硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1384-1389.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.014

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硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性

楚妙，巨朝娟，赵丽娜，崔增敏，宋耕

河北医科大学第一医院眼科，河北省石家庄市 050031

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 巨朝娟，硕士，主治医师，河北医科大学第一医院眼科，河北省石家庄市 050031
作者简介:楚妙，女，1981年生，河北省保定市人，2008年毕业于河北医科大学，硕士学历，主治医师，主要从事白内障，眼底病相关研究。
基金资助:
河北省医学科学研究课题计划项目(20130589)

Chondroitinase with adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation: a therapeutic strategy for retinal degeneration in rats

Chu Miao, Ju Chao-juan, Zhao Li-na, Cui Zeng-min, Song Geng

Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Ju Chao-juan, Master, Attending physician, Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
About author:Chu Miao, Master, Attending physician, Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Project of Hebei Province, No. 20130589

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
硫酸软骨素酶：是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺(又称N-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。硫酸软骨素存在于从线虫到人除植物外的所有生物中，发挥着许多重要的生理功能。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用。
脂肪间充质干细胞：是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视。目前，研究人员已成功地在体内、体外条件下，将其诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。

摘要
背景：有研究发现硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖能够促使视网膜上Müller细胞的移行，但硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖是否能促进脂肪间充质干细胞在视网膜变性大鼠视网膜的移行尚不明确。
目的：探讨硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖对脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性的影响。
方法：分离并培养人脂肪间充质干细胞，建立视网膜变性大鼠模型，向视网膜变性大鼠视网膜下腔注射脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶，观察移植后大鼠脂肪间充质干细胞迁移率和视网膜细胞凋亡情况。
结果与结论：人脂肪间充质干细胞能够成功培养，BrdU对人脂肪间充质干细胞的标记率达90.0%以上。建模后7 d，视网膜外核层塌陷，光感受器细胞大量外节迸解，外核层贴附在Bruch’s膜上，视网膜呈拱桥样，中央视网膜和外周视网膜均受到损伤；正常大鼠视网膜各层清晰，光感受器细胞排列规律，视网膜色素上皮层完整。脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组脂肪间充质干细胞迁移率高于脂肪间充质干细胞组，且2组视网膜细胞凋亡率比较差异无显著性意义。表明硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖可提高人脂肪间充质干细胞在视网膜上的迁移能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-0100-5367(巨朝娟)

关键词: 干细胞, 移植, 人脂肪间充质干细胞, 视网膜变性, 细胞移植, 硫酸软骨素酶, 硫酸软骨素蛋白多糖, 迁移, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that chondroitin sulfate proteoglycans degradation with chondroitinase can promote the migration of Müller cells on the retina, but whether it could promote the migration of adipose-derived mesenchymal stem cells in retinal degeneration rats is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of chondroitin sulfate proteoglycans degradation with chondroitinase on adipose-derived mesenchymal stem cell treatment for retinal degeneration in rats.
METHODS: Human adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured. A retinal degeneration rat model was established followed by administration of adipose-derived mesenchymal stem cells+chondroitinase into the subretinal space. The migration of adipose-derived mesenchymal stem cells and retinal cell apoptosis in rats after transplantation were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The human adipose-derived mesenchymal stem cells could be successfully cultured. The labeling rate of BrdU to the human adipose-derived mesenchymal stem cells was more than 90.0%. At 7 days after modeling, the outer nuclear layer of the retina was collapsed, and a large amount of photoreceptor cells were dissected. The outer nuclear layer was attached to the Bruch’s membrane, and the retina was arched. The central retina and peripheral retina were damaged. In normal rats, the retinal layers were clear, and the photoreceptor cells arranged regularly; and the retinal pigment epithelium was complete. The migration rate of adipose-derived mesenchymal stem cells in adipose-derived mesenchymal stem cells+chondroitinase group was higher than that in adipose-derived mesenchymal stem cells group (P < 0.05). There was no significant difference in the apoptotic rate of retinal cells between the two groups (P > 0.05). These experimental findings show that chondroitin sulfate proteoglycans degradation with chondroitinase can enhance the migration ability of human adipose-derived mesenchymal stem cells on the retina.

