酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (12): 1833-1837.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.12.005

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酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞

丁香莹1，蔡劲薇2，潘吉铭1，梁敏2

1广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学第一附属医院内分泌科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2016-12-13 出版日期:2017-04-28 发布日期:2017-05-16
通讯作者: 梁敏，博士，教授，硕士生导师，广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:丁香莹，女，1988年生，湖北省宜昌市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事糖皮质激素性骨质疏松症研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81260142)

Culture of rat primary osteoblasts using enzymatic digestion combined with tissue explant method

Ding Xiang-ying1, Cai Jing-wei2, Pan Ji-ming1, Liang Min2

1the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2016-12-13 Online:2017-04-28 Published:2017-05-16
Contact: Liang Min, M.D, Professor, Master’s supervisor, Department Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Ding Xiang-ying, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260142

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
组织块法：在成骨细胞原代培养中，组织块法是最简捷和经常使用的方法。将组织块剪成小碎块后逐依接种于培养瓶，细胞会从贴壁的组织碎块的边缘缓慢爬出，直至爬满整个培养瓶。
酶消化法：另外一种提取原代成骨细胞的常用方法是酶消化法。采用胰酶或胶原酶对组织块进行消化分离细胞，但是胰酶或胶原酶的用量和浓度较难控制，浓度过大或过小都不合适。

摘要
背景：获取高纯度、高活性的成骨细胞是进行骨代谢研究的基础。
目的：探索一种简便、高效的原代成骨细胞培养方法。
方法：将新生24 h内的SD大鼠，分离获取颅骨的顶骨和额骨，预先采取胰酶和胶原酶消化，再进行组织块培养的方法提取成骨细胞。通过倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态，细胞计数绘制细胞生长曲线，采用碱性磷酸酶BCIP/NBT染色和茜素红矿化结节染色进行成骨细胞鉴定。
结果与结论：①细胞形态呈长梭形、三角形、不规则多边形，有两至三个细胞突起；②透射电镜下线粒体和内质网在成骨细胞中非常丰富，并且有较多细胞突起，呈现出典型成骨细胞特点；③细胞刚接种时生长缓慢，3 d后增殖加快，第7天达高峰；④碱性磷酸酶BCIP/NBT染色显著阳性，茜素红钙结节染色橘红色；⑤采用酶消化法联合组织块法提取的细胞具有典型的成骨细胞特征和功能，是一种理想的原代成骨细胞分离培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9814-8091(梁敏)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 大鼠, 成骨细胞, 原代培养, 酶消化法, 组织块法, 鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteoblasts with high purity and activity are essential for bone metabolism research.
OBJECTIVE: To explore a simple and effective culturing method of primary osteoblasts.
METHODS: Osteoblasts were isolated from the parietal and frontal bones of newborn Sprague-Dawley rats using trypsin and collagenase digestion and tissue explant method. The morphology of osteoblasts was observed by inverted phase contrast microscope and transmission electron microscope; the cells was counted to draw the growth curve; the osteoblasts were identified by alkaline phosphatase BCIP/NBT staining and alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells showed spindle, triangle or polygon shapes, having two or three protrusions. There were abundant mitochondria and endoplasmic reticulum under electron microscope, which presented the typical characteristics of osteoblasts. The cell growth was slow intially, accelerating at the 3rd day,
and peaking at the 7th day. The cells were highly positive for alkaline phosphatase staining and were stained orangered through the alizarin red staining. To conclude, the cells isolated using enzymatic digestion combined with tissue explant method exhibit the typical characteristics and functions of osteoblasts, and this method is an ideal way to culture primary osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblast, Cell Culture Techniques, Pancreatin, Collagenases, Tissue

中图分类号:

R318

丁香莹，蔡劲薇，潘吉铭，梁敏. 酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(12): 1833-1837.

