胶原涂层对3D打印种植体表面生物相容性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1558-1564.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.014

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

胶原涂层对3D打印种植体表面生物相容性的影响

李赛娜^1，2，康跻耀²，高建萍²，高毅³，罗元明⁴，张贵锋²，王明林¹

¹山东农业大学食品科学与工程学院，山东省泰安市 271018； 2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京市 100190；³南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510280；⁴中国科学院微生物研究所，北京市 100190

收稿日期:2016-11-13 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 张贵锋，博士，研究员，博士生导师，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京市 100190
作者简介:李赛娜，女，1990年生，山东省聊城市人，汉族，2013年南京财经大学毕业，主要从事胶原研究。
基金资助:
广东省自然科学基金资助项目(2014A030312013)；国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目(2014AA022109)

Influence of collagen coating on the biocompatibility of three-dimensional printed implants

Li Sai-na ^{1, 2}, Kang Ji-yao², Gao Jian-ping², Gao Yi³, Luo Yuan-ming⁴, Zhang Gui-feng², Wang Ming-lin¹

¹ College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong Province, China; ² National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; ³ Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; ⁴Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Received:2016-11-13 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Zhang Gui-feng, M.D., Researcher, Doctoral supervisor, National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
About author:Li Sai-na, College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong Province, China; National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030312013; the National High-Tech Research and Development Program of China (863 Program), No. 2014AA022109

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
液质联用：又叫液相色谱-质谱联用技术，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
基于3D打印的钛合金片进行胶原覆层：通过化学偶联法将Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原覆层在钛合金片(Ti6Al4V)表面，以化学键连接得到的胶原涂层具有更强的稳定性。作为偶联剂的KH550无毒性、致畸性和致突变性，具有防腐蚀作用，可水解释放生物活性硅醇，不仅可以作为胶原的活性接枝部分，同时可作为一种骨修复材料。

背景：金属等惰性生物材料存在生物相容性差、组织结合力弱等问题，从而导致种植牙或骨植入物的使用效果较差。因此，如何增强惰性生物材料的生物相容性成为了近几年的研究热点。
目的：对钛合金材料进行胶原覆层并评价其生物相容性。
方法：以钛合金片(Ti6Al4V)为基质，Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原为覆层材料，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(KH550)为偶联剂，对基于3D打印的钛合金片进行胶原覆层。将覆层材料用于小鼠前成骨细胞(MC-3T3-E1)培养，通过细胞培养效果评价其生物相容性，并通过细胞蛋白差异性识别比较不同类型胶原对细胞分化的影响。
结果与结论：①当钛合金片(Φ10 cm)表面含氮量为8.41%时，Ⅰ型胶原覆层量为0.81 mg，Ⅱ型胶原覆层量为0.77 mg；②与空白钛合金片相比，经胶原覆层后的钛合金片细胞贴附状态更好，铺展面积更大，且细胞增殖速率更快，活性更强；③Ⅰ型胶原覆层材料培养的细胞多表达与基质合成有关的蛋白，而Ⅱ型胶原覆层材料培养的细胞多表达与矿化及钙盐沉积有关的蛋白；④结果表明，胶原覆层可提高钛合金材料的生物相容性，且不同胶原类型可影响细胞表达不同功能性蛋白。

ORCID: 0000-0002-3189-8904(李赛娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 钛合金, 胶原, 种植体, 生物相容性, 成骨细胞, 细胞蛋白, 液质联用, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Inert biomaterials such as metal usually hold poor biocompatibility and weak bonding force, which is against the effect of dental or bone implants. Therefore, how to improve their biocompatibility has become the research hotspot.
OBJECTIVE: To prepare collagen-coated titanium alloy (Ti6Al4V), and to assess its biocompatibility.
METHODS: Ti6Al4V served as the matrix, the 3-amino propyl triethoxy silane (KH550) as the crosslinking agent, and the three-dimensional printed titanium alloy coated by collagen type I and II was prepared, respectively. The coated materials were co-cultured with mouse preosteoblasts MC-3T3-E1 to evaluate its biocompatibility. The effect of different kinds of collagen on the cell differentiation was compared by differential recognition of surface proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: When the N content on the titanium alloy surface (Φ10 cm) was 8.41%, the cladding quantity of collagen type I and II was 0.81 and 0.77 mg, respectively. Compared with the bare titanium alloy, the cell adhered well and distributed extensively on the coated titanium alloy, which showed strong viability and fast proliferation. The cells cultured on collagen type I coated materials expressed the proteins associated with matrix synthesis, and those on collagen type II coated materials expressed the proteins associated with mineralization. These results clarify that the collagen coating can improve the biocompatibility of titanium alloy, and different types of collagens act on different functional proteins.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Titanium, Alloys, Collagen, Osteoblasts, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李赛娜，康跻耀，高建萍，高毅，罗元明，张贵锋，王明林. 胶原涂层对3D打印种植体表面生物相容性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1558-1564.

