生物骨组织立体培养分化和动物体内修复实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.003

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (6): 836-842.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.003

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生物骨组织立体培养分化和动物体内修复实验

王妍¹，王汉中²，张英¹，张丽君¹，田建明²，陈献雄³

¹深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东省深圳市 518055；²吉林大学第二临床医学院，吉林省长春市 130041；³深圳大学医学院，广东省深圳市 518060

收稿日期:2016-12-20 出版日期:2017-02-28 发布日期:2017-03-16
通讯作者: 张丽君，副教授，深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东省深圳市 518055 陈献雄，高级实验师，深圳大学医学院，广东省深圳市 518060
作者简介:王妍，女，1962年生，辽宁省大连市人，汉族，博士，研究员，主要从事生物技术和细胞培养研究。
基金资助:
广东省教育部项目(2012B091100408)；深圳市科技创新委项目(ZYA201106100083A；GGJS20130331152344401)；校级重点项目(601522k27009)

Three-dimensional culture and differentiation of biological bone tissue and its in vivo repair effect in an animal model

Wang Yan¹, Wang Han-zhong², Zhang Ying¹, Zhang Li-jun¹, Tian Jian-ming², Chen Xian-xiong³

¹School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China; ²the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China; ³Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China

Received:2016-12-20 Online:2017-02-28 Published:2017-03-16
Contact: Zhang Li-jun, Associate professor, School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China Chen Xian-xiong, Senior Engineer, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen 518060, Guangdong Province, China
About author:Wang Yan, M.D., Researcher, School of Applied Chemistry and Biological Technology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China
Supported by:
the Project of Educational Department of Guangdong Province, No. 2012B091100408; the Scientific and Technologic Innovation Project of Shenzhen, No. ZYA201106100083A, GGJS20130331152344401; the Key Project of Shenzhen Polytechnic, No. 601522k27009

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
动态三维诱导培养：三维细胞培养过程，根据细胞在自然条件下生长受力情况，利用物理的方法如生物反应器中流体剪切力，能够对细胞产生机械应力刺激，同时促进支架材料内部营养物质代谢交换。为细胞生长提供了适宜的生物性微环境和力学刺激。
生物反应器：是指任何提供生物活性环境的制造或工程设备。在一种情况下，生物反应器是一个进行涉及到生物或生物化学活性物质由特定的生物生产出来的化学过程的容器。此过程既可以有氧进行也可以无氧进行。这些生物反应器通常呈圆筒状，其体积从几升到几立方米不等，常由不锈钢制成。

背景：体外培养组织工程骨仍是治疗骨缺损修复的重要途径，3D打印骨架材料结合生物反应器骨组织是骨组织工程的重要研究内容。
目的：观察3D打印制备的生物骨支架接种细胞后经生物反应器立体培养体内修复骨伤的效果。
方法：①配制生物骨材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羟基磷灰石(PLGA/HA)，3D打印和冷冻干燥技术制备骨架，接种人骨髓间充质干细胞、经生物反应器培养分化；②实验动物分为3组，分别为对照组(1号，2号)，实验组(3号，4号)，实验+空孔组(5号，6号，均行右股骨钻孔不植入任何材料)；每组又分为2个亚组并编号。兔左侧股骨远端制作骨缺损模型，对照组分别植入空白材料-PLGA/HA(无细胞)和阴性材料PLGA/HA(接种人骨髓间充质干细胞)无诱导分化的支架块；实验组材料-PLGA/HA为接种人骨髓间充质干细胞经诱导分化的支架块，批号分别为201405-1和201405-2；③电子显微镜确定生物骨材料的成骨和降解性能。CT扫描生物骨体内修改效果，待受试组的骨破损基本修复后，做组织病理学检查。
结果与结论：制备出适于细胞种植的具有拓扑结构的生物骨支架；电子显微镜观察成骨干细胞附着的生物骨材料立体化培养后形成的新骨节点明显；在支架植入家兔体内后，有明显促进成骨愈合的作用。结果显示制备的生物骨组织材料达到了初步的修复骨组织的作用。

ORCID: 0000-0001-6698-5584(张丽君)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石, 3D打印, 间充质干细胞, 生物反应器, 硬骨

Abstract:

