14 d，碱性磷酸酶染色及qRT-PCR检测细胞成骨分化水平。
结果与结论：①Live/Dead染色：人脂肪源干细胞已长入到支架材料的空隙结构内部，在材料中可保持较高的活性；②细胞增殖：随着培养时间的延长，两组细胞A值均逐渐升高，实验组培养1，3 d的细胞A值高于对照组(P < 0.05)；③碱性磷酸酶染色：实验组培养7，14 d的碱性磷酸酶阳性染色强于对照组；④qRT-PCR检测：培养7 d时，实验组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达量高于对照组(P < 0.01)；培养14 d时，实验组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达量均明显高于对照组(P < 0.05)；⑤结果表明：在聚已内酯3D培养支架环境下，外加低频脉冲电磁场可促进人脂肪源干细胞的增殖及成骨分化。

ORCID: 0000-0001-8353-9551(陈宇雄)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚已内酯3D培养支架, 低频脉冲电磁场, 人脂肪源干细胞, 增殖, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays increasing experimental findings have proved that the low-frequency pulsed electromagnetic fields (LPEMF) can induce osteogenic differentiation of a variety of stem cells in the two-dimensional scaffold. However, little is reported on the LPEMF effect on the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells in the three-dimensional scaffold.
OBJECTIVE: To investigate the effect of LPEMF on the proliferation and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hASCs) in the 3D Insert-PCL scaffold.
METHODS: Passage 3 hASCs were directly cultured in the 3D Insert-PCL scaffolds followed by LPEMF (50 Hz, 1 mT) exposure, 2 hours per day, for continuous 14 days (experimental group) or no intervention (control group). After 7 days of culture, Live/Dead staining was used to observe cell survival. After 1, 3, 5, 7 days of culture, MTT assay was used to detect cell proliferation. After 7 and 14 days of culture, the osteogenic differentiation of hASCs was assessed through the alkaline phosphatase (ALP) staining and qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Live/dead cell staining proved that the hASCs had a good growth in the 3D Insert-PCL scaffolds as well as a high survival rate. The absorbance values of hASCs in the two groups were increased gradually with time, and the absorbance value in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 1 and 3 days after culture (P < 0.05). The ALP activity in the experimental group was stronger than that in the control group at 7 and 14 days after culture. qRT-PCR findings showed that at 7 days after culture, the mRNA levels of ALP and type I collagen were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.01), while at 14 days after culture, the mRNA levels of osteopontin, Runt-related transcription factor, ALP and type I collagen were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). To conclude, the LPEMF exposure can promote the proliferation and osteogenic differentiation of hASCs cultured on the the 3D Insert-PCL scaffold.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Electromagnetic Fields, Stem Cells, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈宇雄，陈贤哲，倪梦杉，郭文杰，田京. 低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(18): 2828-2833.

Chen Yu-xiong, Chen Xian-zhe, Ni Meng-shan, Guo Wen-jie, Tian Jing.

Effect of low-frequency pulsed electromagnetic fields on proliferation and osteogenic ability of human adipose-derived stem cells in a three-dimensional scaffold [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(18): 2828-2833.

图/表（结果） 4

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引言

骨缺损是临床治疗过程中的常见疾病，传统治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植和生物材料植入等^[1-2]，但多种因素限制其在临床的应用。利用骨组织工程构建具有生理功能的骨组织是骨缺损修复的全新治疗模式^[3]。骨组织工程的3个基本要素是种子细胞、细胞因子、支架材料，其过程是将体外培养良好的种子细胞接种到合适的支架材料上并移植入体内，最终达到修复骨缺损的目的^[4]。

选择合适的种子细胞是组织工程成功的关键。脂肪源干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞，具有较强的自我更新及多向分化能力。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪源干细胞更易获取，扩增更快、可塑性更强，更适合临床和实验的应用^[5]。有研究表明，脂肪源干细胞比骨髓间充质干细胞更易成骨，可能与Notch信号的相关蛋白表达水平有关^[6]。因而脂肪源干细胞是骨组织工程治疗骨缺损的可靠的种子细胞来源。

