牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附与增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1552-1557.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.013

• 药物控释材料 drug delivery materials • 上一篇下一篇

牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附与增殖

郑丽珠¹，李小兵²，张苗¹，于璐¹，刘奕杉¹

¹新疆医科大学第一附属医院儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²四川大学华西口腔医院儿童口腔科，四川省成都市 610041

收稿日期:2016-12-11 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 刘奕杉，硕士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院儿童口腔科-口腔预防科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:郑丽珠，女，1990年生，河南省漯河市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事儿童口腔常见病的预防与诊疗及简单的早期矫治。
基金资助:
国家自然科学基金(81560178)

Adhesion and proliferation of dental pulp stem cells on the chitosan-fibrin composite scaffold

Zheng Li-zhu¹, Li Xiao-bing², Zhang Miao¹, Yu Lu¹, Liu Yi-shan¹

¹ Department of Pediatric Dentistry and Oral Protection, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Pediatric Dentistry, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2016-12-11 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Liu Yi-shan, Master, Chief physician, Department of Pediatric Dentistry and Oral Protection, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zheng Li-zhu, Studying for master’s degree, Department of Pediatric Dentistry and Oral Protection, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560178

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
年轻恒牙：恒牙已萌出，但在形态、结构上尚未形成和成熟的恒牙，其处于不断萌出中，所以临床牙冠的高度显得低，牙根尚未发育完全，根尖孔呈漏斗状，髓腔整体宽大，根管壁薄。年轻恒牙于萌出后2-3年牙根才达到应有的长度，3-5年根尖才能发育完成。
壳聚糖：又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，无味、无臭、无毒性，其来源广泛，取材方便，具有良好的生物降解性、生物相容性、生物功能性，还具有较强的抗菌能力和较强的机械强度，广泛应用于不同学科领域，尤其是生物医学材料领域。
纤维蛋白原：是由经病毒灭活处理的人纤维蛋白原、人凝血酶、纤溶抑制剂和氯化钙组成的止血剂。以模拟血凝的最后阶段反应，用凝血酶激活纤维蛋白原形成纤维蛋白，粘合于创口，起止血作用，其中的特殊成分还能减少感染、促进愈合。纤维蛋白原还具有良好的生物相容性，有一定的韧性但机械强度不高。

背景：随着组织工程技术的飞速发展，单一的生物支架材料很难满足组织工程的需要，通过合适的方法将两种或多种类型的材料组合起来，可以得到性能更加优良的复合支架材料。
目的：检测牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附与增殖情况。
方法：①采用改良酶消化法分离提取C57乳鼠牙髓干细胞，传代培养至第3代，体外成脂成骨诱导分化对细胞进行鉴定；②制备壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料，测定其孔径及孔隙率；③将壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料与第3代小鼠牙髓干细胞共培养，以细胞直接接种于培养板底部作为对照组，MTT法检测细胞增殖情况；④扫描电镜观察壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料的形态，细胞黏附、增殖及基质分泌情况。
结果与结论：①成功分离培养C57小鼠牙髓干细胞，经成脂成骨诱导分化后结果呈阳性；②壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料孔径为(105.32±22.10) μm，孔隙率为(87.714±1.276)%；③牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的增殖曲线与对照组基本一致，均为“S”型，培养第4-8天实验组增殖速度显著快于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④共培养第2天，细胞与壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料黏附紧密，生长状态良好，第4天，细胞明显开始增殖，体积增大，有丰富的细胞外基质，第6天，铺满于整个材料表面及空隙；⑤壳聚糖-纤维蛋白原复合材料是一种适宜牙髓干细胞黏附与增殖的支架材料。