BACKGROUND: In vitro culture of tissue-engineered bone is an important method for bone repair. Three-dimensional (3D) printed bone stents combined with bioreactor culture are of significance in bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To study the in vivo repair effect of the 3D printed biomaterial scaffold with human mesenchymal stem cells (hMSCs) cultured in bioreactor.
METHODS: The scaffold was constructed by poly(lactic-co-glycollic acid)/hydroxyapatite (PLGA/HA) via 3D printing and freeze-dying techniques, and then hMSCs were seeded onto the scaffold and cultured in bioreactors. All rabbits were numbered and divided into control (No.1 and 2), experimental 1 (No. 3 and 4) and experimental 2 (No. 5 and 6) groups, and each group had two subgroups positive and negative. The rabbit left distal femur in each group was modeled into bone defect and the single PLGA/HA scaffold, PLGA/HA scaffold carrying non-induced hMSCs were implanted in the positive and negative groups of the control group, respectively; the PLGA/HA-201 405-1 and PLGA/HA-201 405-2 carrying induced hMSCs were implanted into the positive and negative subgroups of the experimental 1 and 2 groups, respectively. Additionally, the right femur in the experimental 2 group was drilled only. The osteogenesis ability and biodegradability were determined using electron microscope, the in vivo repair was observed through CT examination, and the histopathological examination was performed after bone healing.
RESULTS AND CONCLUSION: The scaffold with topological structure suitable for cell seeding was prepared. A large number of new calcium nodules were observed under electron microscope in the experimental groups indicating overt achievement in bone healing. These results suggest that the prepared scaffold achieves a good repair effect preliminarily.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Cell Differentiation, Bioreactors, Bone and Bones, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王妍，王汉中，张英，张丽君，田建明，陈献雄. 生物骨组织立体培养分化和动物体内修复实验[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 836-842.

Wang Yan1, Wang Han-zhong2, Zhang Ying1, Zhang Li-jun1, Tian Jian-ming2, Chen Xian-xiong3 . Three-dimensional culture and differentiation of biological bone tissue and its in vivo repair effect in an animal model [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 836-842.

图/表（结果） 5

2.1 生物骨材料的3D打印后观察经过后期的真空冷冻干燥，得到如图2所示的3D支架材料，其大小为4 cm× 4 cm×2 cm支架。俯视图可见材料垂直交叉式结构，结构中间交叉围成1 mm的间隙，间隙分布均匀，呈多孔状。侧面立体图可见平行排列的管状结构，直径较一致且相互连接。

2.2 生物骨材料立体培养及诱导分化图3电镜下观察未接种细胞的空白材料多孔结构非常明显，孔与孔之间结构致密，见图3A。接种后7 d可见细胞已长入支架孔中，细胞间有大量微丝相连(图3B)。在细胞罐的动态分化培养下，罐中人骨髓间充质干细胞在聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙支架上成骨分化第21天，可以清楚地看到，3D细胞罐组中细胞已经覆盖整个支架，出现了大量的黑色钙结节(图3D)，而3D静态培养组中细胞仅覆盖了60%左右的支架表面，钙结节数量也较少(图3C)。更大的细胞覆盖面积，更多的钙结节数量，这都充分说明了由于细胞罐的灌流培养，支架上的细胞能得到充足的养分和氧气，因此细胞增殖能力较静态培养的细胞更强，成骨分化的水平也更高。有关本研究中制备的支架材料与人骨髓间充质干细胞的相容性以及细胞罐立体培养及分化在支架材料上人骨髓间充质干细胞的研究已发表^[1⁵^-1⁶^]。

2.3 成骨组织的骨修复试验结果

2.3.1 术后19 d CT检测结果动物分组植入相应材料后，第1次CT检测在术后19 d，检测结果见图4。图4A，B植入空白材料的修复效果图，骨缺如孔明显，边缘光整，未见骨痂形成。植入阴性材料的修复结果见图4C，D，骨缺如孔明显，边缘光整，未见骨痂形成，切面缺孔处可见填充材料。图4E，F为植入支架材料PLGA/HA-201405-1组的修复效果，骨缺如处可见骨痂形成，密度不同周边，骨缺如孔边缘不光整，见不规则略高密度影。植入PLGA/HA-201405-2组的修复效果见图4G，H，同样可见骨缺如孔边缘形成骨痂，密度不同周边，见不规则略高密度影。5号实验组动物右侧空孔处的CT结果见图4I，J，骨缺如孔明显，直径约0.3 cm，边缘光整，未见骨痂形成。