Key words: Retinal Degeneration, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

楚妙，巨朝娟，赵丽娜，崔增敏，宋耕. 硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1384-1389.

Chu Miao, Ju Chao-juan, Zhao Li-na, Cui Zeng-min, Song Geng. Chondroitinase with adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation: a therapeutic strategy for retinal degeneration in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1384-1389.

图/表（结果） 2

2.1 人脂肪间充质干细胞培养 脂肪间充质干细胞原代培养一两天时少量多角细胞或梭形细胞，3-5 d后梭形细胞增多，7-10 d时细胞形成集落，呈团簇状生长，12-14 d时细胞达80%以上融合(图1)。经传代培养，多角形细胞不断减少，传代至第3代时，多角形细胞基本消失，均为梭形细胞。

2.2 人脂肪间充质干细胞鉴定结果 第3代人脂肪间充质干细胞CD29、CD44、CD90、CD105的阳性表达率分别为99.31%、98.42%、99.53%和98.02%，C34、CD45的阳性表达率为0.19%和0.62%。表明培养细胞为脂肪间充质干细胞。

2.3 人脂肪间充质干细胞标记效果 荧光显微镜下可见，经BrdU标记的人脂肪间充质干细胞的细胞核呈红色荧光，标记率达90.0%以上(图2)。

2.4 实验动物数量分析 动物实验进入结果分析的实验动物数量为24只，中间无脱落。

2.5 大鼠视网膜变性模型成功建立 建模后7 d，视网膜外核层塌陷，光感受器细胞大量外节迸解，外核层贴附在Bruch’s膜上，视网膜呈拱桥样，中央视网膜和外周视网膜均受到损伤。正常大鼠视网膜各层清晰，光感受器细胞排列规律，视网膜色素上皮层完整(图3)。

2.6 脂肪间充质干细胞迁移率 脂肪间充质干细胞移植组移植后脂肪间充质干细胞主要分布在视网膜下腔，只有少量脂肪间充质干细胞迁移到视网膜外核层以内；脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组脂肪间充质干细胞大部分迁移到视网膜外核层内，脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组脂肪间充质干细胞迁移率高于脂肪间充质干细胞组(P < 0.05；图4，表1)。

2.7 视网膜细胞凋亡情况 各组视网膜细胞凋亡以外核层为主。脂肪间充质干细胞组和脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组视网膜细胞凋亡率均低于对照组(P < 0.05)，脂肪间充质干细胞组和脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组视网膜细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P > 0.05；图5，表2)。

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引言

视网膜变性疾病是眼科主要的致盲性疾病。视网膜变性的表现为色素上皮细胞和视网膜光感受器细胞功能丧失，从而导致视功能损害，其主要病理特征为色素上皮细胞和光感受器细胞的凋亡^[1]，目前视网膜变性性疾病没有有效的治疗方法。

随着干细胞研究的不断深入，干细胞移植治疗给视网膜变性疾病带了了新的希望。干细胞包括成体干细胞和胚胎干细胞，胚胎干细胞可分为内胚层、中胚层和外胚层各种组织和细胞分化，分化潜能比较大，但受伦理学限制；而成体干细胞不受伦理学限制，取材比较容易，可多向分化，在近年来成为干细胞研究的热点^[2-4]。在眼科疾病治疗的研究中，目前用于移植的干细胞有骨髓间充质干细胞、视网膜神经干细胞、脑源性神经干细胞等^[5]，移植的干细胞能够和宿主细胞整合，恢复或者替换病变细胞，干细胞分泌细胞生长因子，促进未分化细胞转化为种子细胞，从而达到治疗疾病的目的。既往研究比较多的干细胞为骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞可以向色素上皮细胞、光感受器细胞、无长突细胞核视网膜神经细胞等分化，对视网膜有保护功能^[6-7]，但骨髓间充质干细胞需要骨髓穿刺取得，骨髓穿刺对机体创伤比较大，且得到的干细胞数量有限，使其在临床应用中有一定限制，而脂肪间充质干细胞来源丰富，组织损伤小，获得的细胞数量比较多，和骨髓间充质干细胞有类似的多向分化潜能，是一种比较理想的种子细胞^[8-12]。但细胞替代治疗在应用中也面临困难，间充质干细胞移植到视网膜后只有少量细胞整合到视网膜，因此提高间充质干细胞在视网膜的迁移和整合率具有重要意义。

