硫酸钙骨水泥与聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥修复山羊椎体骨缺损的对照

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.002

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 829-835.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.002

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硫酸钙骨水泥与聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥修复山羊椎体骨缺损的对照

王贤帝，陈果，李柱海，蒋虎山，聂鸿飞，谢天航，黄宏杰，裴福兴，宋跃明，曾建成

四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041

收稿日期:2016-12-02 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 曾建成，副教授，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041
作者简介:王贤帝，男，1987年生，四川省成都市人，汉族，2014年四川大学华西临床医学中心毕业，硕士，医师，主要从事脊柱退变性疾病、肿瘤研究。
基金资助:
四川省科技厅科技支撑计划项目资助(2012SZ0128)

Calcium sulfate bone cement with or without injectable polyamino acid for goat vertebral defects: a comparative experiment

Wang Xian-di, Chen Guo, Li Zhu-hai, Jiang Hu-shan, Nie Hong-fei, Xie Tian-hang, Huang Hong-jie, Pei Fu-xing, Song Yue-ming, Zeng Jian-cheng

Department of Orthopaedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2016-12-02 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Zeng Jian-cheng, Associate professor, Department of Orthopaedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Wang Xian-di, Master, Physician, Department of Orthopaedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of the Science & Technology Department of Sichuan Province, No. 2012SZ0128

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态计量学参数：是基于Micro-CT测算得出，可客观反映骨缺损在填充不同材料修复后，新生骨小梁的生长变化特点，直观反映填充材料的吸收降解状况。可在不破坏标本外观的情况下，对其内部结构进行观察研究。Micro-CT还可对活体小动物骨骼进行扫描，测算骨形态计量学参数，在内分泌、代谢性疾病等研究领域亦有重要价值。
可吸收骨水泥：目前在临床上成熟应用的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥为有机高分子材料，在体内不可吸收，多用于老年骨质疏松压缩骨折的椎体强化、老年患者骨水泥型关节假体置换及骨肿瘤病灶的填充。由于其不可吸收，在体内长期存留可产生松动移位。同时，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥本身可对骨小梁新生产生阻挡。可吸收骨水泥自身可降解，诱导新骨形成，是骨缺损生物修复的理想方式，故可吸收骨水泥成为近年来的研究热点。

背景：新近合成的可注射聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥在前期实验中表现出了良好的安全性与生物相容性。目前尚无该材料运用于脊柱骨缺损修复方面的报道。
目的：评价聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥修复椎体骨缺损后的吸收降解及新骨生成特点。
方法：选取12只健康成年雌性山羊，经腰椎右侧椎弓根制造φ4 mm×15 mm椎体骨缺损后，随机将每只山羊的腰椎分为2组，分别用可注射硫酸钙骨水泥、可注射聚氨基酸/硫酸钙骨水泥填充修复。术后4，8，12，16周处死实验动物，进行Micro-CT扫描及定量分析及硬组织切片观察。
结果与结论：①两组各时间点均有新生骨小梁长入骨缺损区域。骨小梁沿骨缺损边缘向中心生长；②第4周末时，两组骨缺损内均未见填充材料，骨缺损清晰可见；③16周末时，硫酸钙组骨缺损尚剩余不规则腔隙，新生骨小梁较密，排列欠规则。聚氨基酸/硫酸钙组新生骨小梁几乎将骨缺损完全充填，骨小梁结构清晰，连接良好；④骨组织形态计量学定量数据显示：随时间推移，两组的骨小梁相对体积、骨小梁厚度、骨小梁数量均呈现上升趋势，骨小梁分离度呈现下降趋势；⑤硬组织切片结果显示：16周末时，两组均有大量骨小梁生成，部分连接，大部分新生骨小梁已具有正常骨小梁结构；⑥结果表明，可注射聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥能在体内完全降解，在修复椎体骨缺损时表现出较单纯硫酸钙骨水泥有更好的成骨活性。以质量分数10%的比例添加聚氨基酸，并未显著减低该复合骨水泥修复椎体骨缺损后的吸收降解速度。

ORCID: 0000-0002-1298-0435(曾建成)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚氨基酸/硫酸钙骨水泥, 硫酸钙, 山羊, 椎体, Micro-CT, 组织学

Abstract:

