2.1  参与者数量分析  共收集到137例临床上被诊断为前交叉韧带损伤的患者，去除机械损伤、临床资料不全等因素，105例纳入病例组。110名无前交叉韧带史患者列入对照组。

参与者基本信息见表1，试验流程见图1。

2.2  胶原蛋白基因COL1A1，COL5A1和COL12A1检测结果  PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，COL1A1基因区扩增目的条带为598 bp(rs1800012)，COL5A1基因区扩增目的条带为667 bp(rs12722，rs13946)，COL12A1基因区扩增目的条带为615 bp(rs970547)和480 bp(rs240736)。 COL5A1基因经BstUⅠ消化，产生351和316 bp片段的为T/T纯合子，316，271和80 bp片段的为C/C纯合子(图2A)；经DpnⅡ消化，产生418，194，40和15 bp片段的为T/T纯合子，612，40和15 bp片段的为C/C纯合子(图2B)。

COL12A1基因区扩增PCR产物经AluⅠ消化，产生460、139和16 bp片段的为A/A纯合子，599和16 bp片段的为G/G纯合子(图3A)；经BsrⅠ消化，产生480 bp片段的为T/T纯合子，322和158 bp片段的为C/C纯合子(图3B)。

2.3  COL1A1基因rs1800012多态性的测序结果        COL1A1基因rs1800012测序，411处为G/T杂合子，COL1A1基因Sp1结合位点rs1800012不是中国汉族人群前交叉韧带损伤发生的易感位点，结果见图4。

2.4  胶原蛋白基因病例对照分析  对照组与病例组等位基因的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P > 0.05；表2)，说明人群具有代表性。

5个SNPs 在病例组和对照组中等位基因频率以及基因型频率分布差异无显著性意义(图5，6)。

连锁不平衡分析结果显示，5个SNPs中rs12722和rs13946连锁不平衡较高，其余位点之间连锁程度较低(图7)。

根据连锁不平衡分析结果，构建了rs12722- rs13946单倍型，并进行对照病例分析，结果为发现差异无显著性意义(表3)。

2.5  病例分层分析  分别进行了男性和女性前交叉韧带病例对照分析，结果发现病例组和对照组男性前交叉韧带患者rs970547基因频率差异有显著性意义(P < 0.05)，其余SNPs未见差异。携带有COL12A1 基因rs970547 A等位基因及AA基因型的男性个体能够增加前交叉韧带的患病风险(表4)。女性患者与男性患者，左侧和右侧损伤中胶原蛋白基因5个SNPs差异无显著性意义。

随着中国全民体育意识的增强及全民运动的开展，运动损伤的发生率逐年上升，其中尤以前交叉韧带损伤最为常见。目前中国现役集训运动员前交叉韧带损伤的总体发病率为0.43%^[1]，且非运动员的前交叉韧带损伤就诊人数显著增加，其增长率明显高于运动员^[2]。 目前，对前交叉韧带损伤发病机制的认识并不十分清楚，有报道认为内部因素和外部因素都与前交叉韧带损伤的发生相关^[3]。近年来前交叉韧带损伤的遗传因素逐渐受到重视，研究报道了部分高加索人群中前交叉韧带损伤与COL1A1，COL5A1及COL12A1基因多态性的相关分析，Khoschnau等^[4]观察到Ⅰ型胶原基因COL1A1 Sp1结合位点的多态性与前交叉韧带损伤减低相关。Posthumus等^[5]发现女性前交叉韧带损伤患者Ⅴ型胶原基因COL5A1 BstUⅠ RFLP CC基因型的频率显著高于对照，女性Ⅻ型胶原基因COL12A1 AluⅠ RFLP AA型前交叉韧带损伤的风险也增高^[6]。因此，作者拟对中国汉族人群前交叉韧带损伤发生与COL1A1，COL5A1 和COL12A1基因多态性的相关性进行分析。

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1  对象和方法  Subjects and methods