视网膜变性发生了神经胶质瘢痕形成，胶质瘢痕含有多种抑制蛋白，视网膜变性瘢痕上大量的硫酸软骨素蛋白多糖抑制轴突延伸和神经再生，有研究发现降解硫酸软骨素蛋白多糖可以增加迁移到视网膜的Müller细胞数量^[1^，^13]，那么降解硫酸软骨素蛋白多糖能否促进移植的间充质干细胞的迁移呢？作者拟对硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖对脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性的影响进行研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验在2015年1至12月在河北医科大学第一医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级健康SD大鼠30只，雄性，鼠龄4周，体质量80-100 g，购自上海市动物疫病预防控制中心，动物许可证号：SYXK(沪)2015-0013。大鼠实验前饲养1周适应环境，实验大鼠经过。河北医科大学第一医院动物伦理学委员会批准，批号为2015-09-7(XB)。

人体组织：脂肪组织来源于河北医科大学附属医院，为30岁男性志愿者，体质量80 kg，身高175 cm。

主要试剂及仪器： DMEM培养基、胰蛋白酶、碘酸钠、PBS购自美国Sigma公司；胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、EDTA、BrdU、硫酸软骨素酶、原位凋亡检测试剂购自美国GibcoBRL公司；FITC标记羊抗小鼠二抗、PE-CD29单克隆抗体、PE-CD34单克隆抗体、PE-CD44单克隆抗体、PE-CD45单克隆抗体、PE-CD90单克隆抗体、PE-CD105单克隆抗体、小鼠抗溴脱氧尿苷BrdU单克隆抗体购自美国BD Bilsciences公司；多聚甲醛粉购自上海生工生物技术有限公司；倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器厂；流式细胞仪购自美国默克公司。

1.4 方法

1.4.1 人脂肪间充质干细胞的分离和培养 取手术中丢弃的成人脂肪组织，D-Hank’s液冲洗后剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶消化1 h，温度为37 ℃，200目筛网过滤掉未被消化的脂肪组织，将滤除液离心10 min，转速1 500 r/min，弃去上清液，用D-Hank’s液洗涤，离心后制成单细胞悬液，将细胞悬液接种到培养液含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中(1×10⁹ L^-¹)培养，2 d后进行首次换液，以后每3 d换液1次，细胞达80%以上融合时0.25%胰酶消化，按照1∶3细胞比例进行传代培养。倒置显微镜观察细胞的生长情况。

1.4.2 人脂肪间充质干细胞的鉴定 取第3代生长良好的脂肪间充质干细胞进行鉴定，待脂肪间充质干细胞达80%以上融合时用PBS洗涤，0.25%胰蛋白酶消化，细胞胞质回缩，细胞间隙增大时停止消化，转移到离心管中离心5 min转速1 500 r/min，弃去上清液，PBS洗涤，制成细胞悬液(细胞浓度为1×10⁹ L^-¹)，取100 μL细胞悬液加入荧光标记抗体(PE-CD29单克隆抗体、PE-CD34单克隆抗体、PE-CD44单克隆抗体、PE-CD45单克隆抗体、PE-CD90单克隆抗体、PE-CD105单克隆抗体)孵育，以FITC标记的大鼠抗小鼠IgG细胞为阴性对照细胞，30 min后PBS液洗涤，流式细胞仪检测。