BACKGROUND: Our previous study has proved that the novel injectable polyamino acid/calcium sulfate (PAA/CS) bone cement possesses a good safety and biocompatibility. But its repair effect on spinal defects is never reported.
OBJECTIVE: To evaluate the degradability and osteogenesis of the PAA/CS bone cement in vertebral repair.
METHODS: Twelve healthy adult female goats were selected. The vertebral defects of φ4 mm×15 mm were prepared through the right lumbar pedicle, and the vertebrae of each goat were then randomly divided into two groups (groups A and B), followed by filled with the injectable CS or PAA/CS, respectively. The goats were sacrificed at 4, 8, 12 and 16 weeks after surgery, and micro-CT scan, quantitative analysis and histological observation were conducted.
RESULTS AND CONCLUSION: New trabeculae grew in the defect area from the edging to the center in the two groups. At the end of 4 weeks, no filling material was found in the two groups, and the defect region was clear. At the end of 6 weeks, there was still an irregular cavity in the bone defect of the group A and the newly-formed trabeculae were dense and arranged disorderly. In the group B, the defect region was almost filled with trabeculae that were clear and connected well. With time, the bone volume fraction, thickness and number of trabeculae were on a rise, while the trabecular separation was in decline in both two groups. Histological observation showed that there were a large number of new trabeculae in both two groups, a part of which were connected, but most of which had the similar structures to normal trabeculae at the 16th week. These results suggest that the PAA/CS bone cement can be degraded thoroughly in vivo and has better osteogenesis than the CS. Addition of 10% PAA does not significantly delay the degradation of PAA/CS bone cement.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Sulfate, Kyphoplasty, Goats, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王贤帝，陈果，李柱海，蒋虎山，聂鸿飞，谢天航，黄宏杰，裴福兴，宋跃明，曾建成. 硫酸钙骨水泥与聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥修复山羊椎体骨缺损的对照[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 829-835.

Wang Xian-di, Chen Guo, Li Zhu-hai, Jiang Hu-shan, Nie Hong-fei, Xie Tian-hang, Huang Hong-jie, Pei Fu-xing, Song Yue-ming, Zeng Jian-cheng. Calcium sulfate bone cement with or without injectable polyamino acid for goat vertebral defects: a comparative experiment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 829-835.

图/表（结果） 10

2.1 一般情况所有实验动物均进入结果分析。切口均Ⅰ/甲愈合，无感染、无神经脊髓损伤。取材时见外口骨蜡存在，骨蜡覆盖处有不同量新骨形成。

2.2 Mirco-CT横断面观察两组在4个不同时间点的Micro-CT二维扫描图像见图1，2。

4周末时，两组骨缺损内均未见填充材料。在骨缺损边缘均有少量骨小梁生成，PAA/CS组底部生成的骨小梁较硫酸钙组多。

8周末时，两组骨缺损有缩小趋势，硫酸钙组骨缺损底部有一定新骨生成。PAA/CS组除在底部有新骨生成外，在骨缺损的外口部也有少量的新骨生成，骨缺损已变得不规则。新生骨小梁密度稍高于周围正常骨小梁，排列结构欠清晰。

12周末时，硫酸钙组新生骨较多，骨缺损已变得不规则，底部和中部新生骨小梁已有少部分相互链接。PAA/CS组新生骨小梁明显，在骨缺损外口处和中间部相连，将其分隔。

16周末时，硫酸钙组骨缺损尚剩余不规则腔隙，新生骨小梁密度较高，排列欠规则。PAA/CS组新生骨小梁几乎将骨缺损完全充填，骨小梁结构清晰，连接良好。在Micro-CT二维横断面上显示骨缺损残留硫酸钙组多于PAA/CS组。

2.3 形态计量学分析

2.3.1 骨小梁相对体积不同时间点骨小梁相对体积的具体数据见表1。两组骨小梁相对体积随时间增加呈现逐渐上升趋势。两组骨小梁相对体积第8周末与第4周末对比无明显变化(P > 0.05)，之后均逐渐增加，在第16周末时达到最大值。第4，8，12周末时，两组间差异无显著性意义(P > 0.05)。第16周末时，PAA/CS组明显高于硫酸钙组(P < 0.01)。

2.3.2 骨小梁厚度不同时间点骨小梁厚度的具体数据见表2。两组骨小梁厚度随时间增加呈现逐渐上升趋势。第4周末时，硫酸钙组大于PAA/CS组(P < 0.05)。第8周末时，两组间差异无显著性意义(P > 0.05)。第12周末时，PAA/CS组高于硫酸钙组(P < 0.05)。在第16周末时，两组间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3.3 骨小梁数量不同时间点骨小梁数量的具体数据见表3。两组骨小梁数量随时间增加呈现逐渐上升趋势，上升幅度PAA/CS组大于硫酸钙组。第4周末、第8周末时，硫酸钙组均低于PAA/CS组(P < 0.05)。第12周末时，PAA/CS组高于硫酸钙组(P < 0.05)。16周末时，PAA/CS组显著高于硫酸钙组(P < 0.01)。