ORCID: 0000-0002-2490-2995(郑丽珠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 壳聚糖, 纤维蛋白原, 支架材料, 年轻恒牙, 牙髓干细胞, 牙髓-牙本质复合体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With the rapid development of tissue engineering, a single biological scaffold material is hard to meet the needs of tissue engineering. Therefore, composite scaffolds with excellent performance will be obtained by combining two or more kinds of materials.
OBJECTIVE: To detect the adherence and proliferation of dental pulp stem cells on the Chitosan-fibrin composite scaffold.
METHODS: Dental pulp stem cells were isolated and extracted from C57 neonatal rats through modified enzyme-digestion method, and subcultured to the third generation, followed by adipogenic and osteogenic induction in vitro. Then, induced cells were identified. The chitosan-fibrinogen composite scaffold was prepared, and the pore size and porosity were determined. The chitosan-fibrin composite scaffold was co-cultured with passage 3 dental pulp stem cells to observe the cell proliferation by MTT assay, and the morphology, cell adhesion, proliferation and extracellular matrix secretion were observed under scanning electron microscope, while cells were inoculated directly on the bottom of culture plate as controls.
RESULTS AND CONCLUSION: The dental pulp stem cells were successfully isolated and cultivated, and positive for osteogenic and adipogenic differentiation. The pore size and porosity of the composite scaffold was (105.32±22.10) μm and (87.714±1.276)%, respectively. The “S”-shaped proliferation curve in the experimental group was similar with that in the control group; the proliferation rate in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 4-8 days of culture (P < 0.05). At the 2nd day after co-culture, the cells adhered tightly and grew well onto the composite scaffold; at the 4th day, the cells began to proliferate obviously full of extracellular matrix, and the cell volume was enlarged; the surface and pores of the scaffold were full of cells at the 6th day. These results indicate grew fast obviously that rich in began to proliferate obviously full of that the chitosan-fibrin composite scaffold is suitable for the adhesion and proliferation of dental pulp stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Fibrinogen, Dental Pulp, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郑丽珠，李小兵，张苗，于璐，刘奕杉. 牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附与增殖[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1552-1557.

Zheng Li-zhu, Li Xiao-bing, Zhang Miao, Yu Lu, Liu Yi-shan. Adhesion and proliferation of dental pulp stem cells on the chitosan-fibrin composite scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1552-1557.

图/表（结果） 5

2.1 牙髓干细胞的形态变化用酶消化法培养C57小鼠牙髓干细胞，在常规培养3 d后，可见细胞克隆出现(图1A)，大多数细胞为成纤维样细胞，呈短梭形，少数为多角形、不规则圆形、纺锤状，胞体丰满，约6 d汇合达80%-90%，进行首次传代，传代细胞约2 h后开始贴壁，细胞生长良好，此后平均5 d传代1次，传至第3代时，细胞已接近纯化，形态为均一短梭形(图1B)。

2.2 成骨诱导结果小鼠牙髓干细胞经成骨诱导2周后，可见矿化结节形成，茜素红染色后可见结节呈橘红色(图2A)，继续诱导至第3周时，可见矿化结节增多，结节染色加深(图2B)。

2.3 成脂诱导结果小鼠牙髓干细胞成脂诱导2周后，可见部分细胞逐渐变为短而宽的不规则形，细胞胞膜处出现长短不一的皱褶，有的胞浆内可见小而圆的串珠样或葡萄串样强折射区，随诱导时间延长而增大并相互融合；油红O染色后部分细胞内有阳性脂滴形成(图3A)，诱导25 d后油红O染色可见大部分细胞内有脂滴形成(图3B)。

2.4 复合支架材料物理学检测结果复合支架材料的平均孔径为(105.32±22.10) μm，孔隙率为(87.714±1.276)%，比较适合牙髓组织工程支架材料的要求。

2.5 细胞生长曲线牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上增殖的生长曲线趋势与单纯细胞对照组基本一致：均为“S”型，可以分为3个阶段：在培养第1-3天时，小鼠牙髓干细胞增殖缓慢，无明显差异；从第3天开始，细胞的增殖速度开始加快，第4-6天细胞克隆进一步扩大，细胞曲线显示此阶段的细胞数目在不断增加，至第6天达到最高峰，两组间差异均有显著性意义 (P < 0.05)，证明壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料能促进小鼠牙髓干细胞的增殖；第7，8天开始，细胞数量进入平台期(图4)。

2.6 扫描电镜下壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料形态及牙髓干细胞黏附情况复合支架材料呈孔隙相连蜂窝状，孔隙70-180 μm且分布较均匀，呈多边形，各孔隙的孔壁厚度大致相同，孔壁及孔隙之间都均匀的黏附着纤维蛋白原丝状结构(图5A)。

接种细胞10 h后孔隙内可见有细胞贴附，伸展性好，24 h后细胞分泌出细胞基质，贴附良好，可见多个突起附着于孔隙内壁(图5B)，前3 d细胞附着量无明显变化，第4天开始可见大量克隆细胞出现，黏附于复合支架材料孔隙及表面，第6天达高峰，可见复合支架材料上黏附一层厚厚的细胞(图5C)，表明壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料为牙髓干细胞提供了良好的黏附条件。

参考文献

[1]杨媛,彭楚,芳秦满,等.牙髓血运重建术治疗年轻恒牙根尖周病变的临床效果观察[J].中华口腔医学杂志,2013,48(2):81-85.