2.3.2 支架材料植入后40 d兔CT检测结果体内修复效果第2次CT检测在支架材料植入后40 d检测，检测结果见图5。图5A，B植入空白材料的修复效果图，骨髓腔通畅，股骨外侧见约0.2 cm圆形骨质缺如，边缘模糊。植入阴性材料的修复结果见图5C，D，骨髓腔通畅，股骨外侧见约 0.19 cm圆形骨质缺如，边缘模糊。图5E，F为植入支架材料PLGA/ HA-201405-1组的修复效果，骨缺如孔不明显，边缘模糊，缺如部位基本愈合。植入PLGA/HA-201405-2组的修复效果见图5G，H，骨缺如边缘模糊，密度不同周边，形成骨痂，可见约0.15 cm类圆形骨质缺如，较前次缺如深度明显变浅。5号试验组动物右侧空孔处的CT结果见图5I，J，于右侧股骨干外侧见0.21-0.23 cm圆形骨质缺如，边缘光整，未见骨痂形成。

2.4 成骨修复实验病理组织学检查结果病理组织学检查结果见图6，空白材料和阴性材料组检测结果为图中6A和6B，采用游标卡尺测量骨缺损直径为3.2 mm与3.3 mm，组织镜下观察表明股缺损处内可见填充材料，缺损处上方覆盖薄层纤维骨痂。在填充材料内部有少量结缔组织成分生长。在骨两断端缘内骨组织内毛细血管成分较多，未见明显骨痂生长。受试材料组检测结果为图6C和D，结果表明聚乳酸附着成骨干细胞再加分化剂，骨缺损处被薄层骨性骨痂覆盖，缺损空不明显，组织镜下观察。在填充材料内可见成骨细胞及结缔组织和肉芽组织(毛细血管与炎性细胞成分)星芒状分布，该种成分之间呈网状连接，填充材料缩小，填充材料的内部纹理清晰度较低，填充材料与骨断端缘出可见纤维骨痂和骨性骨痂成分生成，断缘骨组织内毛细血管较少见。空孔组(仅制造骨缺损模型)组(图中6E和6F)，不植入任何材料，采用游标卡尺测量骨缺损直径为3.4 mm与3.5 mm，缺损处上方覆盖薄层纤维组织。骨折手术造成的损伤仍有形态残留，主要表现为损伤性出血形成的组织血肿尚未完全吸收。骨组织断缘清楚，其缺损中心内未见骨折修复性形态改变。

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引言

应用骨组织作为骨修复材料的替代物是全球人工骨的研究发展方向，一方面可避免生物源性修复材料的缺陷，另一方面将制备出的生物相容性好、具有骨传导能力并在体内可生物降解的三维支架与具有强大诱导骨活性的生长因子结合，可以使骨缺损修复材料拥有骨传导和诱导的双重特性，在迅速成骨的同时植入材料逐渐降解，使受到损伤的骨组织或使之功能得到长期恢复。聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羟基磷灰石(polylactic glycolic acid/ hydroxyapatite，PLGA/HA)作为复合材料适应快速成型制造，具有优良的力学性能和化学稳定性，其在生物体内的降解产物乳酸可参与到新陈代谢中，最终生成二氧化碳和水排出体外。其多孔的结构可提供很大的表面积/体积比，适合应用于骨组织工程^[1-2]。

人骨髓间充质干细胞由于获取途径较为方便并扩增表型稳定，同时避免了医学伦理争议，而成为理想的组织工程骨种子细胞，主要用于向成骨细胞方向诱导以构建组织工程骨。Tali等^[3]研究采用人骨髓间充质干细胞构建软骨，体外接种生物活性材料并植入裸鼠体内，其成软骨效果理想。黄永辉等^[4]采用人骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原骨构建组织工程骨，体外培养后有良好的成骨现象。Kim等^[5]构建了人骨髓间充质干细胞和预先矿化的丝支架结合的组织工程骨并进行体外培养，结果显示人骨髓间充质干细胞在丝支架上增殖和成骨分化的效果明显。

生物骨组织应用于临床的一个重要的阶段是细胞接种后的立体化无菌培养和分化，使可生物降解的多孔支架在提供细胞附着、增殖和分化的同时，给予将要移植用的生物骨支架以立体完整性和均匀性的增殖和降解^[6-7]。据报道和平面培养比较，生物反应器的培养，可以提供给生物支架更均匀地调控变化的营养和氧气等的补充，并且更加容易进行无菌和培养周期等的产业化质量控制^[8-10]。

文章采用自行设计的生物反应器进行了制备的生物骨支架的立体化培养^[11]，并依据现行的国家医疗器械评价标准和方法对制备的生物骨支架进行了成骨方面的动物效能试验研究，期望为生物骨组织的临床和产业化研究打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体内外观察检测性实验。