2.3.4 骨小梁分离度不同时间点骨小梁分离度的具体数据见表4。两组随时间的增长均呈现下降趋势，PAA/CS组术后初期降幅大于硫酸钙组，之后其降幅逐渐降低。第4周末时，PAA/CS组显著高于硫酸钙组(P < 0.01)。在第8周末，两组明显下降(P < 0.01)。第12周末时，硫酸钙组高于PAA/CS组(P < 0.05)。16周时，硫酸钙组低于PAA/CS组(P < 0.05)。

2.4 硬组织切片观察结果

术后4周(图3)：两组标本内可见到清晰的骨缺损，内填充成纤维细胞，有淋巴细胞灶状浸润。骨缺损内有较多胶原纤维生成，周边部可见到有少量新生骨小梁，有成骨细胞整齐排列于表面，可见较多炎性细胞浸润，炎性细胞在PAA/CS组标本中明显少于硫酸钙组。

术后8周(图4)：两组标本骨缺损中的新生骨小梁数目均有增多，可见排列整齐的成骨细胞围绕新生骨小梁排列。硫酸钙组新生骨小梁主要集中在骨缺损底部，PAA/CS组标本在底部及中间部均有新生骨小梁生成。PAA/CS组骨缺损中心部位仍可见淋巴细胞浸润。

术后12周(图5)：两组骨小梁数目继续增多、增粗、密度增高。周边部分编织骨已开始转化为板层骨，具有正常骨小梁的形态，靠近缺损中心的骨小梁周围仍然可见成骨细胞规则排列在骨缺损底部，骨小梁形成于中间部分。PAA/CS组中间部分骨小梁形成多于硫酸钙组。

术后16周(图6)：两组均有大量骨小梁生成，部分连接，大部分新生骨小梁已具有正常骨小梁结构。

参考文献

[1]Younger EM, Chapman MW Morbidity at bone graft donor sites. J Orthop Trauma. 1989;3(3):192-195.

[2]Pryor LS, Gage E, Langevin CJ, et al. Review of bone substitutes. Craniomaxillofac Trauma Reconstr. 2009;2(3): 151-160.

[3]Perry A, Mahar A, Massie J, et al. Biomechanical evaluation of kyphoplasty with calcium sulfate cement in a cadaveric osteoporotic vertebral compression fracture model. Spine J. 2005;5(5):489-493.

[4]Stubbs D, Deakin M, Chapman-Sheath P, et al. In vivo evaluation of resorbable bone graft substitutes in a rabbit tibial defect model. Biomaterials. 2004;25(20):5037-5044.

[5]Goodrich JT, Sandler AL, Tepper O. A review of reconstructive materials for use in craniofacial surgery bone fixation materials, bone substitutes, and distractors. Childs Nerv Syst. 2012;28(9):1577-1588.

[6]Magnan B, Bondi M, Maluta T, et al. Acrylic bone cement: current concept review. Musculoskelet Surg. 2013;97(2):93-100.

[7]Wu XT, Jiang XJ, Zhang SD, et al. Biomechanical evaluation of vertebroplasty using calcium sulfate cement for thoracolumbar burst fractures. Chin J Traumatol. 2007;10(6): 327-333.

[8]Taylor RS, Fritzell P, Taylor RJ. Balloon kyphoplasty in the management of vertebral compression fractures: an updated systematic review and meta-analysis. Eur Spine J. 2007;16(8): 1085-1100.

[9]Heini PF, Berlemann U. Bone substitutes in vertebroplasty. Eur Spine J. 2001;10 Suppl 2:S205-213.

[10]Xie P, Zhao Y, Li G. Efficacy of percutaneous vertebroplasty in patients with painful vertebral metastases: A retrospective study in 47 cases. Clin Neurol Neurosurg. 2015;138:157-161.

[11]Dressmann H. Ueber Knochenplombierung bei Hohlenformigen Defekten des Knochens. Beitr Klin Chir. 1892; 9: 804-810.

[12]Turner TM, Urban RM, Gitelis S, et al. Resorption evaluation of a large bolus of calcium sulfate in a canine medullary defect. Orthopedics. 2003;26(5 Suppl):s577-579.

[13]Zhang J, He F, Zhang W, et al. Mechanical force enhanced bony formation in defect implanted with calcium sulphate cement. Bone Res. 2015;3:14048.

[14]Zampelis V, Tägil M, Lidgren L, et al. The effect of a biphasic injectable bone substitute on the interface strength in a rabbit knee prosthesis model. J Orthop Surg Res. 2013;8:25.

[15]Liu W, Wu C, Liu W, et al. The effect of plaster (CaSO4 •1/2H2O) on the compressive strength, self-setting property, and in vitro bioactivity of silicate-based bone cement.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(2):279-286.

[16]崔文岗,石岩,肖德明.硫酸钙人工骨修复骨缺损的应用研究进展[J]. 生物骨科材料与临床研究, 2013, 10(5): 21-23.

