比较叶酸和聚乳酸修饰Pluronic共聚物纳米粒子的细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.014

摘要/Abstract

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文题释义：
聚乳酸：由多个乳酸分子通过两端的-OH和-COOH脱水缩合形成，也称为聚丙交酯，属于聚酯家族，降解产物为H₂O和CO₂，中间产物乳酸也参与体内糖代谢过程，具有良好的生物相容性、生物可降解性，常应用于组织工程以及药物载体的修饰。
Pluronic：是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯组成的三嵌段共聚物，在水溶液中能自发生成多分子聚集形成胶束，聚氧乙烯构成疏水内核、聚氧丙烯构成亲水性的外壳，形成的胶束可以有效地增加疏水性药物的溶解度。

背景：研究发现，纳米材料与细胞接触时可诱导细胞产生氧化应激反应、过敏反应，进而产生细胞毒性和基因毒性，因此，对纳米毒理学的研究越来越受到广泛的关注。
目的：比较Pluronic(P85，F127和F87)三嵌段共聚物经叶酸(folic acid，FA)和聚乳酸[poly(lactic acid)，PLA]修饰前后的纳米结合物的细胞相容性。
方法：对Pluronic三嵌段共聚物(P85，F127和F87)进行修饰，在其两端接上聚乳酸和叶酸，分别合成了多种两亲性嵌段共聚物(PLA-P85-PLA，FA-P85-PLA，PLA-F127-PLA，FA-F127-PLA，PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA)纳米粒子。选取HepG-2细胞为研究对象，从细胞形态、细胞代谢活性、细胞膜效应来评价纳米粒子的细胞毒性。
结果与结论：①未经叶酸和聚乳酸修饰的P85，F127和F87纳米粒子(5，10，20，50，100 mg/L)作用HepG-2细胞24 h后，与对照组相比，细胞相对增长率差异无显著性意义(P > 0.05)，且在低质量浓度范围内(5，10，20，50 mg/L)有促进细胞增殖的作用；当质量浓度增加到400 mg/L时，P85和F87纳米粒子对细胞增殖有明显的抑制作用；②经叶酸和聚乳酸修饰的P85，F127和F87纳米粒子(5，10，20，50，100，200，400 mg/L)作用HepG-2细胞后，与对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)；③结果表明，用叶酸和聚乳酸修饰Pluronic(P85，F127和F87)三嵌段共聚物，可提高其细胞相容性，合成的PLA-Pluronic-PLA纳米粒子和FA-Pluronic-PLA纳米粒子可用作药物载体。

ORCID: 0000-0002-7129-3862(黄寒)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 叶酸, 聚乳酸, Pluronic, 共聚物, 纳米粒子, 细胞相容性, HepG-2细胞, 药物载体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cells in contact with nanomaterials can induce oxidative stress, allergic reactions, and then produce cytotoxicity and genotoxicity. Therefore, studies on nano toxicology have attracted more and more attention.
OBJECTIVE: To comparatively evaluate the cytocompatibility of Pluronic (P85, F127, F87) tri-block copolymer nanoparticles modified with folic acid (FA) and polylactic acid (PLA).
METHODS: Pluronic (P85, F127, F87) tri-block copolymer nanoparticles were modified with FA and PLA to synthesize a variety of amphiphilic block copolymers, including PLA-P85-PLA, FA-P85-PLA, PLA-F127-PLA, FA-F127-PLA, PLA-F87-PLA and FA-F87-PLA. The cytotoxicity of these synthesized nanoparticles was analyzed by cell morphology, cell metabolic activity and cell membrane effects in HepG-2 cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The relative growth rate of HepG-2 cells had no significant differences under 24-hour induction of various concentrations (5, 10, 20, 50, 100 mg/L) of unmodified P85, F127, and F87 nanoparticles (P > 0.05). The growth and proliferation of cells under the low concentrations (5, 10, 20, 50 mg/L) were enhanced. P85 NPs and F87 NPs could significantly inhibit cell viability at dose of 400 mg/L. In contrast, there were no significant differences towards P85, F127 and F87 nanoparticles (5, 10, 20, 50, 100, 200, 400 mg/L) modified with FA and PLA when compared with the control group (P > 0.05). These findings indicate that the modification of FA and PLA can improve the cytocompatibility of Pluronic (P85, F127, F87) tri-block copolymers, and therefore, PLA-Pluronic-PLA and FA-Pluronic-PLA nanoparticles are both good candidates for drug vectors.

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Key words: Nanoparticles, Folic Acid, Polymers, Lactic Acid, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄寒，胡庆娟，熊向源，葛祥军，陈冲，李玉萍. 比较叶酸和聚乳酸修饰Pluronic共聚物纳米粒子的细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(14): 2215-2221.