Ding Xiang-ying1, Cai Jing-wei2, Pan Ji-ming1, Liang Min2. Culture of rat primary osteoblasts using enzymatic digestion combined with tissue explant method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(12): 1833-1837.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计原代成骨细胞提取体外实验。

1.2 时间及地点于2015年3月至2015年12月在广西医科大学实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：出生24 h内的SD乳鼠，雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号：SCXK桂2014-0002。

实验试剂和仪器：CO₂培养箱(Scientific公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)，超净工作台(苏州净化公司)，离心机(上海安亭公司)，2.5-1 000 μL移液器(美国Eppendorf公司)，4 ℃冰箱，-20 ℃冰箱，-80 ℃冰箱(海尔公司)，水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，自动超纯水蒸馏器(成都越纯仪器厂)，25 cm²细胞培养瓶、6孔板、24孔板(Corning公司)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP-NBT)染色试剂盒(碧云天公司)，茜素红S染色液、青霉素、链霉素(索莱宝生物科技有限公司)，低糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(维森特公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胶原酶Ⅱ型(sigma公司)，PBS粉末(雷根生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 成骨细胞的分离和培养首先进入细胞房前戴好口罩、帽子、手套，穿上无菌衣，所需物品准备齐全后，紫外灯照射半小时，出生24 h内的 SD大鼠乳鼠放入盛有体积分数75%乙醇的烧杯中浸泡10 min，在无菌环境中，用镊子将乳鼠放入培养皿中，剪刀剪下乳鼠的鼠头，放入盛有PBS的50 mL离心管中浸泡，清洗残留的血迹，镊子小心夹取鼠头放入培养皿，眼科剪剪开乳鼠头顶部的皮肤，充分暴露颅骨，另取一把眼科剪剪取乳鼠颅骨的顶骨和额骨放入盛有PBS的培养皿中。用镊子小心清除黏附的血液和结缔组织，并用PBS清洗3遍。将清除干净的骨片放入盛有2 mL 0.25%胰酶的5 mL离心管中37 ℃消化10 min，消化结束后，取适量培养液中和胰酶，用纱布擦拭骨片上的纤维组织后，放入盛有2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶的5 mL离心管中完全剪碎，最后得到骨粒大小约1 mm×1 mm×1 mm，37 ℃水浴箱中消化 30 min，弃上层清液，使用眼科镊夹取小骨块放于25 cm²的培养瓶中，铺展均匀，倒置干涸培养2-4 h后翻正培养瓶，轻轻加入4 mL培养液，将培养瓶放于含有体积分数5%CO₂、37 ℃恒温培养箱内培养3 d后换液，去掉未贴壁的骨粒。

1.4.2 成骨细胞的传代和纯化当培养瓶中的组织块爬出的细胞爬满培养瓶的80%-90%时，进行1∶2或1∶3传代。倒掉培养液后用PBS清洗2遍后加入1mL 含有EDTA的0.25%胰酶消化1 min，显微镜下看到细胞表面轮廓接近变圆时，加入含有胎牛血清的培养液终止胰酶消化。用巴氏吸管反复吹打50-100次，注意每个角落均要吹打到，将吹打后的细胞悬液静置3 min，将沉于管底的骨块丢掉，上清离心1 000×g 5 min。巴氏吸管吸走上清液，加入4 mL左右的培养液重悬细胞沉淀，将含有细胞的悬液放入25 cm²培养瓶中。按照薛庆善^[12]的差速黏附法去除成纤维细胞，即将细胞悬液在培养箱中静置15 min，轻轻吸取细胞上清液转移到另一个新的培养瓶，再将培养瓶在培养箱中静置15 min，再将上清转移到另一新的培养瓶，连续转瓶2次，成纤维细胞可基本去除。

1.5 主要观察指标

1.5.1 倒置相差显微镜观察每天在倒置相差显微镜下察看细胞的爬出情况、形态和生长特点，并拍照记录。

1.5.2 透射电镜观察将处于对数生长期的成骨细胞接种到培养瓶长满后，巴氏吸管吸走培养液，加入4 mL PBS清洗细胞2次，用含有EDTA胰酶消化细胞，显微镜下看到细胞表面轮廓接近变圆时，迅速加入2 mL含有胎牛血清的培养液终止胰酶消化。用吸管反复吹打培养瓶底50-100次，吹打成单细胞悬液，然后将其转入15 mL离心管中，将离心管配平后，1 000×g室温离心5 min。继续再加入4 mL PBS清洗细胞3次，1 000×g 室温离心5 min。弃掉上清液，向细胞沉淀中加入新配4%戊二醛，4 ℃过夜，经过一系列处理后，将细胞切片用透射电镜观察，并拍照，刻录成盘。