1.4.3 BrdU标记人脂肪间充质干细胞 将盖玻片消毒，放入培养皿中，滴加少量第3代人脂肪间充质干细胞悬液，培养箱中培养，待细胞达60%融合时加入BrdU(10 μmol/L)，混匀后继续培养48 h，并设立对照组，对照组不加入BrdU。48 h后进行细胞免疫化学鉴定，将细胞爬片取出，PBS洗涤，多聚甲醛固定，PBS洗涤，加入小鼠抗BrdU单克隆抗体过夜孵育，PBS洗涤，加入生物素化二抗孵育，PBS洗涤，并设阴性对照，阴性对照以PBS液代替一抗。选择8个低倍视野计算BrdU标记率，标记率=阳性细胞/细胞总数×100%。

1.4.4 视网膜变性大鼠模型建立 在30只大鼠中取20只大鼠建立视网膜变性大鼠模型，2只进行对照。将18只大鼠称体质量后，经尾静脉注射1%碘酸钠液(50 mg/kg)建立视网膜变性大鼠模型，建模后1周，随机取2只建模大鼠观察建模情况，将2只模型大鼠和2只对照大鼠处死，摘除眼球，苏木精-伊红染色观察大鼠视网膜变化情况^[1]。

1.4.5 视网膜变性大鼠分组 将16只模型组大鼠根据随机数字法随机分为脂肪间充质干细胞移植组、脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组，每组8只。另取8只未造模大鼠，为对照组。

1.4.6 人脂肪间充质干细胞移植 将BrdU标记的第3代人脂肪间充质干细胞经0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心10 min，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹。造模后1个月时，体积分数10%水合氯醛麻醉大鼠，生理盐水洗右眼，爱尔卡因麻醉后，手术显微镜下剪开颞侧眼睑，暴露注射区，剪开球结膜，暴露巩膜，分离结膜和筋膜，角膜针穿刺巩膜，角膜穿刺刀穿刺前房，硅胶细管从巩膜穿刺孔进针，向视网膜下腔注射5 μL细胞悬液：脂肪间充质干细胞组注射脂肪间充质干细胞；脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶组同时注射5 μL脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶(1×10⁴ U/L)；对照组注射等量PBS。注射后缝合眼睑。

1.4.7 标本采集 脂肪间充质干细胞移植后2周，麻醉处死大鼠，取出眼球，多聚甲醛固定，修剪眼球表面筋膜和结膜组织，穿刺球壁，放出房水，将多聚甲醛注入玻璃体腔内固定，将眼球在蔗糖溶液中过夜脱水，剪去角膜，去除晶状体核眼前节，剖开眼杯组织，OCT包埋组织，切成5 μm厚切片。

1.4.8 免疫荧光染色 将冰冻切片室温下晾干，加入50 μL HCl(2 mol/L)变性，PBS洗涤，正常羊血清封闭，加入一抗小鼠抗BrdU单克隆抗体，并设立阴性对照，阴性对照以PBS代替一抗，过夜孵育，PBS洗涤，加入FITC标记羊抗鼠IgG二抗孵育，PBS洗涤，加入DAPI 50 μL复染，PBS洗涤，加入抗荧光淬灭液封固，拍照观察，选择8个高倍视野计算阳性细胞数，并计算人脂肪间充质干细胞迁移率，人脂肪间充质干细胞迁移率=视网膜外核层以内的阳性细胞数/总阳性细胞数×100%。

1.4.9 TUNEL染色 将冰冻切片加入胃蛋白酶消化，PBS洗涤，加TUNEL反应液孵育，PBS洗涤，加碱性磷酸酶抗体孵育，PBS洗涤，加BCIP/NBT孵育，PBS洗涤，核快红复染，封片剂封固，镜下拍照观察，细胞核深棕色为凋亡细胞，选取8个视野计算外核层细胞凋亡率，外核层细胞凋亡率=外核层凋亡细胞数/外核层细胞总数×100%。