1.2 时间及地点于2015年6月至2016年10月在深圳职业技术学院应用化学与技术学院实验室完成。

1.3 材料

支架材料：聚乳酸-羟基乙酸(PLGA，75∶25)(相对分子质量100 000，深圳光华伟业实业有限公司，中国)；羟基磷灰石(HA，Sigma-Aldrich，美国)。第5代的人骨髓间充质干细胞株购自广州cyagen公司。

实验动物：普通级新西兰兔，体质量2.6-3.6 kg，雌雄不限，由广东省实验动物中心提供，许可证号：SYXK- (粤)2014-0035。

试剂与仪器：DMEM培养基及胎牛血清(Gibco，美国)；抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松，转化生长因子β(Sigma，美国)；Spectramax M5e多功能酶标仪(molecular devices，美国)；3D打印设备(biosharp，美国Automation 3200)；Hera Cell 240细胞培养箱(thermo，美国)；倒置相差显微成像系统(Olympus，日本)；Quanta 450扫描电镜(FEI，美国)；CT仪(Brilliance CT，荷兰)。

1.4 实验方法

1.4.1 3D支架材料的打印及后处理称取聚乳酸-羟基乙酸1.8 g，加入至5 mL的二噁烷中，完全溶解；取羟基磷灰石3 g，加入至5 mL的二噁烷中浸润，搅动，使其完全浸润；将溶解后的聚乳酸-羟基乙酸与羟基磷灰石混合搅拌均匀制备PLGA/HA。设置立体材料支架的打印参数，层与层之间材料垂直交叉式堆叠，每层内采用平行式放置，每条之间的间隙为1 mm，Z轴方向每次的步进高度为0.1 mm，X 轴和Y轴方向的移动速度为2 mm/s，出料口的孔径控制在0.5-0.1 mm 之间，出料的压力控制在137.9-413.7 kPa之间。打印过程维持支架平台温度为-20 ℃至10 ℃，并且持续给予冷风使固液相分离成型。支架打印完后，进行真空冷冻干燥。将材料放入平皿中，紫外照射30 min，将材料转入灭菌的烧杯，用体积分数75%乙醇完全浸没材料，浸泡30 min灭菌并提高材料的亲水性，吸出乙醇，用PBS清洗3次后浸泡过夜以尽可能除去残存的乙醇。接种细胞前将材料在培养基中浸泡24 h，取出后以无菌滤纸吸干水分。

1.4.2 人骨髓间充质干细胞的培养及接种人骨髓间充质干细胞细胞培养于T175透气细胞瓶中，用基础完全培养基培养，待细胞铺满瓶底，加入2 mL胰酶消化1 min，加入10 mL基础完全培养基终止胰酶消化反应，将细胞悬液收集至离心管中，离心收集细胞，离心后弃上清培养基，加入适量的基础完全培养基重悬细胞浓度至2×10⁹L^-1。将进行过无菌处理的3D支架置于6孔板中，将细胞逐滴滴至材料中心，每块材料滴加0.5 mL，静置1 h，然后加入3 mL基础培养基，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，3 d后加入诱导分化培养基进行诱导分化。

1.4.3 支架材料生物反应器立体培养自行设计的生物反应器(专利授权号：CN201420151906.9)是一个封闭的系统，它们分成2部分：一是母罐(图1A)，可以进行培养液的pH值，DO和培养基组成的实时调节和控制，一组是并联的3个独立的立体培养罐，罐体中央上下分别设置了固定针，可通过调节上下固定针之间的距离将接种了人骨髓间充质干细胞并经过分化的生物骨材料PLGA/HA和聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙骨架固定在子生物反应器的中央(图1B)。母罐和3个小罐可同时联通控制，也可以根据需要分别联通控制，母罐的营养成分根据需要可输送到并联的生物反应器中。

1.4.4 支架材料体内骨修复试验实验动物分组见表1。表中空白材料-PLGA/HA为无细胞支架块，阴性材料- PLGA/HA为接种人骨髓间充质干细胞经立体培养但无诱导分化的支架块，实验材料-PLGA/HA为接种人骨髓间充质干细胞经立体增殖培养和诱导分化的支架块，批号分别为201405^-¹和201405^-²；支架块均为直径3.5 cm×高5.0 cm的圆柱体。

1.4.5 制作骨缺损模型及植入支架材料^[12-1⁴^] 取家兔以3%戊巴比妥钠静脉麻醉(1 mL/kg)，麻醉生效后取侧卧位，四肢固定稳妥后，触摸外侧股骨髁部，划线做标记，碘伏消毒，铺无菌洞巾，在外侧股骨中点处做垂直纵行切口，长约3 cm，依次切开皮肤、皮下、深筋膜及关节囊暴露股骨外侧及外侧半月板外缘。距股骨远端关节面2.0-3.0 cm处，用医用骨科电专钻(钻头外径3.5 mm)与关节面平行由外向内钻孔，深度为5 mm。反复使用生理盐水将骨屑冲洗干净，保持骨面干燥。制备成直径3.5 mm，深5 mm的股骨远端骨缺损模型，根据事先分组情况将实验材料植入实验侧骨缺损，空孔侧仅制造骨缺损模型，不植入任何材料，分层缝合。