[2]李州,许庆安.干细胞和支架与牙髓再生及其血运重建[J].国际口腔医学杂志,2016,43(3):298-302.

[3]Wang Y, Zhao Y, Jia W, et al. Preliminary study on dental pulp stem cell-mediated pulp regeneration in canine immature permanent teeth. J Endod. 2013;39(2):195-201.

[4]D'Mello G, Moloney L. Management of coronal discolouration following a regenerative endodontic procedure in a maxillary incisor. Aust Dent J. 2016; 10(3):121-128.

[5]Bhardwaj N, Chakraborty S, Kundu SC. Freeze-gelled silk fibroin protein scaffolds for potential applications in soft tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2011;49(3):260-267.

[6]Woloszyk A, Buschmann J, Waschkies C, et al. Human Dental Pulp Stem Cells and Gingival Fibroblasts Seeded into Silk Fibroin Scaffolds Have the Same Ability in Attracting Vessels. Front Physiol. 2016;7:140.

[7]雷鸣,高丽娜,陈发明,等.牙髓组织工程和再生中生物支架材料的进展[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2013,23(1):51-56.

[8]Cao B, Yin J, Yan S, et al. Porous scaffolds based on cross-linking of poly(L-glutamic acid). Macromol Biosci. 2011; 11(3):427-434.

[9]别利克孜•卡德尔,刘奕杉,王璇,等.改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞[J].中国组织工程研究,2013,17(10):1793-1800.

[10]Gong T, Heng BC, Lo EC, et al. Current Advance and Future Prospects of Tissue Engineering Approach to Dentin/Pulp Regenerative Therapy. Stem Cells Int. 2016;2016:9204574.

[11]Conde MC, Chisini LA, Demarco FF, et al. Stem cell-based pulp tissue engineering: variables enrolled in translation from the bench to the bedside, a systematic review of literature. Int Endod J. 2016;49(6):543-550.

[12]Piva E, Silva AF, Nör JE. Functionalized scaffolds to control dental pulp stem cell fate. J Endod. 2014;40(4 Suppl):S33-40.

[13]王洁,刘加强,房兵.牙髓干细胞在组织工程中的研究进展[J].口腔颌面修复学杂志,2013,14(3):183-186.

[14]史诗彧,谢家敏. 牙髓干细胞在组织工程领域的研究进展[J].华西口腔医学杂志,2015,33(6):656-659.

[15]任飞,周慧,刘建平,等.转化生长因子β3联合肝素在人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化中的作用[J].实用医学杂志,2014, 30(12):1887-1890.

[16]王亦菁,张晓东,李里,等.三维培养的牙髓干细胞参与牙髓损伤修复能力的实验研究[J].临床口腔医学杂志,2011,27(10): 582-584.

[17]贺慧霞,金岩,史俊南, 等. bFGF、TGF-β对人牙髓干细胞增殖和分化能力的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2004,14(7): 359-363.

[18]林颖,秦伟,邹瑞, 等.促丝裂原激活蛋白激酶在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化和牙髓损伤修复中的作用[J].国际口腔医学杂志,2016,43(3):343-347.

[19]Leong DJ, Setzer FC, Trope M, et al. Biocompatibility of two experimental scaffolds for regenerative endodontics. Restor Dent Endod. 2016;41(2):98-105.

[20]年争好,李晖,李瑞欣,等.纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合骨组织工程支架材料的生物相容性[J].中国组织工程研究, 2015,19(8):1149-1154.

[21]吕孝帅,李正茂,王海燕, 等. 生物活性玻璃-丝素蛋白复合膜支持人牙髓干细胞增殖与分化初探[J].中华口腔医学杂志,2015, 50(12):725-730.

[22]李珊,樊明文,梁素霞.成人牙髓干细胞与壳聚糖-磷酸三钙复合材料相容性试验研究[J].口腔医学研究,2006,22(3):264-266.

[23]Baniasadi H, Ramazani S A A, Mashayekhan S. Fabrication and characterization of conductive chitosan/gelatin-based scaffolds for nerve tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2015;74:360-366.