1.1  设计  病例-对照实验。

1.2  时间及地点  试验于2011年10月至2015年10月在昆明市第一人民医院运动医学关节疾病科、昆明医科大学第二附属医院骨科及中国医学科学院医学生物学研究所完成。

1.3  对象  研究对象为自愿参与实验的住院患者。

纳入标准：①临床膝关节稳定性体格检查提示膝关节不稳；②膝关节MRI检查提示前交叉韧带异常信号；③关节镜检查明确前交叉韧带损伤；④非机械损伤。

排除标准：①前交叉韧带损伤合并有膝关节其他部位的韧带损伤者；②既往风湿或类风湿性关节炎、化脓性关节炎、膝关节结核等膝关节疾病的患者；③机械损伤；④既往膝关节手术患者。

纳入包括105例前交叉韧带损伤患者和110名正常对照者。其中前交叉韧带损伤患者，男73例，女32例，平均年龄(33.62±11.18)岁，左侧损伤41例，右侧损伤64例；正常对照者，男69例，女41例，平均年龄(35.57±12.78)岁。试验获得昆明医科大学第二附属医院及昆明医科大学临床研究伦理委员会批准通过，经患者和正常对照者及其家属同意并签署同意书。

1.4  方法

1.4.1  DNA提取  采集前交叉韧带损伤患者及对照者肘静脉血5 mL，EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒(上海劢瑞生物科技有限公司)提取样本的基因组DNA，采用琼脂糖凝胶电泳对样品DNA进行测定。电泳条件4 V/cm，2%琼脂糖电泳45 min，凝胶成像。使用分光光度计ND-1000(Thermo-Fisher)测定DNA浓度，调节DNA浓度至15-20 mg/L。

1.4.2  COL1A1和COL5A1基因3个多态性位点的检测

PCR扩增：对COL1A1基因内含子1区的rs1800012，COL5A1基因3’-UTR区的rs12722和rs13946进行扩增。PCR引物如下：COL1-F 5’-GGA AGA CCC GGG TTA TTG CT-3’，COL1-R 5’-CGC TGA AGC CAA GTG AAA TA-3’，COL5-F 5'-CGC TGA AGC CAA GTG AAA TA-3’，COL5-R 5'-GAA GGC ACC TGC AGA ATG AC-3’。PCR反应体系如下：10×PCR 扩增缓冲液2.0 μL、dNTP1.6 μL、引物0.3 μL、HostStart rTaq聚合酶 0.1 μL、模板DNA   2.0 μL，再加入双蒸水至20 μL。

扩增产物检测：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪(Thermo-Fisher)下检测扩增的目的条带。

酶切：COL5A1基因区扩增PCR产物经限制性内切酶BstUⅠ(NEB)和DpnⅡ(NEB)消化，酶切产物琼脂糖凝胶电泳的检测，进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析。

测序：COL1A1基因区扩增PCR产物经生工生物工程(上海)有限公司测序，检测rs1800012单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)。

1.4.3  COL12A1基因2个多态性位点的检测

PCR扩增：对COL12A1基因外显子65和29区的rs970547和rs240736进行扩增。PCR反应体系同上。PCR引物如下：COL12-F1 5’-GAG AAT CCA GAA CAG CTC CAC CAG-3’；COL12-R1 5’-CAT GGC TAG TAT GGG ACA G-3’；COL12-F2 5’-ACT TTT GCG TGG GTA TGT-3’；COL12-R2 5'-CTC CAA AAC AAG TAG TAG C-3’。

