载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸缓释材料在兔脊柱结核模型体内的缓释性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1520-1526.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.008

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载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸缓释材料在兔脊柱结核模型体内的缓释性能

王骞¹，耿广起²，丛晓明³，刘海涛²，施建党²，王自立²，马文鑫²，孙宇航⁴

¹美国南佛罗里达大学药学院，美国坦帕 33612；²宁夏医科大学总医院脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750004；³山东省威海卫人民医院骨科，山东省威海市 264200；4宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750001

收稿日期:2017-02-12 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 施建党，宁夏医科大学总医院脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:王骞，男，1984年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，2012年美国南弗罗里达大学药学院毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱骨科研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81060149)；宁夏自然科学基金项目(NZ10117)

The slow release performance of calcium sulfate/poly(amino acid) compound materials carrying triple anti-tuberculosis drugs in a rabbit model of spinal tuberculosis

Wang Qian¹, Geng Guang-qi², Cong Xiao-ming³, Liu Hai-tao², Shi Jian-dang², Wang Zi-li², Ma Wen-xin², Sun Yu-hang⁴

¹School of Pharmacy, University of South Florida, Tampa 33612, USA; ²Department of Spine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ³Department of Orthopedics, Weihaiwei People’s Hospital, Weihai 264200, Shandong Province, China; ⁴ Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2017-02-12 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Shi Jian-dang, Department of Spine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Wang Qian, Master, Attending physician, School of Pharmacy, University of South Florida, Tampa 33612, USA
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060149; the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. NZ10117

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的缓释性能：首先，将载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料放入脊柱结核模型椎体病灶缺损之后，抗痨药物可缓慢、持续释放，时间最长可达3个月之久。局部释放的药物不仅进入局部病椎骨与其表面的腰大肌组织中，而且部分可经吸收进入全身血液循环之中。这种局部缓释作用是由于抗痨药物直接从人工材料表面扩散及人工材料降解后硫酸钙晶体间药物团暴露所产生的药物分散而形成的。3种抗痨药能同时从缓释材料中释放出来进入局部病变部位联合抗痨，较以往研究的单药缓释材料能够更加高效、快速地杀灭结核杆菌，更加符合抗痨药物的使用原则。病灶骨、腰大肌组织中3种抗痨药在每个检测时间点的药物浓度均高于静脉血药物浓度。

背景：前期研究已对载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料进行了理化性能、体内体外缓释释药性能等方面的深入研究，证实其具有良好的局部缓释性能。
目的：探究在兔脊柱结核模型病灶中，载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的药物缓释性能。
方法：取24只新西兰大白兔，制作L4-5椎体脊柱结核模型，清除结核病灶后，随机分2组干预，实验组于骨缺损处植入载异烟肼、利福平、吡嗪酰胺三联抗痨药的硫酸钙/聚氨基酸人工骨材料，对照组植入硫酸钙/聚氨基酸人工骨材料。植入后2，4，6，8周，检测植骨处骨质及邻近腰大肌组织、下腔静脉血中异烟肼、利福平、吡嗪酰胺的浓度。
结果与结论：实验组中，①异烟肼植入后8周在病椎骨和腰大肌中仍可维持最低杀菌浓度，植入后12周时尚处于最低抑菌浓度；在静脉血中最低杀菌浓度仅可持续2周，最低抑菌浓度仅可维持到植入后第8周；②利福平植入后4周在腰大肌和病椎骨组织中可为最低杀菌浓度，最低抑菌浓度能持续到植入后8周；静脉血中最低抑菌浓度度仅可持续到植入后4周；③吡嗪酰胺在腰大肌和病椎骨组织中最低杀菌浓度可持续到植入后8周，最低抑菌浓度度可持续到植入后12周；而静脉血中药物浓度到植入后8周仍可达到最低抑菌浓度。对照组植骨处骨质、下腔静脉血及邻近腰大肌标本中均未检测到相关药物浓度，其结果可用于基线校对。结果表明，在兔脊柱结核模型病椎缺损处植入载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料后，3种抗痨药物均可持续、缓慢释放，局部药物浓度及持续时间均高于全身血液中的浓度和持续时间。