1.5.3 成骨细胞生长曲线将第3代的成骨细胞接种于24孔板中，每天取3孔进行细胞计数后取均值，持续进行计数8 d，然后绘制细胞生长曲线。

1.5.4 碱性磷酸酶染色预先用体积分数75%乙醇过夜浸泡细胞爬片，注意让每个细胞爬片分布均匀的浸泡在乙醇中。取第3代处于对数生长期的细胞，胰酶消化细胞离心后加入培养液，细胞计数后，将细胞按5×10⁴/孔接种于有细胞爬片的6孔板中，待细胞长至80%时，用镊子小心取出细胞爬片，采用BCIP-NBT试剂盒进行染色。取出细胞爬片后用PBS清洗3次，每次摇床2 min，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，BCIP/NBT染色液避光孵育30 min，PBS清洗数次后，风干，然后用显微镜观察。显微镜下选取5个细胞分布均匀的视野计数400个细胞，计算阳性细胞所占比例。

1.5.5 矿化结节染色将细胞接种于放置有细胞爬片的6孔板，连续培养21 d，每3 d换液1次，不传代。显微镜下观察到有不透明结节时，采取茜素红染液染色。取出细胞爬片用PBS清洗数次后，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，每次浸泡1 min，加入茜素红染液染色30 min，PBS清洗数次后，干燥，显微镜下观察染色情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

自从1964年Peck^[13]和他的同事首次将胎鼠和乳鼠的顶骨和额骨进行体外分离培养成骨细胞成功后，成骨细胞体外培养已成为探索成骨细胞的形态、功能、生物学特征以及药物代谢的重要方法。

成骨细胞的体外培养主要有两种方式：一种是直接从骨组织中分离，另一种是利用已建立的成骨细胞系。从骨组织中分离的原代成骨细胞，生物学特性与体内成骨细胞具有很好的相似性，可用于骨质疏松症发病机制和抗骨质疏松药物筛选的研究^[14-15]。成骨细胞系因其有丰富足量的细胞和稳定的细胞表型其应用也比较广泛，但是与体内的成骨细胞存在一定的差异，不能全面反映体内成骨细胞生理特性、功能状态等的真实情况^[16-18]。而且成骨细胞系的重复传代也会造成成骨细胞表型的丢失^[19-20]。本实验直接从SD大鼠胎鼠颅骨提取原代的成骨细胞，数量充足，能够为后续的有关成骨细胞实验研究提供坚实的基础。研究报道，大鼠、小鼠、鸡、兔以及新生动物(SD大鼠乳鼠或C57小鼠乳鼠)的颅骨已成为组织工程成骨细胞培养常用的组织来源^[21-22]。哺乳动物的头颅骨主要由5块扁骨组成，成对的额骨和顶骨以及一块枕骨^[23-24]，由于枕骨靠近颈部，颈部位的组织中掺杂着更多的成纤维组织，所以取材时选用额骨和顶骨^[25]。大鼠和小鼠分离培养成骨细胞具备培养过程简洁、细胞增殖较快等优点。与同龄小鼠相比，新生的SD大鼠乳鼠能够产生更多数量的成骨细胞，混杂的成纤维细胞也明显减少^[19]。而成年大鼠以及其他动物提取的成骨细胞由于细胞已经接近成熟状态故而其增殖能力明显减低，影响实验的进行。有研究表明，新生大鼠头盖骨的成骨细胞状态稳定，取材方法成熟，是用于骨质疏松症研究和药物筛选最适宜的细胞^[26]。因而，本实验选用新生SD大鼠颅骨来分离培养成骨细胞，既提高了细胞产量，又保证了细胞纯度。