[17]Ryu KS, Shim JH, Heo HY, et al. Therapeutic efficacy of injectable calcium phosphate cement in osteoporotic vertebral compression fractures: prospective nonrandomized controlled study at 6-month follow-up. World Neurosurg. 2010;73(4): 408-411.

[18]Cardoso DA, van den Beucken JJ, Both LL, et al. Gelation and biocompatibility of injectable alginate-calcium phosphate gels for bone regeneration. J Biomed Mater Res A. 2014; 102(3):808-817.

[19]Evaniew N, Tan V, Parasu N, et al. Use of a calcium sulfate-calcium phosphate synthetic bone graft composite in the surgical management of primary bone tumors. Orthopedics. 2013;36(2):e216-222.

[20]黄强,李程,周宗科,等.掺锶硫酸钙复合骨修复材料的制备及体外特性研究[J].生物医学工程学杂志,2009,26(3):575-579.

[21]张民,王建生,卫小春,等.注射性硫酸钙/羟基磷灰石骨替代材料的性能研究[J].中国康复,2006,21(1): 16-17.

[22]陈华,田学忠,张伯勋,等.硫酸钙骨内植入修复兔包容性骨缺损的力学分析[J].中国矫形外科杂志, 2008, 16(5): 373-375.

[23]赵增辉,蒋电明,权正学,等. 灭菌对聚氨基酸/硫酸钙复合材料理化性能的影响[J].第三军医大学学报, 2011, 33(2): 119-123.

[24]严永刚,李鸿,吕国玉,等.氨基酸共聚物-硫酸钙复合材料及制备方法:中国, CN101560326B [P].2011-01-19.

[25]周春光,宋跃明,屠重棋,等. 多元氨基酸共聚物/磷酸钙复合材料椎间融合器的设计制备及压缩强度测试[J]. 生物医学工程学杂志, 2011, 28(6): 1136-1140.

[26]Bell WH. Resorption Characteristics of Bone and Bone Substitutes. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1964;17: 650-657.

[27]姜星杰,吴小涛,张绍东,等. 硫酸钙骨水泥降解成骨性能的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2007, 9(8): 717-720.

[28]普有登,汤逊. 硫酸钙骨移植替代材料的研究及应用进展[J].中国矫形外科杂志,2011,19(11): 931-933.

[29]Carinci F, Piattelli A, Stabellini G, et al. Calcium sulfate: analysis of MG63 osteoblast-like cell response by means of a microarray technology. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2004;71(2):260-267.

[30]Sidqui M, Collin P, Vitte C, et al. Osteoblast adherence and resorption activity of isolated osteoclasts on calcium sulphate hemihydrate. Biomaterials. 1995;16(17):1327-1332.

[31]Ricci JL,Weiner MJ,Iorio DD,et al. Evaluation of Timed Release Calcium Sulfate (CS-TR) Bone Graft Substitutes. Microscopy & Microanalysis. 2005; 11(11):1256-1257.

[32]Palmieri A, Pezzetti F, Brunelli G, et al. Calcium sulfate acts on the miRNA of MG63E osteoblast-like cells. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2008;84(2):369-374.

[33]Walsh WR, Morberg P, Yu Y, et al. Response of a calcium sulfate bone graft substitute in a confined cancellous defect. Clin Orthop Relat Res. 2003;(406):228-236.

[34]Lazáry A, Speer G, Varga PP, et al. Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells. J Orthop Res. 2008;26(5):601-607.

[35]Dasmah A, Sennerby L, Rasmusson L, et al. Intramembraneous bone tissue responses to calcium sulfate: an experimental study in the rabbit maxilla. Clin Oral Implants Res. 2011;22(12):1404-1408.

[36]Rauschmann MA, Wichelhaus TA, Stirnal V, et al. Nanocrystalline hydroxyapatite and calcium sulphate as biodegradable composite carrier material for local delivery of antibiotics in bone infections. Biomaterials. 2005;26(15): 2677-2684.

[37]Mazurkiewicz T, Matuszewski L, Matuszewska A, et al. Implanted bisphosphonates in bone cement affect bone markers in rat serum. Int Orthop. 2013;37(5):969-974.