Li Sai-na, Kang Ji-yao, Gao Jian-ping, Gao Yi, Luo Yuan-ming, Zhang Gui-feng, Wang Ming-lin. Influence of collagen coating on the biocompatibility of three-dimensional printed implants[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1558-1564.

图/表（结果） 8

2.1 KH550修饰钛合金片XPS分析结果采用XPS分析氨基硅烷修饰前后样品表面元素组成的变化。图1是未经修饰钛合金片(经Piranha溶液处理)以及经KH550修饰后钛合金片的XPS扫描图谱，表1列出了每种样品表面Ti、Al、V、N、O、Si、C几种元素的比例。理论上未修饰钛合金片表面没有氮元素，实验检测出的未修饰钛合金片表面1.51%的N属非特异性吸附空气中的N₂。KH-550修饰的钛合金片XPS图谱中出现N1s信号峰，其结合能为399.4 eV，与-NH₂中N1s结合能对应，表明钛合金片经氨基硅烷修饰后其表面存在N元素；修饰后C1s信号峰出现在结合能284.8 eV，与KH550中的C-C键对应，证明经修饰后KH550成功偶联在钛合金片表面；Si2p信号峰在102.2 eV出现，说明在Si-OH与KH550之间形成了Si-O键。

2.2 胶原覆层钛合金片HPLC-MS分析将酶解后的Ⅰ型覆层胶原及Ⅰ型胶原标准品用HPLC-MS方法对其进行全扫描分析。以全部牛Ⅰ型胶原蛋白为数据库，将酶解多肽信息用SEQUEST软件进行数据库搜索，筛选出在两组样品中均具有阳性结果^[27]，较高信号值的Ⅰ型胶原特征多肽为GPAGPSGPAGK。以两组样品中该特征多肽的提取离子流图积分峰面积(图2)，得到两组样品中GPAGPSGPAGK特征肽段的含量比例为0.81︰1。以同样的方法得到Ⅱ型覆层胶原及Ⅱ型胶原标准品中特征多肽TGPAGAAGAR的含量比例为0.77︰1(图3)。已知胶原标准品质量浓度均为 1 g/L，则钛合金片(Φ10 cm)上的Ⅰ型胶原覆层量为 0.81 mg，Ⅱ型胶原覆层量为0.77 mg。

2.3 细胞贴附形态观察结果小鼠前成骨细胞在3组钛合金片上培养24 h后的扫描电镜照片如图4所示。从图中可见细胞在3组钛合金片上均可正常贴附生长，其中空白组表面贴附的细胞铺展范围较小，多隆起呈条状，扁平状或多角形铺展的细胞较少，细胞伸出较少伪足；而Ⅰ型胶原组和Ⅱ型胶原组表面贴附的细胞铺展范围较大，多呈扁平状或多角形，细胞伸出较多伪足。

2.4 细胞计数结果小鼠前成骨细胞在3组钛合金片上分别培养1，2，3 d的细胞计数结果，见表2。从表中可以看出，Ⅰ型胶原组细胞数量最多且增殖速率最快，空白组细胞数量最少且增殖速率最慢。

2.5 细胞活性检测结果小鼠前成骨细胞在3组钛合金片上分别培养1，2，3 d的培养液葡萄糖浓度变化结果如表3所示。从表中可见3组培养液中葡萄糖浓度均逐日递减，至第3天细胞贴满时Ⅰ型胶原组的葡萄糖浓度最低，空白组葡萄糖浓度最高，即空白组培养液中葡萄糖消耗量最低，细胞活性最低。

2.6 细胞蛋白表达结果将酶解后的3组小鼠前成骨细胞蛋白用HPLC-MS方法对其进行全扫描分析。以全部小鼠前成骨细胞蛋白为数据库，用搜库软件MaxQuant 1.4.1.2对3组数据进行数据库搜索，得到小鼠前成骨细胞蛋白中有明显差异性(RSD>20%)的蛋白如表4所示。结果表明，Ⅰ型胶原组多表达增殖期与基质合成有关的基础蛋白，而Ⅱ型胶原组多表达分化期与基质矿化和钙沉积有关的蛋白。

参考文献

[1]de Andrade DP, de Vasconcellos LM, Carvalho IC, et al. Titanium-35niobium alloy as a potential material for biomedical implants: In vitro study. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015;56:538-544.