扩增产物检测：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪下检测扩增的目的条带。

酶切：COL12A1基因区扩增PCR产物经限制性内切酶AluⅠ(NEB)和BsrⅠ(NEB)消化，酶切产物琼脂糖凝胶电泳的检测，进行RFLP分析。

1.5  主要观察指标  ①酶切产物电泳；②单核苷酸多态性测序；③病例组和对照组的基因及等位基因频率。

1.6  统计学分析  数据采用SPSS17.0进行统计分析。采用Hardy-weinberg遗传平衡定律检验病例组和对照组的基因频率以及等位基因频率。运用SHEsis程序 (http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析统计COL1A1基因rs1800012，COL5A1基因rs12722和rs13946，COL12A1 rs970547和rs240736的基因型、等位基因及其单倍型频率^[7]。位点的多态性与前交叉韧带损伤风险之间的相关性用比值比(odds ratio，OR)及其95% 可信区间(confidence intervals，CI)表示。P < 0.05为差异有显著性意义。

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前交叉韧带损伤是临床上较为常见的一种运动损伤，运动者明显高于一般人群，从引起前交叉韧带损伤的原因上有效的预防其发生将变得尤为重要。但尚不清楚前交叉韧带损伤的具体机制，目前认为内部因素和外部因素共同作用导致前交叉韧带的损伤，性别、家族、遗传因素等是前交叉韧带损伤发生的高风险因素。前交叉韧带损伤有性别差异性，在女性的发生率高于男性^[8-10]；Flynn等^[11]研究发现有前交叉韧带损伤家族史的人群，前交叉韧带损伤的发生率明显高于没有前交叉韧带损伤家族史的人群。而遗传因素作为内部危险因素之一，逐渐受到人们的重视，在发达国家已开展部分基因的关联研究，研究发现前交叉韧带损伤的发生与部分胶原蛋白基因多态相关。  