引言

骨缺损修复是骨科临床工作中面临的常见问题，自体骨移植一直以来被视为骨缺损修复的“金标准”，但自体骨移植存在着如供骨区疼痛、感染及外观受影响等缺点^[1]。同时，随着微创外科理念逐步被人们重视，骨科微创技术取得了跨越式的发展，越来越多的传统开放手术正被微创手术所替代。骨科微创手术经小切口，借助操作管道完成，限制了自体骨的使用。骨水泥作为骨科微创手术中的重要修复材料，由于其具有可注射的特点，使其可以顺利通过操作管道填充至拟修复骨缺损部位，近年来受到了高度关注。

传统的骨水泥多以聚甲基丙烯酸甲酯为主要材料，具有廉价、生物力学强度高、X射线下显影良好等优点^[2-6]。但聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥因其弹性模量与椎体骨质差异大，应用于椎体强化术后，可能增大邻椎再骨折的概率^[3，7-8]。同时，聚甲基丙烯酸甲酯在体内不可吸收降解，使之应用仅限于老年患者及预期生存期有限的骨肿瘤患者^[9-10]。硫酸钙应用于临床骨缺损修复已长达一个多世纪^[11]。硫酸钙可填充骨缺损区域并在体内被降解，为新骨生长提供支架，且具有良好的骨传导性和生物相容性^[12-14]。可注射硫酸钙骨水泥具有良好的即刻生物力学强度，Perry等^[3]的体外研究结果表明，在人新鲜冰冻尸体脊柱骨质疏松性椎体压缩骨折模型上应用硫酸钙骨水泥行椎体后凸成形术后，能完全恢复椎体的强度及部分刚度，与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥相比差异无显著性意义，较空白对照组明显提高。虽然硫酸钙骨水泥具有上述诸多优点，但其具有体内降解过快的缺点，导致其与新骨形成速度不相匹配，无法在新骨形成前提供足够的生物力学支撑，限制了硫酸钙在负重骨骼上的应用^[15-16]。Ryu等^[17]将硫酸钙骨水泥用于骨质疏松性椎体压缩骨折的椎体，行经皮椎体后凸成形术治疗。影像学检查显示，用硫酸钙骨水泥强化椎体后，患者的椎体高度、后凸角、疼痛及功能障碍较术前明显恢复。但在随访中发现，患者手术节段椎体出现进行性高度丢失，后凸角度增加。因而得出结论：不适于将单纯硫酸钙骨水泥用于经皮椎体后凸成形术患者。

强化节段高度丢失是因为硫酸钙骨水泥强化椎体后，在新骨形成尚不充分时，硫酸钙骨水泥便过快吸收，伴随生物力学强度下降，最终导致强化后的椎体在压应力作用下产生高度丢失^[18-19]。既往研究在如何使硫酸钙吸收与新骨形成速度相匹配方面作出了一些探索，包括向硫酸钙中添加锶盐^[20]、将硫酸钙与羟基磷灰石混合^[21]、改变硫酸钙结晶形态等^[22]，均取得了一定成果。如果能在减慢硫酸钙降解速度同时加快新骨形成，使材料的吸收和新骨形成速度一致，就可以为新骨形成提供充分的生物力学支撑，使硫酸钙可更好用于负重骨骼的修复重建。

在国家科技部的支持下，四川大学华西医院骨科和四川国纳科技有限公司联合研制、开发了一种新型可注射聚氨基酸/硫酸钙(polyamino acids/calcium sulfate，PAA/CS)复合骨水泥。该材料在传统的半水硫酸钙中添加聚氨基酸，旨在减慢复合材料的吸收降解速度，同时碱性氨基酸降解后可中和硫酸钙降解产生的酸性环境，更有利于成骨。聚氨基酸是一种可降解的氨基酸聚合物，由L-氨基己酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸和L-脯氨酸等天然碱性或中性氨基酸聚合而成^[23-24]。氨基己酸分子具有较强的刚性和极性，可构成聚合物的骨架，使之有一定的生物力学强度，而其他天然氨基酸则可对聚合物的降解性能进行调控。体外模拟体液浸泡12周实验显示，不同聚氨基酸添加比例可将聚合物的降解率调节控制在10%-100%范围^[23-24]。前期的研究显示，PAA/CS具有较好的生物安全性、组织相容性^[25]，无论是将其埋植在家兔肌肉中，还是用于家兔股骨髁骨缺损的修复，其吸收时间都大于单纯硫酸钙。目前，尚无PAA/CS用于脊柱骨缺损修复的相关报道。作者在前期体外实验、生物相容性实验及长骨骨缺损修复实验的基础上，将PAA/CS复合材料用于椎体骨缺损的修复，并与单纯硫酸钙骨水泥修复进行对比，评价该材料在负重骨骼修复后的吸收及成骨情况，为该复合材料进一步改进和临床应用提供参考，探索其应于用脊柱外科的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物体内实验。

1.2 时间及地点动物实验及组织学切片于2014年在四川大学华西医院临床实验中心完成。Micro-CT扫描于2014年在解放军第四军医大学口腔医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雌性成年山羊12只，体质量30-35 kg，由四川大学华西医院动物实验中心提供。