1.5 主要观察指标 ①人脂肪间充质干细胞培养结果；②脂肪间充质干细胞迁移率；③视网膜细胞凋亡。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行分析，两组均数比较采用t 检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

视网膜变性主要特点是视网膜色素上皮细胞发生病变，色素上皮细胞代谢功能丧失或者减退，引起光感受器细胞凋亡，造成视功能受到损失或者视功能丧失，视网膜变性疾病没有有效的治疗方法^[1]。因视网膜变性来自光感受器细胞及色素上皮细胞的病变，因此寻找合适的细胞对病变细胞进行替代治疗是视网膜变性治疗的新的思路。治疗视网膜变性的理想的细胞需要符合以下条件：能够在眼内存活，能够大量增殖，能够整合到视网膜，能够形成功能性结构，对宿主视网膜无不良影响，对视功能有保护作用。干细胞具有多向分化、不断更新、自我增殖功能，在多种疾病的治疗中被广泛研究^[14-20]。在眼科疾病研究比较多的是骨髓间充质干细胞^[21-27]，但骨髓间充质干细胞的取材有一定局限性。脂肪间充质干细胞是另一种干细胞来源，脂肪组织来源与中胚层，脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞相似的扩增能力和分化潜能，且脂肪间充质干细胞取材损伤小，获得细胞多，并发症少，在多种疾病的治疗中被广泛研究^[28-33]。实验对手术丢弃的脂肪组织进行脂肪间充质干细胞的分离和培养，并进行鉴定，结果表明人脂肪间充质干细胞能够被成功培养。

间充质干细胞移植对视网膜变性有一定的治疗作用已被一些研究证实，但移植的间充质干细胞的迁移率和整合率比较低，提高间充质干细胞移植后的迁移率对提高其对疾病的治疗作用具有重要意义。中枢神经系统受到损失后，小胶质细胞、星形胶质细胞等增殖、活化，形成胶质瘢痕，形成的胶质瘢痕对神经轴突的修复有一定的阻碍，胶质瘢痕中有多种抑制蛋白，其中硫酸软骨素蛋白多糖对神经轴突的延伸过程有阻止作用^[34-35]。硫酸软骨素酶是细菌胞外酶，能够特异性破坏硫酸软骨素蛋白多糖，减轻硫酸软骨素蛋白多糖对神经轴突的抑制。视网膜变性有神经胶质瘢痕形成，视网膜上的硫酸软骨素蛋白多糖抑制轴突延伸和神经再生^[36-37]。作者将视网膜变性大鼠视网膜下腔注射脂肪间充质干细胞+硫酸软骨素酶，观察硫酸软骨素酶降解视网膜中硫酸软骨素蛋白多糖是否影响脂肪间充质干细胞的迁移和凋亡。结果表明人脂肪间充质干细胞能够降低视网膜细胞凋亡，对视网膜具有保护作用，硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖后视网膜内人脂肪间充质干细胞的迁移率明显提高，视网膜细胞凋亡率有所降低，但和脂肪间充质干细胞单纯移植组差异无显著性意义，考虑可能与硫酸软骨素酶的应用剂量较小有关。

综上所述，视网膜变性大鼠视网膜下腔注射人脂肪间充质干细胞可以抑制光感受器细胞凋亡，对光感受器细胞有一定的保护作用，硫酸软骨素酶降解硫酸软骨素蛋白多糖后能够促进脂肪间充质干细胞在视网膜上的迁移，对人脂肪间充质干细胞治疗视网膜变性具有积极作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

硫酸软骨素酶联合脂肪间充质干细胞治疗大鼠视网膜变性

Chondroitinase with adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation: a therapeutic strategy for retinal degeneration in rats

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