[2]Kolmas J, Oledzka E, Sobczak M, et al. Nanocrystalline hydroxyapatite doped with selenium oxyanions: a new material for potential biomedical applications.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2014;39:134-142.

[3]Joo JY, Amin ML, Rajangam T, et al. Fibrinogen as a promising material for various biomedical applications. Molecular & Cellular Toxicology. 2015; 11(1):1-9.

[4]Mosadegh B, Xiong G, Dunham S, et al. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 2015;10(3):034002.

[5]Farnoush H, Aghazadeh Mohandesi J, Çimeno?lu H. Micro-scratch and corrosion behavior of functionally graded HA-TiO2 nanostructured composite coatings fabricated by electrophoretic deposition. J Mech Behav Biomed Mater. 2015;46:31-40.

[6]Himics L, Tóth S, Veres M, et al. Effective implantation of light emitting centers by plasma immersion ion implantation and focused ion beam methods into nanosized diamond. Applied Surface Science. 2015; 328:577-582.

[7]Quan Z, Ni E, Ogasawara Y, et al. Nano-size multiple metal oxide anode electrodes synthesized from layered double hydroxides - Electrochemical reaction mechanism and surface morphology change during reaction with lithium ion. Solid State Ionics. 2014; 268: 268-272.

[8]Liang CY, Zhong X, Wang HS, et al. Femtosecond laser induced micropatterns and in-situ deposition of Ca/P phase and collagen on Ti surface. Materials Chemistry and Physics. 2015; 158: 115-120.

[9]Hauser J, Koeller M, Bensch S, et al. Plasma mediated collagen-I-coating of metal implant materials to improve biocompatibility. J Biomed Mater Res A. 2010;94(1):19-26.

[10]Schulz MC, Korn P, Stadlinger B, et al. Coating with artificial matrices from collagen and sulfated hyaluronan influences the osseointegration of dental implants.J Mater Sci Mater Med. 2014;25(1):247-258.

[11]Ricard-Blum S, Ruggiero F. The collagen superfamily: from the extracellular matrix to the cell membrane. Pathol Biol (Paris). 2005;53(7):430-442.

[12]Huang CY, Kuo JM, Wu SJ, et al. Isolation and characterization of fish scale collagen from tilapia (Oreochromis sp.) by a novel extrusion-hydro-extraction process. Food Chem. 2016;190:997-1006.

[13]Martínezortiz MA, Hernándezfuentes AD, Pimentelgonzález DJ, et al. Extraction and characterization of collagen from rabbit skin: partial characterization. CyTA - Journal of Food. 2015; 13(2):253-258.

[14]Shanmugam G, Reddy SMM, Madhan B,et al. Method of addition of acetonitrile influences the structure and stability of collagen. Process Biochemistry. 2014;49(2): 210-216.

[15]Li GY, Fukunaga S, Takenouchi K, et al. Comparative study of the physiological properties of collagen, gelatin and collagen hydrolysate as cosmetic materials. Int J Cosmet Sci. 2005; 27(2):101-106.

[16]Hauser J, Ring A, Schaffran A, et al. In vivo analysis of tissue response to plasma-treated collagen-I-coated titanium alloys. Eur Surg Res. 2009;43(3):262-268.

[17]Felgueiras HP, Sommerfeld SD, Murthy NS, et al. Poly(NaSS) functionalization modulates the conformation of fibronectin and collagen type I to enhance osteoblastic cell attachment onto Ti6Al4V. Langmuir. 2014;30(31):9477-9483.

[18]Gigante A, Bevilacqua C, Cappella M, et al. Engineered articular cartilage: influence of the scaffold on cell phenotype and proliferation. J Mater Sci Mater Med. 2003;14(8): 713-716.

[19]Buma P, Pieper JS, van Tienen T, et al. Cross-linked type I and type II collagenous matrices for the repair of full-thickness articular cartilage defects--a study in rabbits. Biomaterials. 2003;24(19):3255-3263.