1.3.2 实验修复材料粉末状PAA/CS复合骨水泥(其中半水硫酸钙的质量分数为90%)，粉末状硫酸钙骨水泥，均由四川国纳科技有限公司生产。

1.3.3 主要试剂及仪器光显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；相关试剂(美国Sigma公司)；Micro-CT机(德国Siemens公司)；硬组织切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 可注射性PAA/CS复合骨水泥的制备可注射PAA/CS骨水泥为粉末状，其中半水硫酸钙的质量分数为90%，聚氨基酸占10%，包括：氨基己酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸和L-脯氨酸。可注射硫酸钙骨水泥为粉末状纯净半水硫酸钙。2种材料均采用10%环氧乙烷灭菌，双层无菌包装，规格为5 g/包。骨水泥调和的液相为生理盐水，固液质量比为1∶1。

1.4.2 动物分组按照随机抽签的方法决定12只山羊进行手术的先后顺序。每只山羊有6节腰椎，术前按照从头端到尾端顺序将腰椎编为1-6号，随机抽取4节均匀分成2组：分别填充可注射硫酸钙骨水泥和可注射PAA/CS骨水泥。每批次手术要求在2 d内完成3只山羊的骨缺损造模及处理。共进行4批次手术，完成12只山羊共48个椎体骨缺损的造模及处理。

1.4.3 动物模型的制备及分组处理术前肌注速眠新注射液0.1 mL/kg诱导麻醉，安置心电监护并插入气管插管。术中根据动物反应静脉用10%水合氯醛维持麻醉深度。取左侧卧位，体表定位后，逐层暴露L_1-6右侧横突基底部、上下关节突。以上、下关节突外侧缘连线和横突中心线的交点处，先用穿刺针钻透骨皮质，再用φ3 mm钻头电钻按一定内倾角度钻入椎体内直至15 mm深。内倾角度的确定：根据预实验时对CT扫描横断面的测量，以钻头长轴与棘突的夹角确定钻入椎体的角度。在L_1，2约30°，L_3，4约45°，L_5，6约60°。反向旋转取出钻头后，探针探查孔道周壁及底部完整性。再换用φ4 mm钻头，按前次孔道方向缓慢钻入，将骨缺损孔道扩大至φ4 mm×15 mm。再次探查孔道，确保其周壁完整。生理盐水冲洗孔道，将骨碎屑及血凝块洗出，用盐水棉片暂时填充孔道。根据随机结果，给予骨缺损模型PAA/CS骨水泥修复、硫酸钙骨水泥修复。用骨蜡封闭缺损外口，逐层关闭切口。

1.4.4 标本的获取及处理分别于术后4，8，12，16周将山羊处死，每个时间点处死3只并完成腰椎取材，用40 g/L多聚甲醛固定备用。在实验完成后，对标本进行修整，使之大小适合于进一步实验研究。具体方法如下：首先，去掉标本左侧横突、棘突、左侧椎体1/4-1/3，右侧横突大部分(适当保留基底部可作为日后切片的定位标志)；再用砂轮精细打磨，最终将标本修整为2.5 cm×2 cm×2 cm大小，骨缺损模型被完整包括在其中。将修整好的标本在流水中清洗过夜，再依次用体积分数为75%，85%，90%，95%，100%乙醇对标本行脱水处理。脱水后的标本放于ETC组织透明剂中进行透明处理，总时间约4 h。最后将处理好的标本包埋于有机玻璃中，待完全硬化后备用。

1.4.5 Micro-CT扫描及骨形态计量学参数测算扫描参数如下：扫描电压80 kV，扫描电流500 μA，分辨率10 μm。数据的获取及后期重建、数据定量分析在Inveon Acquisition Workplace工作站进行。将扫描图像三维重建后，以右侧横突基底部为参考，沿原术中造模区域勾画出大小为φ4 mm×15 mm的圆柱形ROI区域，运用系统自带的定量分析软件可算出所选定ROI进行骨组织形态计量学分析。测算的参数包括：骨小梁相对体积，骨小梁数量，骨小梁厚度，骨小梁分离度。

1.4.6 硬组织切片组织学观察 Micro-CT扫描完成后，将包埋好的标本进行硬组织切片，厚度约10 μm。对切片进行苏木精-伊红染色及MASSION染色，光镜下观察新生骨小梁形成情况、材料降解及周围反应情况。

1.5 主要观察指标 ①Micro-CT形态学观察及骨形态计量学参数，包括：骨小梁相对体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度；②硬组织切片的形态学观察结果，包括骨小梁形成情况、局部炎症细胞浸润情况。

1.6 统计学分析对于连续性数值变量采用x(_)±s的形式表示，组间比较采用配对设计的t 检验，组内比较采用方差分析。P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