胶原蛋白或称胶原是细胞外基质的主要成分之一，是人体蛋白质的一大家族，根据它的分布及功能，可分为纤维性胶原和非纤维性胶原两大类。胶原分子由2条α1和1条α2多肽链组成，3条α链互相缠绕成三螺旋结构，每种胶原蛋白至少含有一段三螺旋结构区域。在胶原蛋白中，赖氨酸(Lys)与脯氨酸(Pro)含量尤为丰富，是α肽链形成三螺旋的关键组分^[12]。胶原蛋白基因家族是一个分散的基因家族，各型胶原蛋白基因定位于不同的染色体，这种基因的分离方式有利于新的调节功能的进化^[13]。胶原蛋白基因决定了胶原蛋白氨基酸的组成，在蛋白质的合成和功能中起着重要作用。胶原蛋白基因的突变可导致多种遗传性胶原病的发生，研究较多的是成骨不全。另外，已报道了胶原基因与骨性关节炎、骨质疏松症、颅内动脉瘤等的研究^[14-15]，证明胶原基因多态与疾病的发生相关。在胶原蛋白家族的众多成员中，Ⅰ型胶原蛋白是被人们了解得最为清楚的、也是组织分布最为广泛的胶原蛋白，主要分布在骨和腱中；在皮下、筋膜及细胞间质结缔组织中，也以Ⅰ型胶原为主，并可与Ⅲ型或Ⅴ型共聚成波纹状粗大的纤维束。Ⅰ型胶原由2个α1链和1个α2链组成，COL1A1和COL1A2分别编码α1链和α2链。COL1A1基因定位于17q21.13-22，由51个外显子组成，基因全长18 kb，COL1A2基因定位于7q21.13-22.11，由52个外显子组成，基因全长38 kb。Ⅴ型胶原蛋白由1条Ⅴ型胶原蛋白αⅠ链和2条Ⅴ型胶原蛋白α2链组成的杂多聚体，其明确功能是限制胶原纤维的直径。Ⅴ型胶原蛋白αⅠ链基因——COL5A1位于9q34.2-34.3；α2链基因——COL5A2位于2q14-32；α3链基因——COL5A3位于19p13。在角质层，Ⅴ型胶原蛋白调节起始纤维的组装。Ⅰ型胶原和Ⅴ型胶原共同组装成异型原纤维。Ⅴ型胶原分子埋藏于整个三螺旋域中，Ⅰ型胶原分子则呈现于纤维的表面^[16]。2009年，Posthumus等^[17]证实在南非前交叉韧带患者中，Ⅰ型胶原基因COL1A1 Sp1结合位点TT型显著低于对照，提示该多态可能是前交叉韧带损伤多因素模型中的一个特殊遗传因子。推测Sp1结合位点内含子G→T取代可增加Sp1转录因子的亲和力，从而增加COL1A1基因的表达^[18]。目前，对Ⅴ型胶原基因COL5A1与前交叉韧带损伤及跟腱损伤的研究同样集中于高加索人群。Mokone等^[19]以来自南非高加索人群的111例跟腱损伤患者和129例无症状运动爱好者为研究对象，对COL5A1基因进行了BstUⅠ和 DpnⅡ RFLPs检测，结果发现BstUI RFLP多态和慢性跟腱炎相关。接着Mokone等^[19]又对澳大利亚高加索人群的85例跟腱损伤患者和210例对照进行研究，结果发现BstUⅠ和DpnⅡ RFLPs 均与损伤相关。Posthumus等^[6]也对COL12A1基因多态性进行了分析，发现女性COL12A1 AluⅠ RFLP AA型患前交叉韧带损伤的风险增高。 作者未观察到汉族人群中，前交叉韧带与Sp1结合位点的关联性。群体遗传学的研究结果表明，在欧洲人群中rs1800012 T等位基因频率为20%，G为80%；美洲人群中，T为16%，G为84%；而在亚洲人群中T仅为1%，G为99%^[20]。试验中病例组中仅检出1例T等位基因，而对照组中全为G等位基因。因此，rs1800012在中国人群的分布中多态性不足，不可能是疾病相关的易感位点。汉族人群中rs12722 C和T等位基因的频率分别为78.4%和21.6%，rs13946 C和T等位基因的频率分别为43.6%和53.4%。在前交叉韧带患者组中，rs13946 T的频率略高于对照，但差异无显著性意义。此外，CC，CT，TT基因型和构建的rs12722- rs13946单倍型差异也无显著性意义，提示在中国人群中rs12722和 rs13946可能不是前交叉韧带的易感遗传因素。对COL12A1基因的rs970547和rs240736进行分型。结果在正常人群中，rs970547 A和G等位基因频率分别为64.2%和35.8%，rs240736 C和T等位基因频率分别为11.8%和88.2%，病例组和对照组等位基因频率无显著性意义。结果表明男性前交叉韧带患者中，rs970547基因频率在病例组和对照组中差异有显著性意义(P < 0.05)，其余SNPs差异无显著性意义。病例组中A和AA的频率分别为71.9%和49.3%，对照组中则分别为58.8%和27.5%，携带有COL12A1 基因rs970547 A等位基因及AA基因型的男性个体能够增加前交叉韧带的患病风险。

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文章快速阅读：

文题释义：
前交叉韧带损伤：前交叉韧带，又称前十字韧带，是人体膝关节中重要的静力性稳定结构，连接股骨与胫骨，主要作用是限制胫骨向前过度移位，与膝关节内其他结构共同作用，来维持膝关节的稳定性。前交叉韧带损伤在膝关节的损伤中较为常见，是引起膝关节功能障碍的常见因素之一。
胶原蛋白基因：胶原蛋白是细胞外基质的主要成分之一，是人体蛋白质的一大家族。胶原蛋白基因家族是一个分散的基因家族，各型胶原蛋白基因定位于不同的染色体，决定了胶原蛋白氨基酸的组成，在蛋白质的合成和功能中起着重要作用。研究报道胶原蛋白基因COL1A1，COL5A1及COL12A1与部分高加索人群前交叉韧带损伤相关。

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文章概要：中国汉族人群前交叉韧带损伤发生与COL1A1、COL5A1 和COL12A1基因多态性有何相关性？通过限制性片段长度多态性分析、测序技术，检测胶原蛋白基因单核苷酸多态性，比较中国汉族人群前交叉韧带损伤遗传易感基因。

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