[20]Nehrer S, Breinan HA, Ramappa A, et al. Matrix collagen type and pore size influence behaviour of seeded canine chondrocytes. Biomaterials. 1997;18(11):769-776.

[21]Su PJ, Chen WL, Li TH, et al. The discrimination of type I and type II collagen and the label-free imaging of engineered cartilage tissue. Biomaterials. 2010;31(36):9415-9421.

[22]Chang KY, Hung LH, Chu IM, et al. The application of type II collagen and chondroitin sulfate grafted PCL porous scaffold in cartilage tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2010; 92(2):712-723.

[23]Cao YL, Liu T, Pang J, et al. Glucan HBP-A increase type II collagen expression of chondrocytes in vitro and tissue engineered cartilage in vivo. Chin J Integr Med. 2015;21(3): 196-203.

[24]Kontturi LS, Järvinen E, Muhonen V, et al. An injectable, in situ forming type II collagen/hyaluronic acid hydrogel vehicle for chondrocyte delivery in cartilage tissue engineering. Drug Deliv Transl Res. 2014;4(2):149-158.

[25]Yao Y, Ma YZ, Qin M, et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids Surf B Biointerfaces. 2008;66(2): 233-239.

[26]孙爱梅,张贵锋,倪文,等. 胶原蛋白降解物高效液相色谱/质谱联用分析[J]. 中国生物工程杂志, 2005, 25(2): 66-72.

[27]张贵锋,刘涛,王前,等. 高效液相色谱/质谱法识别不同明胶酶解产物中特征多肽[J]. 分析化学, 2008, 36(11): 1499-1504.

[28]Webster TJ, Ejiofor JU. Increased osteoblast adhesion on nanophase metals: Ti, Ti6Al4V, and CoCrMo. Biomaterials. 2004;25(19):4731-4739.

[29]Shah FA, Trobos M, Thomsen P, et al. Commercially pure titanium (cp-Ti) versus titanium alloy (Ti6Al4V) materials as bone anchored implants - Is one truly better than the other. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;62:960-966.

[30]Crespo L, Hierro-Oliva M, Barriuso S, et al. On the interactions of human bone cells with Ti6Al4V thermally oxidized by means of laser shock processing. Biomed Mater. 2016;11(1):015009.

[31]Calzado-Martín A, Crespo L, Saldaña L,et al. Human bone-lineage cell responses to anisotropic Ti6Al4V surfaces are dependent on their maturation state. J Biomed Mater Res A. 2014;102(9):3154-3166.

[32]Barão VA, Mathew MT, Assunção WG, et al. Stability of cp-Ti and Ti-6Al-4V alloy for dental implants as a function of saliva pH - an electrochemical study. Clin Oral Implants Res. 2012; 23(9):1055-1062.

[33]Mohseni E, Zalnezhad E, Bushroa AR.Comparative investigation on the adhesion of hydroxyapatite coating on Ti–6Al–4V implant: A review paper. International Journal of Adhesion & Adhesives. 2014;48(1):238-257.

[34]Durdu S, Deniz OF, Kutbay I, et al.Characterization and formation of hydroxyapatite on Ti6Al4V coated by plasma electrolytic oxidation. Journal of Alloys and Compounds. 2013; 551: 422-429.

[35]Arifin A, Sulong AB, Muhamad N, et al. Material processing of hydroxyapatite and titanium alloy (HA/Ti) composite as implant materials using powder metallurgy: a review. Materials & Design. 2014; 55(6): 165-175.

[36]Benea L, Mardare-Danaila E, Mardare M, et al. Preparation of titanium oxide and hydroxyapatite on Ti–6Al–4V alloy surface and electrochemical behaviour in bio-simulated fluid solution. Corrosion Science. 2014; 80(3): 331-338.

[37]Liu Y, Cui H, Zhuang X, et al. Nano-hydroxyapatite surfaces grafted with electroactive aniline tetramers for bone-tissue engineering. Macromol Biosci. 2013;13(3):356-365.

[38]Raghavan RN, Muthukumar T, Somanathan N, et al. Biomimetic mineralization of novel silane crosslinked collagen. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2013;33(4):1983-1988.

[39]Zhu H, Hu C, Zhang F, et al. Preparation and antibacterial property of silver-containing mesoporous 58S bioactive glass. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2014;42:22-30.

[40]Chiu CK, Ferreira J, Luo TJ, et al. Direct scaffolding of biomimetic hydroxyapatite-gelatin nanocomposites using aminosilane cross-linker for bone regeneration. J Mater Sci Mater Med. 2012;23(9):2115-2126.