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图/表（结果） 5

2.1 纳米粒子的粒度采用动态激光光散射仪对制备的各种纳米粒子的粒度进行分析，结果如表1所示，聚合物在水中自组装形成的纳米粒子胶束的粒径在60-120 nm之间，粒度比较集中。

2.2 细胞形态学评价结果将不同质量浓度的纳米粒子与HepG-2细胞共同培养24 h后，选取每种材料的最高质量浓度的细胞形态进行比较观察(图1)，各实验组与空白对照组无明显差异，细胞形态正常，生长良好。但是高质量浓度(400 mg/L)F87纳米粒子处理后，HepG-2细胞有一定的圆缩漂浮，细胞数量与空白组相比有所减少。

2.3 细胞代谢活性评价结果用P85、PLA-P85-PLA和FA-P85-PLA纳米粒子处理24 h后，对细胞生存活力的影响如图2A所示，低质量浓度P85纳米粒子(5，10，20，50 mg/L)对HepG-2细胞的增殖有促进作用，高质量浓度的P85纳米粒子(100，200，400 mg/L)对HepG-2细胞的增殖有抑制作用(P < 0.01)，对应的细胞相对增殖率分别为90.4%，86.4%，88.2%；而经PLA和FA修饰的P85聚合物纳米粒子(PLA-P85-PLA NPs和FA-P85-PLA NPs)在100，200，400 mg/L条件下对应的细胞相对增殖率分别为101.9%，100.7%，94.9%和103%，100.6%，89.5%，与对照组相比，细胞增殖率差异无显著性意义 (P > 0.05)。

由图2B可知，F127、PLA-F127-PLA和FA-F127- PLA纳米粒子与HepG-2共同培养后，与对照组相比较，细胞相对活力差异无显著性意义(P > 0.05)，低质量浓度的纳米粒子可促进HepG-2细胞的生长，表现出良好的生物相容性。

由图2C可知，低质量浓度F87纳米粒子(5，10，20，50 mg/L)促进细胞生长，高质量浓度F87纳米粒子(100，200，400 mg/L)对HepG-2细胞生长有一定的抑制作用，其对应的细胞相对增殖率分别为84.8%，82.8%，55.4%，与细胞形态观察结果相一致(图1)；PLA-F87-PLA纳米粒子实验组与对照组相比较，细胞相对活力差异无显著性意义(P > 0.05)，但高质量浓度PLA-F87-PLA纳米粒子(400 mg/L)对细胞生长表现出一定的抑制作用(P < 0.01)；FA-F87-PLA纳米粒子可促进HepG-2细胞的生长。

2.4 中性红摄取实验结果由图3A可知，低质量浓度P85纳米粒子对细胞生长有促进作用，高质量浓度P85纳米粒子(400 mg/L)抑制细胞生长，其细胞相对增殖率为77.9%，与对照组相比差异有极显著性意义(P < 0.001)；PLA-P85- PLA纳米粒子表现促进生长的作用，在质量浓度为200 mg/L和400 mg/L时明显促进细胞增长，与空白对照组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)；FA-P85-PLA 纳米粒子对细胞增殖的影响与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，高质量浓度时对HepG-2细胞的增殖有抑制作用(P < 0.05)。

由图3B和3C可知，F127、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、F87、PLA-F87-PLA、FA-F87-PLA 纳米粒子处理组和对照组相比，HepG-2细胞对中性红染料的摄入量无显著性变化(P > 0.05)，高质量浓度FA-F127-PLA 纳米粒子条件下细胞对中性红染料的摄入量表现极显著性变化(P < 0.001)。

2.5 乳酸脱氢酶实验结果由图4可知，不同质量浓度的PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、F127、PLA-F127-PLA和FA-F127-PLA纳米粒子与HepG-2细胞共培养24 h后，乳酸脱氢酶的释放率与空白组相比较，差异无显著性意义 (P > 0.05)。

P85纳米粒子在质量浓度为200和400 mg/L时，与空白组相比，乳酸脱氢酶的释放量增加(P < 0.05)。PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子处理HepG-2细胞24 h后，明显抑制乳酸脱氢酶的释放(P < 0.01)；用 400 mg/L的F87纳米粒子处理时，乳酸脱氢酶的释放量增加非常明显(P < 0.001)。

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引言

随着纳米技术的不断发展，纳米粒子(Nanoparticles，NPs)作为药物和基因载体展现出巨大的应用前景。纳米粒子通常是指粒径在1-100 nm范围内的颗粒物质，包括无机物、脂质体、有机物。由于其特殊的尺寸结构，纳米粒子可以通过毛细血管，克服生理屏障，将药物输送至特定的器官、组织或细胞，从而延缓药物代谢，提高药效，降低药物对有机体的毒副作用^[1-3]。然而，纳米粒子在发挥抗肿瘤效应的同时，因其自身的体积效应、表面效应、小尺寸效应以及宏观量子隧道效应，导致纳米粒子产生异常的吸附、化学反应、分散和团聚能力，使得纳米颗粒可能表现出比大块材料更强的的毒理学反应^[4-5]。研究发现，当纳米材料与细胞接触时可诱导细胞产生氧化应激反应、过敏反应^[6]，进而产生细胞毒性和基因毒性^[7]，因此，对纳米毒理学的研究越来越受到广泛的关注。

聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO，Pluronic)为三嵌段共聚物，能在选择性溶剂中自发聚集形成胶束^[8]，被美国食品药品监督管理局(FDA)批准可以作为食品添加剂和医药材料，具有良好的生物相容性和低毒性，能逆转肿瘤的多药耐药性^[9]。

聚乳酸[poly(lactic acid)，PLA]是一类在生物体内能发生降解，被机体吸收并排泄的聚合物，具有良好的生物相容性、生物可降解性，常应用于组织工程以及药物载体的修饰。通过聚乳酸对药物载体的修饰，增加疏水链的长度，提高疏水性药物的包埋率，利用聚乳酸的可降解性，控制药物的释放，达到载体的缓释作用。

叶酸(folie acid，FA)由蝶岭、对氨基苯甲酸与L-谷氨酸组成，也称作维生素B9，可被还原成四氢叶酸参与氨基酸的代谢、嘌呤和嘧啶的从头合成。叶酸分子具有相对分子质量小、无免疫原性、易于修饰、与叶酸受体亲和力高等特点。研究发现，叶酸受体在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤组织中高度表达，而在正常组织表达量很低^[10]。因此，叶酸常用于靶向药物载体的修饰^[11-13]。

课题组已对Pluronic三嵌段共聚物(P85、F127和F87)进行修饰^[12-15]，在其两端接上聚乳酸和叶酸，分别合成了多种两亲性嵌段共聚物(PLA-P85-PLA，FA-P85-PLA，PLA-F127-PLA，FA-F127-PLA，PLA-F87- PLA和FA-F87-PLA)纳米粒子，以期作为药物缓释载体。从理论上讲，Pluronic和PLA的降解产物(乳酸)都能被机体清除，不存在对生物体的毒害作用。但是在高分子聚合物的合成或处理过程中存留的一些小分子物质，可能会产生毒性作用。因此，作者以肝癌HepG-2细胞为研究对象，从细胞形态、细胞代谢活性、细胞膜效应等3个方面比较研究了FA和PLA修饰处理前后的Pluronic纳米级聚合物的细胞相容性，为PLA-Pluronic-PLA、FA-Pluronic-PLA作为药物载体材料的医学应用提供一定理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计叶酸和聚乳酸修饰Pluronic共聚物纳米粒子的体外细胞相容性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10月至2016年3月在江西科技师范大学生命科学学院完成。

1.3 材料 HepG-2细胞(由南昌大学第一附属医院罗时文教授惠赠)；Pluronic P85、F127、F87(Basf公司惠赠)；PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、PLA-F127-PLA、FA-F127- PLA、PLA-F87-PLA、FA-F87-PLA聚合物(课题组自行合成)；DMEM干粉(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(Amresco公司)；Hepes、胰蛋白酶(上海Solarbio公司)；中性红(NUR)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒和青霉素-链霉素溶液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 纳米粒子的制备分别称取10 mg聚合物(P85、PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、F127、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、F87、PLA-F87-PLA、FA-F87-PLA)，溶解于2 mL四氢呋喃(THF)中，均匀分散于缓慢搅拌的10 mL超纯水中，装入截留相对分子质量为3 500的透析袋中进行透析，30 min后换水，随后每隔1 h换1次水，直至将分散体系中的四氢呋喃全部透析出去为止，透析完成后放于4 ℃冰箱保存。

1.4.2 细胞形态学评价 HepG-2细胞以5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于96孔板，37 ℃、体积分数为5% CO₂恒温培养箱培养24 h，设置空白组和实验组，空白组只添加DMEM完全培养液，实验组加入含不同质量浓度梯度纳米粒子的DMEM完全培养液(5，10，20，50，100，200， 400 mg/L)，分别处理24 h，倒置显微镜下观察P85、PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、F127、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、F87、PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子处理后的细胞形态改变。

1.4.3 细胞代谢活性评价细胞的前培养同方法1.4.2。9种纳米粒子分别处理24 h后，用PBS清洗，添加DMEM培养液，采用MTT法测定吸光度(492 nm)，与空白组进行比较，计算出各实验组的细胞相对增殖率。

1.4.4 细胞膜效应评价

中性红摄取实验：细胞的前培养同方法1.4.2。用制备的纳米粒子分别处理24 h后，按照中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书测定各组的中性红摄取量，计算细胞的相对增殖率。