[24]Shukla SK, Mishra AK, Arotiba OA, et al. Chitosan-based nanomaterials: a state-of-the-art review. Int J Biol Macromol. 2013;59:46-58.

[25]Jridi M, Hajji S, Ayed HB, et al. Physical, structural, antioxidant and antimicrobial properties of gelatin-chitosan composite edible films. Int J Biol Macromol. 2014;67:373-379.

[26]Douglas TE, Krok-Borkowicz M, Macuda A, et al. Enrichment of thermosensitive chitosan hydrogels with glycerol and alkaline phosphatase for bone tissue engineering applications. Acta Bioeng Biomech. 2016;18(2):51-57.

[27]沈剑虹,杨甫,姚麒,等.结合bpV(pic)的壳聚糖支架对神经干细胞生长分化的影响[J].中华实验外科杂志,2015,32(8):1925-1928.

[28]薛震,牛丽媛,安刚,等.纳米羟基磷灰石/壳聚糖/半水硫酸钙为可注射骨组织工程支架材料的可行性[J].中国组织工程研究,2015, 19(8):1160-1164.

[29]祁伟,左强,崔维顶,等.采用纤维蛋白凝胶种植技术体外构建组织工程软骨[J].江苏医药,2011,37(12): 13 68-1370.

[30]Ding B, Gao H, Song J, et al. Tough and Cell-Compatible Chitosan Physical Hydrogels for Mouse Bone Mesenchymal Stem Cells in Vitro. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(30): 19739-19746.

[31]刘清宇,王富友,刘俊利,等.含有天然钙化软骨层骨软骨支架的研制[J].中华创伤杂志,2014,30(5):467-470.

[32]鳄贤,邵林.骨组织工程多孔陶瓷支架制备工艺的研究进展[J].医学临床研究,2014,31(3):551-554.

[33]Buizer AT, Veldhuizen AG, Bulstra SK, et al. Static versus vacuum cell seeding on high and low porosity ceramic scaffolds. J Biomater Appl. 2014;29(1):3-13.

[34]聂姗姗,刘佳,张瑞涵,等.牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖[J].中国组织工程研究, 2014,18(50): 8162-8167.

引言

年轻恒牙萌出后两三年的时间牙根可以达到恒牙应有的长度，3-5年后牙根发育完全。萌出后牙根的继续发育及根尖孔的闭合有赖于牙髓的作用。龋病、畸形中央尖的折断及各种外伤等原因都可能导致牙髓感染、坏死，甚至发生根尖周组织炎症，并进一步影响牙根的生长发育^[1]。牙髓组织具有形成牙本质、感觉、营养和防御的功能，其被坚硬的牙本质包围，牙髓组织中的血供只能通过细小的根尖孔传输，这样就使得其缺乏侧支循环，一旦受到感染和损伤便不易逆转，牙根就会停止继续发育，根尖孔不再发生闭合而呈停滞开放状态，这将会影响牙齿的完整性及功能，最终可能导致牙齿脆性增大，继而折断甚至脱落^[2-3]。因此，治疗发育不完全的年轻恒牙的牙髓感染，首选保存有活力的牙髓，诱导牙髓-牙本质复合体的组织再生，进一步促进根尖形成^[4]。

随着组织工程学的飞速发展及牙齿形成机制研究的逐步深入探索，牙齿组织工程化已成为国内外共同关注的课题^[5]。它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合，构建出新的组织或器官，用于替代和修复病变、缺损的组织器官，重建生理功能^[6]。牙齿的主体是由牙髓-牙本质复合体构成，这也是实现牙齿组织工程化的第一步。与其他组织工程研究类似，牙髓组织的再生也有赖于设计合适的生物支架材料^[7]。研究表明，单一的材料或多或少都存在缺点，把两种或多种材料复合在一起可以互相弥补，制作出性能更加优良的复合支架材料^[8]，实验制备壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料，并以小鼠牙髓干细胞作为种子细胞进行体外培养，检测牙髓干细胞在该复合支架材料上的黏附与增殖情况，为临床治疗年轻恒牙牙髓感染及外伤等提供基础研究依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞形态学观察。