[41]张杭州, 孙羽, 王琳, 等. 羟基磷灰石/TiO2纳米管复合物的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(3): 335-340.

[42]鲁雄, 冯波, 翁杰, 等. 生物材料表面微纳结构对成骨相关细胞的影响[J]. 中国材料进展, 2013, 32(10): 612-622.

[43]Higuchi A, Ling QD, Chang Y, et al. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem Rev. 2013;113(5):3297-3328.

[44]Lee TT, García JR, Paez JI, et al. Light-triggered in vivo activation of adhesive peptides regulates cell adhesion, inflammation and vascularization of biomaterials. Nat Mater. 2015;14(3):352-360.

[45]Shafiq M, Jung Y, Kim SH. Insight on stem cell preconditioning and instructive biomaterials to enhance cell adhesion, retention, and engraftment for tissue repair. Biomaterials. 2016;90:85-115.

[46]Spicer V, Ezzati P, Neustaeter H, et al. 3D HPLC-MS with Reversed-Phase Separation Functionality in All Three Dimensions for Large-Scale Bottom-Up Proteomics and Peptide Retention Data Collection. Anal Chem. 2016;88(5):2847-5285.

[47]Tscheliessnig AL, Konrath J, Bates R, et al. Host cell protein analysis in therapeutic protein bioprocessing - methods and applications. Biotechnol J. 2013;8(6):655-670.

[48]Hou J, Tobe BT, Lo F, et al. Combined total proteomic and phosphoproteomic analysis of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2013;1029:163-189.

[49]Köcher T, Pichler P, Swart R, et al. Analysis of protein mixtures from whole-cell extracts by single-run nanoLC-MS/MS using ultralong gradients. Nat Protoc. 2012;7(5):882-890.

引言

生物材料是一类以医疗为目的，用于诊断、治疗、修复或替换人体组织器官或增进其功能，并不对人体组织或血液产生不良影响的功能材料^[1-3]。由于交通事故、自然灾害、疾病等原因都会导致人体组织和器官受到不同程度的损伤，缺损组织和器官修复的需求正日益突出。定制化、个性化的生物3D打印技术可实现生物材料的快速成型，并可准确制作形状复杂的人造种植体^[4]，但是用于制作人造骨骼、人造种植牙等硬质结构的惰性金属材料存在生物相容性差、组织结合力弱等问题，从而造成3D打印种植体易松动、使用寿命短，甚至引发免疫排斥反应导致手术失败。因此，如何增强惰性生物材料的生物相容性成为了近几年的研究热点^[5-7]。

研究表明，胶原覆层材料可以为骨矿化提供基质，促进细胞生长并指导其分化^[8-10]。胶原是细胞外基质的主要组成部分，也是天然骨的主要有机基质^[11-13]。胶原独特的三螺旋结构赋予其良好的生物相容性和低抗原性，并可促进细胞生长，指导生物矿化^[14-16]。胶原肽链上存在的R-G-D序列可与细胞表面的整联蛋白发生结合，从而诱导细胞贴附生长，并促使细胞产生特异性信号以调控细胞周期和表型表达^[17]。有文献报道Ⅱ型胶原比Ⅰ型胶原更有利于软骨细胞表型的形成和结构的维持^[18-21]，近年来作为生物支架材料广泛应用于关节软骨的修复重建和组织再生工程^[22-24]。

实验以具有良好生物相容性和细胞黏附性的Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原为材料，以KH550为偶联剂，采用化学偶联法对基于3D打印的钛合金片进行胶原覆层，通过小鼠前成骨细胞培养效果评价材料的生物相容性，并通过基于HPLC-MS法的细胞蛋白差异性识别比较Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原对细胞分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2015年2月至2016年4月在中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞株小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC-3T3-E1)购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心。

1.3.2 实验试剂和设备钛合金片(Ti6Al4V)购自北大口腔医院，KH550购自国药集团化学试剂有限公司，序列纯胰蛋白酶购自Promega公司，牛跟腱Ⅰ型胶原及牛软骨Ⅱ型胶原购自河北考力森生物科技有限公司，α-MEM培养液购自GIBCO公司，胎牛血清购自BI公司，青霉素-链霉素混合液购自Solarbio公司，0.25%胰蛋白酶溶液购自CAISSON公司，葡萄糖氧化酶试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司，动物细胞总蛋白提取试剂盒购自Minute^TM公司。