ORCID: 0000-0002-3216-2448(王骞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 缓释材料, 硫酸钙/聚氨基酸人工材料, 异烟肼、利福平、吡嗪酰胺, 局部缓释, 高效液相色谱法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Calcium sulfate/poly amino acid compound materials carrying triple anti-tuberculosis drugs have been proved to have excellent slow release performance based on our preliminary studies on the physical and chemical properties and the release properties of the compound materials.
OBJECTIVE: To observe the slow release performance of the calcium sulfate/poly(amino acid) compound material carrying triple anti-tuberculosis drugs in a rabbit model of spinal tuberculosis.
METHODS: Twenty-four New Zealand white rabbits were used to make L4-5 spinal tuberculosis models and divided into two groups in a random way following removal of tuberculosis lesions. Calcium sulfate/poly amino acid compound material carrying isoniazide, rifampicin, pyrazinamide or calcium sulfate/poly(amino acid) compound material with no drugs was implanted into the defect in the experimental or control group, respectively. At 2, 4, 6 and 8 weeks after implantation, the concentrations of isoniazid, rifampicin and pyrazinamide in the defect region, including the bone tissue, adjacent psoas major and inferior vena cava, were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental group, the isoniazid levels in the damaged bone tissue and psoas major were kept in minimum bactericidal concentration (MBC) at 8 weeks after implantation and in the minimum inhibitory concentration (MIC) at the end of 12 weeks after implantation, while its level in the vein was kept in MBC at 2 weeks and in MIC at 8 weeks. The rifampicin levels in the bone tissue and psoas major were kept in MBC at 4 weeks after implantation and in the MIC at 8 weeks after implantation, while its level in the vein was kept MIC at 4 weeks. The pyrazinamide levels in the damaged bone tissue and psoas major were kept in MBC at 8 weeks after implantation and in the MIC until 8 weeks after implantation, while its level in the vein was kept MIC at 8 weeks. In the control group, there were no levels of isoniazid, rifampicin and pyrazinamide in the damaged bone tissue, adjacent psoas major and inferior vena cava in comparison with the baseline. These results show that isoniazid, rifampicin and pyrazinamide in the defect region can achieve sustained slow release in the rabbit model of spinal tuberculosis after implantation of the calcium sulfate/poly(amino acid) compound material carrying triple anti-tuberculosis drugs. In addition, the local drug concentration and duration in the defect region are better than those in the blood.

Key words: Calcium Sulfate, Isoniazid, Rifampin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王骞，耿广起，丛晓明，刘海涛，施建党，王自立，马文鑫，孙宇航. 载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸缓释材料在兔脊柱结核模型体内的缓释性能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1520-1526.

Wang Qian1, Geng Guang-qi2, Cong Xiao-ming3, Liu Hai-tao2, Shi Jian-dang2, Wang Zi-li2, Ma Wen-xin2, Sun Yu-hang4 . The slow release performance of calcium sulfate/poly(amino acid) compound materials carrying triple anti-tuberculosis drugs in a rabbit model of spinal tuberculosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1520-1526.

图/表（结果） 6

2.1 标准曲线、精密度、回收率实验结果通过加权线性回归法得出最终的线性回归标准曲线方程为：异烟肼 C_浓度=(S+475.9)/9 469，利福平C_浓度=(S+1 705)/6 145，比嗪酰胺C_浓度=(S+437.6)/17 330，r=0.999 4，线性关系良好。

取所配制溶液进样3次测定，结果相对标准偏差小于0.5%，方法精密度良好。异烟肼回收率为99.45%，利福平回收率为99.87%，吡嗪酰胺回收率为98.94%(n=5)。

2.2 HPLC检测结果实验组3种标本在不同时段检测到不同浓度的抗痨药物(表1-3)。

由实验组HPLC色谱图可知，吡嗪酰胺的出峰时间约为2.7 min，异烟肼的出峰时间约为3.4 min，利福平的出峰时间约为8.9 min (图1-3)。对照组未检测到抗痨药物浓度，测得色谱图用于基线校对。

文献表明，异烟肼对结核杆菌的最低抑菌浓度为 0.02-0.05 mg/L，最低杀菌浓度为10倍的最低抑菌浓度^[18-19]；利福平对结核分枝杆菌和其他分枝杆菌的最低抑菌浓度为0.39-1.56 mg/L、最低杀菌浓度为0.78-3.125 mg/L；吡嗪酰胺的最低抑菌浓度还存在争议，当在pH=5.5的环境中的最低抑菌浓度为12.5 mg/L，在50 mg/L时即有杀灭结核分枝杆菌的功效。