1.2 时间及地点 2015年6月至2016年5月在新疆医科大学医学研究中心干细胞室及动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 主要试剂胎牛血清(Hyclone，澳洲)；吲哚美辛、地塞米松、L-谷氨酰胺、牛胰岛素、二甲基亚砜(Sigma，美国)；抗坏血酸、PBS、胰蛋白酶、双抗、β-甘油磷酸钠、地塞米松、α-MEM培养液(Hyclone，美国)；Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)；油红O染色试剂盒、茜素红染液试剂盒(建成，南京)。

1.3.2 主要仪器超净无菌工作台(博讯，中国)；CO₂恒温孵育箱、酶联免疫检测仪(Thermo，美国)；荧光倒置显微镜、正置显微镜(Leica，德国)；恒温水浴箱(精宏，中国)；扫描电镜(Jeol，日本)；高速冷冻离心机(Heraeus，美国)。

1.3.3 主要材料壳聚糖(Sigma，美国)；纤维蛋白原(Sigma，美国)；凝血酶原(Sigma，美国)。

1.3.4 实验动物 5-7 d龄C57小鼠20只，雌雄不限，体质量(17.0±1.5)g，由新疆医科大学动物研究中心提供，许可证号：SYXK(新)2010-0001。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠牙髓干细胞的提取及培养引颈处死5-7 d龄C57小鼠，将其置于体积分数为75%乙醇中浸泡2 min，解剖上、下颌骨，并分离取出上、下颌切牙，剪除根尖1/3部分，用拔髓针及显微器械取出剩余完整牙髓组织，PBS反复清洗后，采用课题组已经验证的改良酶消化法分离提取C57小鼠牙髓干细胞^[9]。原代细胞接种3 d后PBS冲洗、换液，以后每隔2 d换1次液，倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞80%-90%融合后用胰蛋白酶消化传代培养。传代细胞次日PBS冲洗、换液，差速贴壁法纯化C57小鼠牙髓干细胞，以后每隔2 d换1次液。

1.4.2 牙髓干细胞成骨诱导分化及茜素红染色取传代至第3代的小鼠牙髓干细胞，以1×10⁴/cm²的密度接种于6孔板内，完全培养基培养，待细胞融合至培养皿的70%-80%，换成骨诱导液(含10 nmol/L地塞米松， 0.2 mmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，体积分数为10%胎牛血清，α-MEM培养基)，每3 d换1次液，阴性对照为未添加诱导液成分培养的细胞，培养两三周后观察到有结节形成，弃培养液，固定液固定10 min，PBS冲洗3遍，0.1%茜素红(pH=8.3)室温孵育30 min，PBS冲洗3-5遍，倒置显微镜观察拍照。

1.4.3 牙髓干细胞成脂诱导分化及油红O染色取传代至第3代的小鼠牙髓干细胞，以1×10⁴/cm²的密度接种于6孔板中，完全培养基培养，待细胞融合至培养皿的70%-80%，换成脂诱导A、B液交替培养，A液(α-MEM、胎牛血清、双抗、吲哚美辛，胰岛素，3-异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松)每3 d换1次液，B液(α-MEM、胎牛血清、双抗、胰岛素)每2 d换1次液，未添加诱导液成分培养的细胞作阴性对照，培养两三周，弃培养液，固定液固定30 min，PBS冲洗2遍，0.1%的油红O溶液室温孵育10 min，PBS冲洗，倒置相差显微镜观察拍照。

1.4.4 复合支架的制备及物理学检测将壳聚糖置于完全培养液中浸泡过夜，用无菌纱布吸去多余的液体，刚好浸入用无血清培养基配置成的20 g/L纤维蛋白原溶液中 5 min，然后滴加1或2滴2 U/mL凝血酶原，室温下静置15-30 min，使之形成稳定的凝胶构成壳聚糖-纤维蛋白原复合支架。

将复合支架材料冷冻干燥，置于样品基台上，二氧化碳临界点干燥，真空下喷金镀膜，扫描电镜观察支架材料的形貌。随机选取支架材料扫描电镜图片中的50个孔隙，测量每一孔径的最大直径，以其平均值作为该复合支架材料的平均孔径。采用排乙醇法测定复合支架材料的孔隙率。首先选取1个玻璃密闭瓶，将其装满乙醇，称质量记为m₁，选取1块复合支架样本，称质量记为m₀，将其完全浸入乙醇中，抽干瓶内气体，直至乙醇完全充盈于支架样本中，再加满乙醇，称质量记为m₂，然后取出复合支架样本，称取剩余乙醇及密闭瓶的质量记为m₃，则复合支架样本的孔隙率(P)为：P%=[(m₂-m₃-m₀)/(m₁-m₃)]×%，同种方法测量5个样本，取其平均值即为复合支架材料的孔隙率。