X射线光电子能谱仪(XPS，K-Alpha，美国Thermo公司)，高效液相色谱仪(HPLC，美国Agilent 1100系统)，超高效液相色谱仪(EASY-nLC 1000，美国Thermo公司)，离子阱质谱仪(LCQ Deca^xp，美国Thermo公司)，Orbitrap Fusion质谱仪(美国Thermo公司)，质谱数据采集与处理软件(Xcalibur 3.0，美国Thermo公司)与数据分析软件(Bioworks 3.1，美国Thermo公司；MaxQuant v1.4.1.2)，倒置生物显微镜(BDS200，重庆奥特光学仪器有限公司)，二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司)，冷场发射扫描电子显微镜(JSM 6700F，日本电子)，细胞计数仪(美国Invitrogen公司)，全波扫描多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 材料预处理将钛合金片(Φ10 cm)依次用丙酮、无水乙醇、超纯水超声波清洗各10 min，烘干后置于Piranha溶液中90 ℃下浸泡2 h^[25]，150 ℃下干燥4 h，将其浸泡在5% KH550无水甲苯溶液中反应1 h，取出置于甲苯中超声波清洗10 min，置于通风橱中晾干。采用XPS分析KH550修饰效果，分析条件：使用带单色器铝靶X射线源，功率为225 W(工作电压15 kV，发射电流15 mA)，污染碳(内标)为284.8 eV，最小能量分辨率为0.48 eV(Ag_3d5/2)，XPS分析区域直径为15 μm，数据处理使用Avantage数据系统。

1.4.2 胶原覆层将经KH550处理后的钛合金片浸泡在2.5%戊二醛中(含0.01%硼氢化钠)，40 ℃下反应3 h，超纯水超声波清洗10 min，110 ℃下干燥2 h。分别将牛跟腱Ⅰ型胶原和牛软骨Ⅱ型胶原配制成0.5%的0.01 mol/L乙酸溶液，并滴加1 mol/L NaOH溶液调pH至8.0。将戊二醛处理过的钛合金片分为2组，分别置于以上2种胶原溶液中反应24 h，纯水洗涤后置于10 g/L的甘氨酸溶液中浸泡2 h，纯水洗涤、晾干，4 ℃下保存。

1.4.3 HPLC-MS测定覆层胶原含量将胶原覆层钛合金片置于0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液(pH 8.0)中，于60 ℃下反应30 min使胶原变性，降温至37 ℃，加入适量1 g/L序列纯胰蛋白酶(质量比=1︰50)于37 ℃下酶解24 h^[26]。取上清液冻干后加入0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液定容至100 μL，离心后取上清液直接进行HPLC-MS分析。

色谱条件：Zorbax SB-C₁₈300A；流动相：A：水(0.1%甲酸)；B：乙腈(0.1%甲酸)；梯度：0-5 min，5% B；5- 40 min，5%-40% B；40-80 min，40%-75% B；流速：0.2 mL/min。

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)正离子监测模式，喷雾电压4.5 kV，鞘气(N₂)流速60 arb(约400 kPa)，扫描范围(m/z)为400-1 800，精确质量数扫描和二级质谱扫描均为数据依赖性扫描，二级质谱碰撞能量均为35%。

1.4.4 小鼠前成骨细胞培养分别将经过Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原覆层的钛合金片作为2个实验组(以下分别简称为Ⅰ型胶原组和Ⅱ型胶原组)，将只经过Piranha溶液处理的钛合金片作为空白对照组(以下均简称为空白组)。以上3组钛合金片切成1 cm×1 cm的正方形，经体积分数为75%乙醇清洗、紫外照射30 min后置于24孔细胞培养板底部。取对数生长期的小鼠前成骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化、计数，调整细胞浓度后以1×10⁸ L^-1接种于底部放置钛合金片的24孔板中，于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度温箱中培养。

1.4.5 细胞贴附状态观察培养24 h后每组取3片钛合金片，PBS清洗3次，加入2.5%戊二醛固定1 h，再以PBS清洗3次，随后依次梯度乙醇脱水、CO₂临界点干燥、喷金后，扫描电镜观察材料表面细胞的贴附状态。

1.4.6 细胞计数每天每组取3片钛合金片经0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液与锥虫蓝染液1∶1混合，用细胞计数仪计数细胞数目。