异烟肼植入后2周时，在静脉血、病灶骨组织及腰大肌中均达到最低杀菌浓度；植入后4，8周时，在病灶骨组织及腰大肌中达到最低杀菌浓度，在静脉血中仅达到最低抑菌浓度；植入后12周时，病灶骨组织及腰大肌中达到最低抑菌浓度，而静脉血中未测到。

植入后2，4周时，利福平在病灶骨组织及腰大肌中均可达到最低杀菌浓度，但在静脉血中仅仅达到最低抑菌浓度的水平；植入后8周时，在病灶骨组织及腰大肌中仍然可达到最低抑菌浓度，而此时静脉血中未达到最低抑菌浓度；植入后12周时，在病灶骨组织中可检测到存在，但未达到最低抑菌浓度水平，而腰大肌及静脉血中未测到利福平。

植入后2，4，8周时，吡嗪酰胺在病灶骨组织及腰大肌中均达到最低杀菌浓度水平，同时在静脉血中也均达到最低抑菌浓度水平；植入后12周时，在病灶骨组织及腰大肌中仍然能够达到最低抑菌浓度水平，此时在静脉血中吡嗪酰胺未达到最低抑菌浓度水平。

使用Kruskal-Wallis H 检验，当P < 0.01时，按照a=0.05的水准，则认为同一时间两个样本药物浓度存在统计学意义。然后用Nemenyi法进行两两样本之间的比较，采用a=0.05的水准，认为同一时间腰大肌与病灶骨组织中药物浓度没有差别，而同一时间病灶骨组织中的药物浓度高于同期静脉血中的药物浓度，同时同一时间腰大肌中药物浓度则要高于同期静脉血中的药物浓度。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2012年9月至2013年4月在宁夏医科大学科学技术实验中心完成。

1.3 材料

实验试剂及仪器：利福平、异烟肼、吡嗪酰胺标准品纯度分别为99%、99%、98%，硫酸钙与聚氨基酸复合材料为前期实验制备，日立D-2000高效液相色谱仪。

实验动物及分组：新西兰大白兔24只，其中雌兔6只，雄兔18只，体质量(3.0±0.5)kg，由宁夏医科大学科学技术实验中心提供，分笼饲养。将24只兔随机分为实验组与对照组，每组12只。

1.4 实验方法

缓释材料的制备：载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的制备，按照作者前期研究结果的方法进行^[10-13]，将硫酸钙、氨基酸、异烟肼、利福平及吡嗪酰胺按9∶1∶0.3∶0.3∶1.2的比例混合，制备载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工骨材料^[10]，均制备成长5 mm、宽3.5 mm、高 3.5 mm规则骨块，利用电子天平测得含三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料的人工骨块质量为144.24 mg，所含吡嗪酰胺、异烟肼、利福平的质量分别为14.67，3.67， 3.67 mg。同法制备未载药硫酸钙/聚氨基酸人工骨材料，不添加抗痨药物。

兔脊柱结核动物模型的制作：取24只兔，按文献[15]的方法制作L_4-5脊柱结核模型，经X射线、CT、MRI观察存在着椎间隙狭窄或消失、椎体骨质破坏、空洞、死骨、椎旁脓肿及细菌学、组织病理学检测确定为成功兔脊柱结核动物模型。

缓释材料的植入：确认造模成功后，麻醉实验兔、备皮、消毒后，在其左侧L_4-5椎体横突前用手术刀作一长约 3 cm的切口，分离并显露L_4-5椎体及其椎间盘左侧，在结核病灶清除后、均凿成与骨块相同大小的规则骨槽作为植骨床，实验组骨槽内植入载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工骨缓释材料；对照组植入硫酸钙/聚氨基酸人工骨材料。经彻底止血后予以分层缝合后，将金霉素软膏涂抹于刀口。术后将实验动物归笼饲养，注意观察记录实验动物术后的一般情况、刀口愈合等情况。

1.5 主要观察指标

1.5.1 动物取材及测试样本的制备植入后2，4，8，12周时，每组随机处死实验兔3只，取处死动物的下腔静脉血液4 mL，平均分为2份，严格避光低温保存，后用甲醇萃取；切取2块植骨处椎体边缘的骨组织，长、宽、高均为2 mm；切取植骨处椎体外表面腰大肌组织2份，其长、宽、高各2 mm。分别将各标本放入试管用生理盐水反复冲洗，避光并低温保存。把骨组织锉碎后，把肌肉充分剪碎，行甲醇萃取。把处理后的样本充分振荡二三分钟，之后把样本放入低温离心机，离心后取上清液过滤。用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)依次测定各样本中异烟肼、利福平及吡嗪酰胺的药物浓度。