作为骨组织工程的重要组成部分，理想的支架材料应具备以下基本条件：生物相容性、生物可降解性^[7]、合适的孔径和孔隙率^[8-10]。此外，有研究表明二维细胞培养体系限制了细胞间的信息交流，影响细胞增殖分化^[11]。三维环境下培养细胞能够最大程度地模拟体内情形，使细胞呈现出空间立体生长的模式，形成类似体内的组织结构^[12-13]。实验选用的是聚已内酯3D培养支架，聚己内酯是FDA批准的多种移植材料中的一种生物可降解聚合物，具有合适的孔径及孔隙率，被广泛应用于药物载体、组织工程研究等。

目前体外化学诱导人脂肪源干细胞成骨分化的技术多种多样，包括利用细胞因子、化学试剂或中草药提取物等，如目前广泛应用的成骨诱导液配方包括地塞米松或1，25-二羟基维生素D3、抗坏血酸，β-甘油磷酸钠等^[5]，但诱导分化效率不高且操作繁琐、存在生物安全性问题及价格昂贵等弊端，故如何提高种子细胞成骨分化效率是目前亟需解决的问题。脉冲电磁场作为一种物理干预手段，具有无创性，操作简便，适用范围广，无并发症等诸多优点，在骨科的应用日趋广泛^[14-15]，尤其是在利用组织工程治疗骨缺损方面取得了满意的疗效。目前已有较多实验研究证实低频脉冲电磁场(low-frequency pulsed electromagnetic fields，LPEMF)在二维支架下可以促进种子细胞成骨分化，但鲜有研究LPEMF在三维支架下对种子细胞增殖及成骨分化的影响。实验旨在探讨LPEMF在模拟体内生理环境(聚已内酯3D培养支架)对人脂肪源干细胞的增殖及成骨分化的影响，以人脂肪源干细胞作为研究对象，设置频率为50 Hz、1 mT的脉冲电磁场环境，实验组经过脉冲电磁场处理，对照组不经过脉冲电磁场处理，通过检测成骨分化过程中相关基因表达量的变化，探讨脉冲电磁场环境能否提高人脂肪源干细胞成骨分化的效率。经过LPEMF体外干预，如能提高种子细胞成骨分化的效率，无疑是为骨组织工程提供了一种新的简洁、安全、有效的物理诱导方法，避免了外源性化学诱导剂的使用，提高成骨的安全性，同时将为临床植入“活骨”开辟新的途径^[16-17]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学水平，对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至11月在南方医科大学生命科学楼人体解剖学教研室完成。

1.3 材料人脂肪源干细胞、聚已内酯3D培养支架(广州赛业)；细胞培养基：L-DMEM+体积分数10%胎牛血清+青霉素100 U/mL+链霉素100 mg/L，pH=7.2(美国Gibco)；CCK-8(日本同仁)；BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒(江苏碧云天)；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR检测试剂盒(日本Takara)；Live/Dead染色试剂盒(美国GeneCopoeia)；聚已内酯3D培养支架(美国Biotek)；脉冲电磁场(湖南永逸科技)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪源干细胞的培养聚已内酯3D培养用含有体积分数10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基将细胞接种到培养皿上，37 ℃、体积分数5%CO₂的条件下在孵箱中培养，每3 d更换新的培养基。当细胞融合度达到70%-80%时，用胰酶-EDTA(0.25%)将细胞消化，按1∶3进行传代。

1.4.2 细胞支架复合体的构建将聚已内酯3D培养支架置于24孔培养板中，随机分为实验组和对照组，用胰蛋白酶消化第3代人脂肪源性干细胞，将20 μL的1×10¹⁰ L^-1的细胞悬液接种于两组支架材料中，实验组经50 Hz、1 mT的LPEMF干预，2 h/d，连续干预14 d；对照组不经LPEMF处理，置入37 ℃、体积分数5%CO₂的孵箱中培养，每隔 2 d换液。