1.4.5 复合支架材料与细胞共培养将第3代小鼠牙髓干细胞用0.25 g/L胰蛋白酶消化计数，制成细胞浓度为 2×10⁹ L^-1的细胞悬液，混匀后取50 μL悬液滴加于形成纤维蛋白凝胶的壳聚糖上，放入体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养4 h，取出并小心翻转支架，在支架的另一面再滴加 50 μL细胞悬液，继续培养4 h，然后加入完全培养基进行培养，每2 d换1次液。

1.4.6 生长曲线测定用0.25 g/L的胰蛋白酶消化生长状态良好的第3代小鼠牙髓干细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为3 000个/孔接种于放入复合支架材料的96孔培养板中(实验组)，同时以细胞直接接种于培养板底部作为对照组，并设置空白调零组，每组8孔并设置2个复孔，培养板四周的孔加入PBS，待大部分细胞贴壁后加入5 g/L MTT液20 μL，37 ℃恒温箱中避光孵育4 h，小心取出培养板，吸去培养液，每孔加入420 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测量波长为490 nm处的吸光度值。每天每组测量3孔，重复测量3次，取平均值，连续测8 d，横坐标为时间，纵坐标为吸光度，分别绘制两组细胞的生长曲线。

1.4.7 扫描电镜观察复合支架材料与细胞共培养1，3，5，7 d分别取出1块细胞-复合支架标本，用PBS反复冲洗，2.5%戊二醛先固定1 h，然后用1%四氧化锇固定，常规脱水、干燥、包埋、喷金，扫描电镜观察细胞状态及黏附情况。

1.5 主要观察指标 ①壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料的孔径及孔隙率；②牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附及生长情况。

1.6 统计学分析采用SPSS17.0统计软件包对数据进行分析整理，计量资料以x(_)±s表示。两样本均值比较采用独立样本t 检验。检验水准a=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

种子细胞、生物支架材料和生长因子微环境被认为是组织工程的三大要素^[10]。种子细胞及支架材料为组织再生提供了至关重要的再生条件，直接关系到组织再生的成功与失败^[11]。研究者们已证实牙髓干细胞在体外经诱导后可以分化为成牙本质样细胞，而且在体内可以形成牙髓牙本质复合体样结构，是牙髓组织中最具有应用潜能的组织化活性细胞，可与生物材料有效的结合，在牙髓牙本质复合体再生及牙再生中具有广泛的应用前景^[12-14]。干细胞自我更新能力表现为在体内可增殖形成组织并维持自身数量，体外则呈克隆性生长，因而克隆化培养既是分离干细胞的方法，也是鉴定干细胞的手段之一，在诱导条件下牙髓干细胞可向成脂成骨及成牙本质样细胞方向分化，证明其符合干细胞的特征，可以作为牙髓组织工程的种子细胞^[15-18]。支架材料作为人工的细胞外基质，具有三维结构的孔隙度和孔隙大小，允许干细胞或祖细胞迁移，能够支持细胞、组织、神经、血管生成和为其提供必要的营养支持，而且还能形成与体内相似的细胞生长环境，引导组织再生^[19]。因此，优选相容性好的支架材料是非常关键的。

牙髓牙本质复合体是一种软硬共存的组织，因此需要一种适合软硬组织来源并能与牙髓干细胞很好结合的复合型生物支架材料，这样就有望构建出牙本质和牙髓组织有序相接的生理性牙髓牙本质复合体样结构。复合型生物材料是取不同材料的优点以最适的比例混合加工而成，它可以弥补单一材料的不足，最大限度的满足牙髓牙本质组织工程化的需要^[20-22]。