乳酸脱氢酶实验：细胞的前培养同方法1.4.2。分别设置空白组、实验组和阳性对照组(经乳酸脱氢酶释放剂处理，空白组只添加DMEM无血清培养液，实验组加入含不同质量浓度梯度纳米粒子的DMEM无血清培养液(5，10，20，50，100，200，400 mg/L)，分别处理24 h，按照乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书测定培养液中乳酸脱氢酶的含量，计算经9种纳米粒子处理后HepG-2细胞的乳酸脱氢酶释放量。

1.5 主要观察指标各组不同质量浓度纳米粒子对HepG-2细胞形态、代谢活性、细胞膜效应的影响。

1.6 统计学分析实验数据采用Origin 8.0软件进行t 检验和方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

生物相容性是指材料与生命有机体的相互作用，不引起宿主产生明显的毒性反应。对于任何一种准备用于人体的生物材料而言，首要考虑的问题是材料的生物相容性，以确保材料在临床上的安全应用，其中细胞生物相容性是评价生物材料生物相容性的重要内容之一。评价生物材料细胞相容性的实验方法较多，但细胞形态观察法、MTT法、中性红摄取实验法、乳酸脱氢酶释放法的应用最为广泛。

研究通过体外细胞培养的方式，采用形态观察法、MTT法、中性红摄取实验法、乳酸脱氢酶释放法等4种方法比较研究了P85、PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、F127、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、F87、PLA-F87- PLA和FA-F87-PLA 9种高分子纳米粒子的细胞相容性。

研究表明，应用于药物载体的纳米粒子粒径的适宜范围是10-100 nm^[16]，实验所制备的纳米粒子粒径在此范围，可以用作载药纳米粒子。MTT法由Mosmann在1983年提出^[17]，是一种以线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法，目前在评价生物材料细胞相容性时运用最为广泛^[18-20]。由MTT实验结果可知，Pluronic与PLA和FA聚合而得的PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、PLA-F127- PLA、FA-F127-PLA、PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子有良好的生物相容性，高质量浓度的Pluronic P85和F87纳米粒子对细胞有一定的毒性作用。

孙利珍等^[18]在采用MTT法进行PLA-P85-PLA纳米粒的细胞相容性研究时发现，纳米粒质量浓度增至50 mg/L时对Caco-2细胞没有毒性，且对细胞增殖有一定的促进作用，与作者研究结果相似，且此研究中高质量浓度的PLA-P85-PLA纳米粒子对HepG-2细胞增殖仍有促进作用。Xiong等^[12]以卵巢癌OVCAR-3细胞为研究对象，将PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子(最高质量浓度为300 mg/L)与OVCAR-3细胞共培养24 h后，细胞相对活力在99%以上，而此研究中高质量浓度的PLA-F87-PLA纳米粒子(400 mg/L)对HepG-2细胞有一定的抑制作用。Ta?l?d等^[21]研究Pluronic嵌段共聚物对人类牙胚干细胞牙源性分化的影响，采用MTS实验方法，发现P85表现出细胞毒性，F127不影响细胞的增殖，与此研究制备的Pluronic P85和F127纳米粒子作用于HepG-2细胞的表现结果相似。中性红摄取实验法由Borenfreund等^[22]提出，活细胞可以对中性红染料进行摄取，并积累在溶酶体内，通过测定活细胞对中性红的摄取量来间接反映细胞的增殖或毒性情况，是一种评价生物材料细胞相容性的快速评价方法^[23-25]。中性红摄取实验结果显示，高质量浓度的Pluronic P85纳米粒子有细胞毒性，PLA、FA修饰后，可改善其细胞毒性，与孙利珍等^[18]的研究结果相似，且在高质量浓度下PLA-P85-PLA 纳米粒子仍能明显促进HepG-2细胞的增殖；PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA 纳米粒子作为药物载体材料具有良好的生物相容性，与MTT实验法测得的结果相似。乳酸脱氢酶释放法是一种对于细胞膜完整性破坏比较敏感，对影响细胞内活动的一些毒性物质反应不太敏感的实验方法^[26]。乳酸脱氢酶法测试结果与MTT所得结果相似。

通过以上实验结果可以发现，PLA-P85-PLA、FA-P85-PLA、PLA-F127-PLA、FA-F127-PLA、PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子对细胞形态、生长、增殖没有明显的毒性，具有良好的细胞相容性。用PLA和FA修饰P85和F87，可以明显改善P85、F87的细胞毒性。因此，可以初步判断PLA-P85-PLA、FA-P85- PLA、PLA-F127-PLA、FA-F127- PLA、PLA-F87-PLA和FA-F87-PLA纳米粒子可以作为药物载体，为后续抗肿瘤药物载体的深入研究提供理论基础。

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