为了研究硫酸钙的降解速度，Bell^[26]将直径7 mm，高3 mm圆柱形硫酸钙材料植入狗的腓肠肌内外侧头间，用放射学方法评估材料的降解特点。结果发现，硫酸钙降解速度比自体骨快2倍多，比异体骨和异种骨快得更多。硫酸钙在体内完全降解时间为33 d，自体骨7周，异体骨10周，异种骨11.5周，冻干骨和去有机质骨吸收时间则更长。家兔髂骨缺损模型研究显示，硫酸钙植入6周被部分吸收，10周时完全吸收，有新骨生成^[27]。目前对于硫酸钙的体内吸收及成骨机制尚未得出明确结论。根据对植入材料吸收规律的研究，材料在体内的吸收可分2种^[28]，即体液介导溶解和细胞介导的吞噬吸收。体液介导的溶解是指植入材料在体液的作用下，溶解成小颗粒、分子或离子等。细胞介导的吞噬降解中，主要是巨噬细胞和破骨细胞在炎症趋化作用下，聚集在材料周围将材料降解。硫酸钙的溶解，可在材料周围形成一个成骨细胞“友好”的环境^[29]。硫酸钙在体外研究时可使成骨细胞附着于其上，进而破骨细胞发挥作用将硫酸钙分解^[30]。在体内降解速度快，其吸收降解从边缘开始逐渐向中心进行。Ricci等^[31]根据其对动物体内硫酸钙降解的观察，认为硫酸钙从边缘到中心的降解速度约为1 mm/周。硫酸钙的降解速度大于新骨形成的速度，故新生骨与硫酸钙是不直接接触的，二者之间存在着一个同心圆的沉积区域。经组织学研究，该区域为以碳酸磷灰石形式沉积的硫酸钙。此种形式的硫酸钙沉积物在体液环境中稳定，是一种有骨诱导活性的基质。在实验中可以看到，硫酸钙组和PAA/CS组第4周末时，填充的材料均已被吸收降解。最理想的填充材料吸收模式，是材料的吸收与新骨的形成速度相匹配，始终保持新生骨小梁与材料接触。在两者的交界面上，破骨细胞不断将材料分解，成骨细胞再不断形成新骨，也就是说材料始终作为新骨形成时爬行替代的支架，表明硫酸钙质量分数为90%的PAA/CS并未能将复合材料的吸收时间延长至4周以上关于硫酸钙成骨特点的体外研究表明，硫酸钙具有诱导成骨的特性，能诱导间充质干细胞向成骨细胞分化^[28]，同时机械应力也有促进成骨的作用。对细胞增殖分化的调节可以从信号转导、转录、翻译3个层面进行。Palmieri 等^[32]对硫酸钙诱导成骨的分子机制进行了研究。他们在成骨细胞样细胞系MG-63的培养中，引入了硫酸钙溶液，并采用miRNA微阵列芯片技术进行研究。结果发现硫酸钙可使细胞内多个miRNA分子的表达发生明显改变，说明硫酸钙可在翻译层面对成骨细胞的增殖分化进行调控。Walsh等^[33]运用硫酸钙和自体骨修复羊股骨远端骨缺损后，免疫组化观察发现硫酸钙组局部血小板衍生生长因子、骨形态发生蛋白表达明显增高，其成骨细胞的活性高于对照组，据此认为硫酸钙的诱导成骨能力是因为其吸收过程中刺激局部释放成骨活性分子。Lazary等^[34]将硫酸钙引入小鼠成骨细胞前体培养液中，结果发现其中碱性磷酸酶合成增多，并出现与骨形成有关的物质，如Ⅱ型胶原及纤维结合素1，他们认为这种改变与硫酸钙降解过程中释放出的Ca²⁺有关。硫酸钙降解使局部产生大量Ca²⁺，Ca²⁺还可与成骨细胞钙敏感受体结合，促进成骨细胞增殖、分化及骨形成相关分子的表达^[32]。Dasmah等^[35]利用硫酸钙修复家兔牙颌缺损，研究硫酸钙骨膜内成骨特性。结果显示硫酸钙可促进局部血管生长，从而增强局部营养能力，有利于骨形成。硫酸钙降解时所产生的大量SO₄^2-，可使局部呈酸性，从而在局部产生炎症反应，不利于新骨形成^[36]。Dasmah等^[35]动物实验表明，硫酸钙导致的炎性组织在骨中消失的时间为60 d，而其在软组织中可持续存在。实验中的复合材料在降解时所产生的碱性氨基酸，可有效中和硫酸钙降解时的酸性环境，减少其对成骨的影响，同时保留了硫酸钙对成骨的积极作用，故PAA/CS组成骨情况要好于硫酸钙组。总的来说，理想的骨缺损修材料的特点是其吸收和新骨生成速度相匹配。硫酸钙的吸收是个多因素综合作用的结果，已知破骨细胞在其中发挥重要作用。是否可在硫酸钙中加载抑制破骨细胞活性的物质(如双膦酸盐^[37])，从而达到降低硫酸钙降解速度的目的，作为一个新的设想，其对材料生物力学特性及成骨性能的影响值得进一步深入探讨。