壳聚糖是一种来自于自然界的生物聚合物，无色，无味，广泛存在于自然界中，其来源广泛，取材方便，具有良好的生物降解性、生物相容性、生物功能性，且无细胞毒性，还具有较强的抗菌能力和较强的机械强度，广泛应用于不同学科领域，尤其是生物医学材料领域^[23-25]。国外学者Douglas等^[26]发现壳聚糖水凝胶可以提高骨组织工程材料的适用性。国内学者沈剑虹等^[27]研究表明壳聚糖支架对神经干细胞有良好的相容性，吸附FFEN抑制剂的壳聚糖支架能促进神经干细胞向支架迁移并向神经元分化。但是，其可塑性和亲水性较差^[28]，而纤维蛋白原刚好弥补了这一点，其单体在凝血酶原的作用下可以聚合成具有可塑性、亲水性、可降解性的立体网络结构凝胶，并且能进一步促进细胞增殖、黏附和细胞外基质的分泌^[29]。纤维蛋白原孔隙率较大，通过较大附着面积促进了细胞的增殖、分化，而且还可以促进营养物质在支架与周围组织间的运输。纤维蛋白原虽具有一定的韧性，但是其机械强度较差。据此，实验结合壳聚糖和纤维蛋白原组合成一种新的三维多孔结构复合材料，使其具有良好的可塑性、细胞黏附性和机械强度，来满足组织工程支架材料的基本要求。壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料还具备双层多孔结构，其孔隙的三维立体结构有利于细胞攀附生长，保证了组织再生空间的维持，还具有良好的成骨诱导性，生物相容性及抗感染能力。

在组织工程学中，生物支架材料与种子细胞体外复合培养是检测支架材料生物相容性的最敏感的方法。实验将小鼠牙髓干细胞接种到壳聚糖-纤维蛋白原复合物进行体外培养，扫描电镜显示复合支架材料呈多孔网状结构，小鼠牙髓干细胞能在支架材料表面及孔隙中贴附牢固，均匀伸展并大量增殖。MTT实验证明此复合支架材料能促进牙髓干细胞的增殖，能为小鼠牙髓干细胞的培养提供良好的条件^[30]。合适的孔径有利于细胞、纤维、血管的长入，且不同孔内的细胞容易通过生长增殖实现连接。如果孔径太小，细胞难以长入孔内，影响了细胞在支架内部的生长增殖。反之，孔径过大则不利于细胞的黏附。对于种子细胞的迁移、增殖和血管化都归结于一定孔隙率的支架材料。实验研究制备的复合支架材料平均孔径为(105.32±22.10)μm，孔隙率为(87.714±1.276)%，比较适合牙髓组织工程^[³¹^-³⁴^]，实验结果也表明壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料有利于牙髓干细胞的增殖与黏附，可为临床治疗年轻恒牙牙髓感染及外伤等提供基础性的研究依据。

此外壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料再生牙髓牙本质复合体样结构的效果还需进一步通过体内实验加以证实，其降解速率也需要进一步在体内实验中加以检测，课题组前期实验已经证明牙髓干细胞具有低免疫原性，同时具有一定的调节免疫反应的能力，可抑制混合淋巴细胞的体外增殖反应^[34]，作者后续会结合生长因子进行小鼠体内研究来进一步证明其作为组织工程支架材料的可优选性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

牙髓干细胞在壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料上的黏附与增殖

Adhesion and proliferation of dental pulp stem cells on the chitosan-fibrin composite scaffold

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[2]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[3]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[4]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[5]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[6]	乐国平, 张明, 席立成, 罗瀚文. 盐酸万古霉素@聚乳酸-羟基乙酸共聚物-壳聚糖-透明质酸复合缓释微球的制备及体外评价#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 528-534.
[7]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[8]	李璇, 孙一民, 李龙飙, 王振铭, 杨静, 汪成林, 叶玲. 纳米改性聚己内酯微球的构建及对牙髓细胞的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1530-1536.
[9]	叶翔凌, 夏远军, 王波群, 康正阳, 吴斌. 3D打印聚羟基丁酸戊酸共聚酯/半水硫酸钙支架复合壳聚糖水凝胶涂层的性能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1574-1581.
[10]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[11]	黄兰, 王琴, 葛颂. 自组装肽在牙体牙髓牙周病学领域的研究进展及应用热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1625-1630.
[12]	魏珊, 李勤, 苏怡. 人乳牙牙髓干细胞的研究热点及应用潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 125-129.
[13]	林苗远, 李豫皖, 刘毅, 陈贝, 张莉. 组织工程皮肤的研究热点及应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 153-159.
[14]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[15]	张志文, 黄玉良, 张理选, 王晓锋, 陈锐雄. 碱性成纤维细胞生长因子复合脱细胞骨基质/壳聚糖支架修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5439-5444.