1.4.7 葡萄糖氧化酶法检测细胞活性将小鼠前成骨细胞接种于底部放置钛合金片(Φ5 cm)的60 mm玻璃培养皿(经6%二氯二甲基硅烷的甲醇溶液处理后高温高压灭菌)中培养，每天每组取100 μL培养液离心取上清，与葡萄糖氧化酶试剂盒母液以1∶100混匀后37 ℃孵育15 min，标准品与纯水做同样处理，经酶标仪测定505 nm下的紫外吸光度得到葡萄糖浓度。

1.4.8 HPLC-MS进行细胞蛋白差异性识别将小鼠前成骨细胞接种于底部放置钛合金片(Φ10 cm)的120 mm玻璃培养皿中培养3 d至细胞贴满，将3组细胞消化，PBS清洗3次去除培养液，经细胞总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白。以0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液经10 ku超滤膜置换细胞蛋白溶剂，BCA法精确测定细胞蛋白浓度，用0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液调整蛋白浓度至1 g/L，加入终浓度 10 mmol/L DTT后于37 ℃下反应1 h，冷却至室温后加入终浓度55 mmol/L碘乙酰胺，室温下避光反应30 min，再以0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液经10 ku超滤膜洗3次，按1︰50加入序列纯胰蛋白酶，37 ℃下酶解18 h。收集滤液后用0.05 mol/L NH₄HCO₃溶液洗涤滤膜，合并滤液，真空离心浓缩仪抽干，0.1%甲酸溶解后离心取上清进行HPLC-MS分析。

色谱条件：Zorbax SB-C₁₈(150 mm×75 μm I.D., 3 μm)；流动相：A：水(0.1%甲酸)；B：乙腈(0.1%甲酸)；梯度：0-3 min，3%-6% B；3-88 min，6%-25% B；88%-108 min，25%-35% B；108-113 min，35%-80% B；120 min，80% B；流速：400 nL/min。

质谱条件：采用纳米电喷雾离子源(NSI)正离子监测模式，喷雾电压2.2 kV，鞘气(N₂)流速60 arb(约400 kPa)，扫描范围(m/z)为350-1 550，一级质谱采用Orbitrap检测器，二级质谱扫描为DIA扫描，采用离子肼检测器，二级质谱碰撞能量为35%。

1.5 主要观察指标 ①KH550修饰效果(XPS分析法观察氮元素含量是否增加)；②胶原覆层量(液质联用法观察并计算胶原特征肽段的含量)；③细胞贴附形态(倒置光学显微镜下观察细胞铺展面积、形状及伪足差异)；④细胞计数(细胞计数仪计量细胞数量变化)；⑤细胞活性(酶标仪测量细胞培养液中葡萄糖含量变化)；⑥细胞蛋白表达(液质联用法观察计算细胞总蛋白中蛋白的种类和含量差异)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

钛及钛合金材料具有密度小、比强度高、耐热、耐腐蚀及弹性模量低等优点，近年来作为生物材料广泛应用于种植牙及人工骨植入物^[28-32]。目前临床上应用的钛合金种植体多以羟基磷灰石为覆层材料^[33-37]，但羟基磷灰石涂层存在脆性强、弹性模量高和与钛合金结合力差等缺点。胶原因其优良的生物学特性广泛应用于可降解植入物材料，同时可作为覆层材料用于惰性生物材料的表面改性，但目前已报道的胶原覆层方法多为物理沉积法^[8-10]，涂层稳定性差，易降解。

实验通过化学偶联法将Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原覆层在钛合金片表面，以化学键连接得到的胶原涂层具有更强的稳定性。作为偶联剂的KH550无毒性、致畸性和致突变性，具有防腐蚀作用，可水解释放生物活性硅醇，不仅可以作为胶原的活性接枝部分，同时可作为一种骨修复材料^[38-40]。

将KH550处理后的钛合金片进行XPS分析，结果表明经KH550处理后的钛合金表面氮元素含量由1.51%增加至8.41%，氨基成功引入钛合金片表面，为进一步的胶原偶联提供基础。分别以特征肽段GPAGPSGPAGK和TGPAGAAGAR作为Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的定量基准，并以Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原标准品作为参照，采用HPLC-MS法分析钛合金片的胶原覆层量，结果表明钛合金片(Φ10 cm)上的Ⅰ型胶原覆层量为0.81 mg，Ⅱ型胶原覆层量为0.77 mg。