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人工骨替代材料又称人工骨，指用于修复替代骨骼或骨组织的材料，包括人工合成材料和天然材料。目前主要应用于以下几个方面：①填充因创伤、肿瘤、关节置换术等所造成的骨缺损；②作为骨移植的扩充材料；③用于骨不连的治疗；④作为抗生素的载体预防或治疗深部骨感染。理想的人工骨应具有以下几个特点：①材料应具有良好的生物相容性，不导致宿主发生严重的炎症反应；②材料的形态和体积应能在体内保持一段时间；③有适当的X射线不透过性，以便于术后对材料的评估；④有一定的生物活性，灭菌较容易，生产和使用成本适宜。人工骨的种类繁多，根据其主要成分不同将其划分为：无机材料人工骨、高分子材料人工骨、复合人工骨、纳米人工骨等；根据形态和填充方式不同可将其分为：固态人工骨和可注射人工骨。可注射人工骨，一般为粉末状，使用时与溶剂相调配后成为半固体，可通过管道进行注射，再经过一定时间后发生硬化。由于可注射人工骨的物理性质及调配使用过程类似于建筑用的水泥，故通常被称为骨水泥。
随着医疗技术和社会经济的发展，更多手术趋向微创化。微创外科已成为近年来快速发展的新理念，如何减少手术创伤正成为医疗界关注的焦点。骨水泥是骨科微创手术中重要的材料，正日益受到重视。但是，目前国内、外骨水泥的研发、加工水平仍然存在较大差距，许多骨水泥仍然依赖进口。因此，开发出一种具有自主知识产权且性能优良的骨水泥将会产生巨大的社会经济效益，对医疗科技的发展有积极意义。

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硫酸钙骨水泥与聚氨基酸/硫酸钙复合骨水泥修复山羊椎体骨缺损的对照

Calcium sulfate bone cement with or without injectable polyamino acid for goat vertebral defects: a comparative experiment

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[1]	姜欢畅, 张兆飞, 梁德, 江晓兵, 杨晓东, 刘志祥. 单侧多方向弯曲与直行椎体成形治疗胸腰椎骨质疏松性压缩骨折优势的比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1407-1411.
[2]	遇呈祥, 刘乐洪, 李文博, 陈金石, 冉春雷, 王忠平. 脊柱和骨盆矢状位参数与椎体成形治疗胸腰椎骨质疏松性椎体压缩骨折预后的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1412-1417.
[3]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[4]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[5]	王智强, 林路, 陈萧霖, 柯珍勇. 经皮椎体强化治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折：导航定位、骨折复位系统、骨水泥渗漏及材料的改良[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 631-636.
[6]	欧梁, 孔德忠, 徐道情, 倪景, 付兴前, 黄维琛. 比较聚甲基丙烯酸甲酯与自固化磷酸钙骨水泥在椎体成形中应用效果的 Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 649-656.
[7]	沈松, 徐彬. 经皮椎体成形骨水泥呈弥散型分布可减少邻近椎体再骨折的发生率[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 499-503.
[8]	侯万星, 李洪伟, 郑欣, 朱先任. 经皮椎体强化后骨水泥椎间盘渗漏与治疗前MRI发现的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 504-509.
[9]	钟远鸣, 何炳坤, 吴卓檀, 吴思贤, 万通, 钟锡锋. Jack椎体扩张器后凸成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折：有效及安全的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 487-492.
[10]	陈金民, 陈穗生, 丁晶, 夏暴权, 罗晓嘉, 卢成海. 球囊扩张可注射硫酸钙骨水泥填充治疗胫骨平台塌陷骨折的稳定性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 414-418.
[11]	王佳佳, 刘杰, 王敏. 构建具核梭杆菌诱导的实验性根尖周炎小鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 176-181.
[12]	俞阳, 唐六一, 胡豇, 万仑, 张伟, 林书, 王飞. 机器人辅助椎体成形骨水泥注射治疗胸腰椎多椎体病理性骨折[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2587-2592.
[13]	李胜凯, 李涛, 魏超, 时明. 磷酸钙/聚甲基丙烯酸甲酯复合骨水泥与聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥生物力学性能的对照[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2581-2586.
[14]	李婧瑜, 苏盈盈, 白丁. 骨关节炎早期模型小鼠软骨下骨的形态学特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1692-1698.
[15]	李文乐, 王浩胜, 宁丽俊, 张文石, 高森, 孙丽君, 胡朝晖. 骨质疏松患者经皮椎体成形后骨水泥渗漏风险分析及预测模型验证[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1477-1482.