1.5 主要观察指标

Live/Dead染色：将细胞支架复合体在孵箱中普通培养7 d后，用PBS冲洗支架材料3次，按照Live/Dead试剂盒说明书进行染色，用荧光显微镜观察、拍照。

CCK-8检测细胞增殖情况：两组细胞支架复合体处理1，3，5，7 d后，按照CCK-8试剂盒说明书配制工作液，每100 μL培养基中含10 μLCCK-8，以换液的形式加入到实验组和对照组的24孔板中，在孵箱中孵育3 h。每片材料设置3个平行对照，每孔取200 μL待测液加入96孔培养板中，使用酶标仪检测450 nm波长时的A值，实验重复3次。

碱性磷酸酶染色：两组细胞支架复合体7，14 d后，用PBS冲洗架材料3次，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书分别对实验组和对照组进行染色后拍照。

RNA的提取及qRT-PCR检测：处理7，14 d后，提取两组细胞支架中人脂肪源干细胞的RNA，将其反转录成cDNA后，qRT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2及碱性磷酸酶的基因表达。

1.6 统计学分析采用SPSS13.0 软件进行分析，组间比较采用两独立样本t 检验。实验数据用x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

组织工程的兴起为临床上治疗骨缺损提供了新的方向，但组织工程规模化应用于临床仍需要解决种子细胞在支架材料中的活性问题及能否有效发挥成骨分化作用。研究选用具有合适孔径与孔隙率的聚已内酯3D培养支架，使用人脂肪源干细胞作为种子细胞进行组织工程骨的构建，在体外检测了人脂肪源干细胞在支架内的存活情况，并应用了频率为50 Hz、磁感应强度为1 mT的LPEMF对接种于聚已内酯3D培养支架中的人脂肪源干细胞进行处理，观察磁场对其增殖及成骨分化的影响。实验结果表明LPEMF刺激能够促进接种于聚已内酯3D培养支架中的人脂肪源干细胞的增殖及成骨分化。

2001年，Zuk等^[18]通过脂肪抽吸术获得脂肪来源的多能干细胞。脂肪源干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似表面标志物，同时具有与骨髓间充质干细胞相似的分化能力，在体内表达特殊的干细胞标志物^[19]。此外，人脂肪源干细胞取材便利、创伤小、可反复取材、细胞分离过程简便，并且其细胞质量及分化潜能不随年龄增长而下降，这为骨组织工程提供了重要的种子细胞来源，与骨髓间充质干细胞相比似乎更具优势，已成为组织工程种子细胞的研究热点^[20-21]。脂肪干细胞具有良好的多向分化潜能，在一定的培养条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌肉细胞等分化。实验采用含有体积分数10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基进行培养，利用脉冲电磁场照射，诱导其成骨分化。人脂肪源干细胞在向成骨细胞诱导分化后可表达成骨细胞众多基因，诸如骨桥蛋白、碱性磷酸酶、成骨素、骨结合素、骨唾液蛋白、骨形态发生蛋白受体Ⅰ和Ⅱ、骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、PTⅡ-受体和Runt相关转录因子2^[22-23]。由此也证明人脂肪源干细胞成骨分化是多种基因、蛋白和信号通路相互作用的复杂过程，但其具体机制有待进一步研究^[24]。