细胞培养方法是测定新型生物材料的常用方法。细胞在材料表面的黏附及增殖情况是评价生物材料生物相容性的一个重要指标，也是材料组织工程学的关键^[41-45]。实验将空白钛合金片与经胶原覆层后的钛合金片用于小鼠前成骨细胞培养，培养3 d至细胞铺满后观察细胞贴附形态、计数细胞数目并检测细胞活性。与空白钛合金片相比，胶原覆层钛合金片的细胞铺展面积更大，贴附形态更稳定，且细胞增殖速率和细胞活性均显著提高。结果表明Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原均可促进细胞贴附生长，提高钛合金片的生物相容性。

HPLC-MS法是当代最重要的蛋白分离及鉴定分析方法之一，在生物医药领域具有非常广泛的应用^[46-49]。实验采用HPLC-MS法分析从钛合金材料表面生长的细胞中提取的细胞蛋白，并采用搜库软件MaxQuant 1.4.1.2检索不同样品中蛋白种类和含量的差异，其中Ⅰ型胶原组表达量较多的蛋白中Ⅰ型胶原α1(I)链(P11087)在细胞增殖期大量表达，可为骨矿化提供基质；纤连蛋白(P11276)结合细胞表面的各种蛋白，参与细胞黏附和成骨细胞原纤维合成过程，并可调节Ⅰ型胶原沉积；巢蛋白-2(O88322)是一种细胞黏附糖蛋白，可参与细胞外基质的相互作用。Ⅱ型胶原组表达量较多的蛋白中骨桥蛋白(F8WIP8)在细胞矿化期大量表达，可促进羟基磷灰石沉积；碱性磷酸酶(P09242)在细胞分化早期大量表达，使局部磷酸含量升高以促使基质矿化；前层蛋白(P48678)可在成骨特性和骨形成中发挥作用。结果表明Ⅰ型胶原覆层材料培养的细胞多表达与基质合成有关的蛋白，而Ⅱ型胶原覆层材料培养的细胞多表达与矿化和钙盐沉积有关的蛋白。Ⅰ型胶原是哺乳动物体内含量最多的胶原，在骨形成中扮演重要角色，是骨基质的主要组成部分，而Ⅱ型胶原主要存在于关节软骨中，可促进钙盐在Ⅰ型胶原束上的沉积以完成骨生长。Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原在提高细胞生物相容性的基础上，均可促进成骨相关性蛋白的表达，且两者所促进表达的蛋白功能性有所差异。

该研究表明胶原覆层可提高材料的生物相容性，且不同胶原类型可影响细胞表达不同功能性蛋白，可定向培养细胞或组织，在未来的生物医药及生物材料等领域具有广泛的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

胶原涂层对3D打印种植体表面生物相容性的影响

Influence of collagen coating on the biocompatibility of three-dimensional printed implants

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	高文波, 马宗民, 李淑娴, 聂秀吉. 有限元分析不同骨质下种植体长度及直径对初期稳定性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 875-880.
[4]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[5]	张建国, 陈晨, 胡凤玲, 黄道宇, 宋亮. 三维有限元分析牙种植体孔隙结构设计及生物力学性能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 585-590.
[6]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[7]	乐国平, 张明, 席立成, 罗瀚文. 盐酸万古霉素@聚乳酸-羟基乙酸共聚物-壳聚糖-透明质酸复合缓释微球的制备及体外评价#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 528-534.
[8]	陈硕, 肖东琴, 李兴平, 冉斌, 匙峰, 张成栋, 邓丽, 黄南翔, 刘康, 冯刚, 段可. 钛植入体表面钽功能涂层制备及性能表征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 546-552.
[9]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[10]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[11]	王璨, 顾卫平, 蒋煜彬, 朱琳, 陈岗. 不同种植设计对下颌无牙颌应力影响的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 573-578.
[12]	王坤, 何本祥. 川续断皂苷VI修复兔肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 211-217.
[13]	冯冬菲, 何洪旭, 谢琪, 张立立, 周惠, 李威. 牙周重建生物功能与调节通路关键基因的筛选[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 253-259.
[14]	吴赛璇, 张咪, 董明, 陆颖, 牛卫东. 骨稳态过程中Keap1/Nrf2/ARE信号通路的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 271-275.
[15]	孙友强, 马超, 梁萌梦, 辛鹏飞, 张华, 向孝兵. 自噬在骨细胞中重要作用的最新研究进展：骨相关细胞活性和骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 276-282.