目前在成骨细胞原代细胞的提取方法中，最常用的还是酶消化法和组织块法。酶消化法是预先采取胰酶对骨组织进行预先消化，清除骨片表面的成纤维组织，然后再采用一定浓度的胶原酶对骨片进行消化，目的是松散骨片，使成骨细胞更容易从骨陷窝中游离出来，但是酶消化法对细胞损伤较大，胰酶和胶原酶的用量和浓度不易控制，用量过少或浓度过低都可能导致成骨细胞提取失败，用量过大或浓度过高都可能导致细胞消化成碎片或者造成成骨细胞表型的缺失^[27]。传统组织块法则是将组织块剪成1 mm× 1 mm×1 mm后贴壁，让成骨细胞从已经贴壁的组织块中爬出来，但是组织块没有经过胰酶和胶原酶的消化作用，细胞爬出缓慢，耗时较长，不利于实验的开展，并且由于组织块没有经过酶的消化，组织块上残留的结缔组织极容易爬出成纤维细胞和其它种类的细胞，从而造成提取的成骨细胞的纯度下降。因而，本实验在提取SD大鼠成骨细胞时，同时采取了酶消化和组织块两种方法，先采用0.25%胰酶预消化10 min去除SD大鼠颅骨残留的成纤维组织，减少成纤维细胞和其他种类细胞的混杂，再采取0.1%Ⅱ型胶原酶消化30 min，以加快成骨细胞从组织块的游出，然后将 1 mm×1 mm×1 mm小骨粒贴壁，注意小骨粒贴壁的过程中，不能加入大量的培养液，只需加入少量的培养液，以防止培养液将贴壁的小骨粒悬浮。本实验结果发现，3 d左右就有细胞从骨粒周边爬出，爬出的细胞具有贴壁生长的特性，5 d后细胞爬出逐渐增多，7 d铺满整个培养瓶。爬出的细胞呈不规则梭形，三角形，鳞片形，长梭形，有数个细胞突触，细胞形态与其他文献报道的成骨细胞一致^[28-30]。采用透射电镜观察所提取的细胞，细胞的胞质内线粒体丰富、粗面内质网扩张，大量的分泌小泡，有较多细胞突起，细胞核较大，核仁明显，具有典型的成骨细胞特征。

文章采用联合酶消化法和组织块法来提取成骨细胞，具有简便快捷，操作简单，方法成熟，能迅速获得大量成骨细胞。与以往其他实验方法方法相比，具有以下优点：①以往提取原代成骨细胞往往是单独使用酶消化法或者组织块法，单独使用酶消化法酶的用量和浓度以及消化时间不易控制，容易造成提取细胞失败；酶消化法过程和步骤均较繁琐，需要反复多次消化骨组织，细胞培养需要无菌操作，如此反复多次消化细胞很容易造成细菌的污染，导致实验的失败。单独使用组织块法由于没有经过酶的消化作用，细胞爬出缓慢，往往需要1周的时间才能有细胞的爬出，使细胞产量显著降低，等到细胞爬满培养瓶时，往往先爬出的细胞已接近老化状态，影响后续实验的开展。而本实验采用联合酶消化法和组织块法来提取成骨细胞则是结合了上述两种方法，既方便快捷，又提高了产量；②也有文献报道采用结合酶消化法和组织块法来提取成骨细胞^[31]，本实验在采用胰酶预消化骨片后，另外增加了0.1%Ⅱ型胶原酶消化骨片这一步骤，目的是帮助成骨细胞更快从骨片中爬行出来，进一步提高细胞产量。

骨组织不断地进行骨重建，骨重建过程包括骨吸收和骨形成，骨吸收是由破骨细胞分泌酸性物质，吸收旧的骨质形成吸收陷窝，然后骨形成由成骨细胞增殖、分化成熟，填补缺损形成新骨来保持骨动态平衡。成骨细胞在骨形成的过程中主要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化阶段。在成骨细胞增殖期，成骨细胞数量呈指数增长，呈现出很强的增殖特征。本实验通过对指数生长期的细胞进行连续计数8 d发现，成骨细胞刚接种到培养板时，经历短暂的适应期，大约3 d后细胞数目迅速增加，进入细胞大量生长的指数生长期。成骨细胞的典型表现主要是分泌碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原。其中碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的一种特异性蛋白，碱性磷酸酶的高表达是成骨细胞早期分化的特异性标志。本实验采用BCIP/NBT对碱性磷酸酶进行染色，结果显示95%的细胞都被染色，说明所培养的细胞分泌碱性磷酸酶，具有成骨细胞的特性。茜素红染色是测定细胞基质中钙盐沉积的一种常用方法，茜素红能与碳酸钙或磷酸钙中的钙盐螯合形成一种橙红色复合物。本实验采用茜素红进行成骨细胞染色呈阳性，表明所分离培养的细胞能形成矿化结节，具有典型的成骨细胞表型，这也是鉴定成骨细胞的重要依据之一。综上所述，采用联合酶消化法和组织块法提取SD乳鼠颅骨成骨细胞，方法简便可靠，细胞产量高，可在体外稳定生长，为后续进行骨代谢及其相关疾病的研究提供了理想的模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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