对照品制备：取异烟肼、利福平及吡嗪酰胺适量，超纯水溶解成浓度分别为0.03，0.03，0.12 g/L的溶液。分别将对照溶液2，4，5，8，10mL置于10 mL容量瓶中，超纯水标定，测定后以药物的峰面积为X轴，浓度为Y轴，通过加权线性回归法得出最终的线性回归方程。

1.5.2 HPLC色谱条件、标准曲线测定

色谱条件：使用Water Spherisorb CN 5 μm的色谱柱；其中流动相是0.01 mol/mL庚烷磺酸钠溶液-乙腈(体积比为45∶55)，将流速设置为3.0 mL/min；柱箱温度控制在 30 ℃；波长220-400 nm；时间15 min^[9^，¹²^，^16]。研究使用庚烷磺酸钠溶液-乙腈作为流动相，其中乙腈可促进异烟肼与内源性物质的分离^[17]。

标准曲线测定：将配置好的对照品，在特定的色谱条件下予以测定，以药物的峰面积为X轴，浓度为Y轴，利用加权线性回归的方法，得出标准曲线回归方程。

1.5.3 精密度及回收率实验依据FDA生物样品精密度及回收率实验要求，对萃取溶液进样3次测定，进行精密度实验。按比例精确称取异烟肼3 mg、利福平3 mg、吡嗪酰胺12 mg，置于100 mL容量瓶中，用超纯水振荡溶解，取样测定，行回收率实验。

1.5.4 测量参数的计算将所测峰面积值代入上述标准曲线回归方程，可计算出各样本中的药物浓度。其后各个样本的药物浓度可根据组织的干湿重比、稀释比(1∶4)换算得出，再利用校正公式根据所测的血红蛋白(Hb)含量得出经校正组织浓度。利用如下方程算出各个样本中归因血污染的药物浓度。

归因血污染的药物浓度(μg/g)=组织均浆中Hb/血液中Hb×s×k×(100-Ht)/100，公式中k代表组织稀释因子，s代表血浆药物浓度(mg/L)，而Ht代表红细胞压积(%)。

1.6 统计学分析所得数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，使用Kruskal-Wallis H检验对同一时间的原始资料进行分析。对同一时间药物在静脉血、病椎边缘骨及病椎外表面腰大肌的浓度用Nemenyi法两两样本之间比较。当P < 0.01时，按照a=0.05的水准，则认为同一时间两个样本药物浓度存在统计学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

由于病灶壁硬化骨的“屏障”作用，使得病灶局部的药物浓度低或检测不到，故选用硫酸钙/聚氨基酸复合材料载异烟肼、利福平、吡嗪酰胺三联抗痨药，因为这种材料兼具抗结核和骨缺损充填支撑传导成骨的双重作用，可用于解决临床脊柱结核治疗中所面临的植骨及抗结核的难题。同时，异烟肼、利福平和吡嗪酰胺是目前抗结核方案中的一线主药，3种药物既有各自的抗痨特点也有协同作用的特点。3种药物作用于不同代谢菌群和细胞内外菌群，能在不同pH值的情况下达到杀菌和灭菌作用，病灶局部在较高的药物浓度下协同作用，提高了抗痨效果、缩短了治疗时间。将硫酸钙/聚氨基酸∶异烟肼∶利福平∶吡嗪酰胺按1∶0.03∶0.03∶0.12的比例称取并制备载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工材料^[10]，是因为在此比例下的剂量更切合临床用药实际。因为3种药物标准曲线建立的依据是原药，测出来的药物浓度是在标准曲线的基础上测出来的，故有效杀菌成分也是原药；因肝脏对药物有“首过消除”作用^[20]，故不经过肝脏的局部缓释系统更具杀菌效果。