脉冲电磁场的生物效应具有一定的场强、频率、时间依赖性，但并非简单的线性关系，另外间充质干细胞对脉冲电磁场不同场强和频率的反应具有“窗口效应”。Cheng 等^[25]用1.4-2.2 mT范围场强，50 Hz正弦电磁场暴露大鼠骨髓间充质干细胞，发现1.8 mT具有最强的诱导成骨分化作用。Luo等^[26]通过1.1 mT、不同频率的脉冲电磁场诱导人类骨髓间充质干细胞，发现50 Hz诱导其成骨分化效果最显著；然而Liu等^[27]采用1 mT正弦电磁场以10，30，50，70 Hz施用到大鼠骨髓间充质干细胞，早期阶段的成骨分化标志物碱性磷酸酶和骨钙素在10 Hz表达显著上调，晚期成骨分化标志基因的表达却在50 Hz升高显著。Jansen等^[28]认为脉冲电磁场刺激人骨髓间充质干细胞成骨分化具有时间依赖效应，在体外干预间充质干细胞第9，14天骨形态发生蛋白2、骨保护素等多项指标才有所变化。Yang等^[29]对SD大鼠的间充质干细胞也持续观察到21 d，才观察到显著的成骨效应，而Tsai等^[30]实验中对人骨髓间充质干细胞的照射时间长达28 d才发现成骨活动的峰值。尽管各个实验的结果存在一定的差异性，但都证实了脉冲电磁场的促增殖和成骨分化作用。差异性也提示在脉冲电磁场的参数选择时仍需考虑磁场波形、细胞来源、接种密度及培养环境等因素。实验选取的脉冲电磁场频率为50 Hz、磁感应强度为1 mT，通过碱性磷酸酶染色初步判断脉冲电磁场有利于人脂肪源干细胞的成骨分化。实验进一步选取成骨分化过程中相关基因Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶及Runt相关转录因子2，应用Real-time PCR检测脉冲电磁场环境对人脂肪源干细胞成骨分化过程中相关基因相对量的实时变化。Real-time PCR检测结果显示，在第7，14 天时，实验组培养的人脂肪源干细胞成骨分化相关标志基因的相对量显著高于对照组。脉冲电磁场促进间充质干细胞成骨分化是一个有序的、精密调控的程序化过程，通过一系列信号转导途径实现调控。目前研究较多的成骨分化信号通路包括转化生长因子β/Smad信号转导通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的通路、Wnt信号通路。Lin等^[31]报道脉冲电磁场可激活Wnt信号通路，提高Wnt1、Wnt3a、Wnt10b、Fzd9、ALP、Bmp2等基因的表达，在照射磁场5 d后还能抑制骨硬化蛋白基因的表达。Zhou等^[32]也发现 8 Hz、3.8 mT的脉冲电磁场可激活Wnt信号通路，促进间充质干细胞的成骨分化。实验也证实脉冲电磁场环境可上调Runt相关转录因子2基因表达，Runt相关转录因子2因子是成骨分化信号转导通路重要中介调节者^[33]。另外，Petecchia等^[34]研究发现脉冲电磁场照射可提高细胞内Ca²⁺浓度，Ca²⁺作为第二信参与多种信号转导通道，调控成骨分化过程。然而脉冲电磁场促进间充质干细胞成骨分化过程中的信号转导通路具有复杂性和网络性，深入的机制有待进一步的研究。

目前多数骨组织工程的研究局限于二维支架环境中，然而罕有关于三维支架的研究。Roskies等^[35]研究表明，用聚醚醚酮有机材料构建的3D打印支架结合间充质干细胞克服了原有支架难以与相邻骨组织有效连接的问题。另外，有综述表明3D打印支架结合人脂肪源干细胞可促进成骨分化，有效修复骨缺损^[36]。可能的原因在于3D支架供了与生物环境类似的三维微环境，该环境有助于细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质问的信号传导，能为细胞在支架内生长提供其所需氧气及养份的化学梯度，其孔隙及通透性等结构为氧气、养份及分泌物等提供了条件。本实验引入聚已内酯3D培养支架，通过Live/Dead染色表明该支架与人脂肪源干细胞相容性好，细胞在支架上生长良好，能够正常增殖。

综上所述，人脂肪源干细胞能在聚已内酯3D培养支架环境中保持良好的生物活性，并且频率为50 Hz、磁感应强度为1 mT的LPEMF可显著促进接种于聚已内酯3D培养支架中人脂肪源干细胞的增殖和成骨分化，这为解决骨组织工程中种子细胞在支架材料中的活性问题，以及能否充分发挥成骨分化作用提供实验观测依据，未来还需要更多对相关分子机制和动物体内骨缺损修复能力进行深入探讨的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

低频脉冲电磁场在三维支架下对人脂肪源干细胞增殖和成骨分化的影响

Effect of low-frequency pulsed electromagnetic fields on proliferation and osteogenic ability of human adipose-derived stem cells in a three-dimensional scaffold

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