采用HPLC法同时检测异烟肼、利福平、吡嗪酰胺3种药物浓度已有报道。Khuhawar等^[21]使用2-氟萘烯甲醛和异烟肼通过化学反应生成腙，利用氯仿进行萃取，然后用HPLC法对患者血液中的异烟肼、利福平、吡嗪酰胺浓度进行检测。李群力等^[22]用HPLC法测定复方利福平片中异烟肼、利福平、吡嗪酰胺的含量。HPLC法同时测定异烟肼、利福平、吡嗪酰胺3种药物浓度方法简便、快速，灵敏度和准确度较高。因异烟肼、利福平、吡嗪酰胺极性相差很大，其中异烟肼极性最强，较易被内源性杂质干扰^[23]。在实验中，流动相选择0.01 mol/mL的庚烷磺酸钠溶液-乙腈(体积比45∶55)，设定流速为3.0 mL/min，温度为30 ℃，检测波长设置为 220-400 nm，进样体积10 μL，时间范围15 min，根据色谱图可得吡嗪酰胺、异烟肼、利福平的出峰时间依次为2.7，3.4，8.9 min。作者发现乙腈可促使异烟肼与内源性物质的分离^[24]，通过调节pH实现修饰峰拖尾，沉淀蛋白质可通过应用甲醇实现，药物损失减少，而方法较为简单，同时具有回收率高、精密度高的优点，呈线性关系，对各药物的出峰干扰较小^[25-26]，是目前较为流行的药物浓度测量方法。

研究将载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸复合人工材料直接植入病灶中，避免了病灶壁致密硬化的屏障作用，药物直接作用于局部病灶。研究结果表明：异烟肼在病灶边缘骨组织、腰大肌中最低杀菌浓度可持续到植入后8周，在静脉血中可持续到植入后2周；利福平在病灶骨组织、腰大肌中最低杀菌浓度可持续4周，而在静脉血中未达最低杀菌浓度；吡嗪酰胺在病灶骨组织、腰大肌中最低杀菌浓度可持续8周，静脉血中未达到最低杀菌浓度。无论是病灶骨组织、腰大肌还是静脉血中，最低抑菌浓度持续时间均长于最低杀菌浓度4周以上；持续2-4周后即检测不到。

上述研究结果表明，首先，将载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料放入脊柱结核模型椎体病灶缺损之后，抗痨药物可缓慢、持续释放，时间最长可达3个月之久。局部释放的药物不仅进入局部病椎骨与其表面的腰大肌组织中，而且部分可经吸收进入全身血液循环之中。这种局部缓释作用是由于抗痨药物直接从人工材料表面扩散，以及人工材料降解后硫酸钙晶体间药物团暴露所产生的药物分散而形成的。第二，3种抗痨药能同时从缓释材料中释放出来进入局部病变部位联合抗痨，较以往研究的单药缓释材料能够更加高效、快速地杀灭结核杆菌，更加符合抗痨药物的使用原则。第三，病灶骨、腰大肌组织中，3种抗痨药在每个检测时间点的药物浓度均高于静脉血药物浓度。这可能与抗痨药直接扩散于邻近部位，使邻近的病灶骨、腰大肌含药量高有关；也与异烟肼、利福平和吡嗪酰胺3种药物在骨组织较血浆中药物代谢半衰期延长有关^[1]。全身血液循环中的抗痨药，是由扩散于局部后药物再经局部血循环吸收而来，局部药物吸收后再经全身血循环稀释，故检测的静脉血中药物浓度为低。这一研究结果与本团队以往关于口服抗结核药物后，药物在脊柱结核病灶部位浓度极低、在静脉血浓度高的结果完全相反^[1]。人工缓释材料植入病灶局部后形成的局部组织高药物浓度、全身低药物浓度的效果，不仅解决了口服或静脉给药形成的病灶局部低药物浓度的问题，而且有利于减小化疗药物引起的全身副反应。从脊柱结核病的组织病理学改变、治疗中药物分布的要求来看，这种给药方式更符合脊柱结核的治疗。

综上所述，认为载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸人工缓释材料可直接移植于脊柱结核病变区，能够有效提高局部抗痨药物浓度、显著提高杀菌效率，缩短治疗周期，显著提高疗效，使患者早日康复。但该材料仍存在抗压强度不足，药物释放过快等问题^[10-12]。随着对这些问题的有效解决，该人工缓释材料将会在临床有更广阔的应用前景^[27-45]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载三联抗痨药硫酸钙/聚氨基酸缓释材料在兔脊柱结核模型体内的缓释性能

The slow release performance of calcium sulfate/poly(amino acid) compound materials carrying triple anti-tuberculosis drugs in a rabbit model of spinal tuberculosis

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