1.4.6 术后处理动物麻醉苏醒后允许自由活动，自由饮食，分笼饲养。术后给予肌注青霉素40×10⁴U，1次/d，连续给7 d。每天观察动物手术部位的肿胀情况、动物的活动、精神、饮食以及动物的皮肤有无红肿、感染、渗液和脓肿。

1.5 主要观察指标扫描电镜观察生物骨体外立体诱导培养情况；CT检查和病理组织学检查生物骨体内修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着骨组织工程研究的不断深入，单一材料往往无法满足组织工程支架的所有要求，而复合材料支架是目前研究的热点之一^[17]。梯度骨软骨支架需要同时具有较好的力学性能和亲水性能，既能够保持支架三维形状的稳定性以塑造骨软骨的外形，又有利于细胞的黏附以及植入体内后体液中氧和营养物质的渗入^[18]。在组织工程中常用的材料，以聚乳酸-羟基乙酸为代表的人工合成聚酯材料具有较好的力学性能及可控的降解速度，但亲水性较差，细胞黏附不好^[19-21]。

羟基磷灰石是一种不易吸收的生物活性陶瓷，与正常骨组织十分相似，具有高度的生物相容性，有一定的骨引导力，无炎症及排异反应。根据上述两种材料的特性，选用合适比例的聚乳酸-羟基乙酸和羟基磷灰石，从而达到复合效果^[22]。Attawia等^[23]采用粒子沥滤法制备的三维PLGA/HA(50∶50)复合材料支架，种植上骨细胞后，骨细胞可完好吸附增殖。实验选用了聚乳酸-羟基乙酸(75∶25)，相对分子质量为 100 000，将聚乳酸-羟基乙酸和羟基磷灰石按照3∶10的比例进行配制，成形复合材料的支架，目的是结合两类材料的特点，使支架具有良好的综合性能，材料的物理性能测试结果表明PLGA/HA适合硬骨试验，而且该复合材料在体内有两3个月的降解周期^[7]，不影响新鲜骨组织的生成。

传统的3D支架制作技术有溶剂浇铸-粒子沥滤法^[24]，气体发泡法^[25]，乳化/冻干法，相分离法等，当考虑到材料的多孔性及孔径时，采用上述方法制作的医用再生材料具有一定的局限性。3D打印技术能够直接打印出所设计的骨组织形状，且能控制材料的化学性能及孔间隙，利用3D打印机制作支架材料已经成为目前国际上再生医学研究的一个热点^[26]。Tarafder等^[27]利用3D打印机直接打印了多孔磷酸三钙支架材料，进一步经微波烧结为陶瓷人工骨，采用这种方法制备的人工骨比常规马沸炉和微波消解炉烧结方法机械强度分别提高了46%和69%，且成骨细胞易于黏附生长，具有应用于硬骨修复的潜能。Cox等^[28]利用3D打印技术制备了羟基磷灰石：PVOH(poly(vinyl) alcohol)复合支架材料，材料表面特性，机械性能以及孔间隙能够用于骨组织工程。Jason等^[29]利用3D打印技术制备了磷酸钙和胶原蛋白复合材料并移植至小鼠股骨，结果显示该材料有助于骨修复。研究中根据家兔外股骨缺损形状采用3D打印机制备了聚乳酸-羟基乙酸和羟基磷灰石复合材料。体外细胞培养及体内反应器相比，双轴旋转反应器能够在785 mm³支架材料上获得较高的人骨髓间充质干细胞量且能较早分化成成骨细胞。

Nishi等^[33]利用旋转壁式生物反应器在支架材料上培养了人骨髓间充质干细胞和ES成功构建了血管化组织工程骨。研究中利用了本实验室自主研发的生物反应器(专利号为专利授权号：CN201420151906.9)，由1个母罐和3个子罐组成，可以同时联通使用也可分别控制使用，便于同时分别在子罐中调控分化成不同的骨细胞。图3结果表明，利用本实验室研发的生物反应器可以实现支架材料的三维立体培养，细胞在支架材料上的黏附生长良好，能很好的实现体外成骨。

骨修复过程通常分为3个阶段：血肿炎症机化期、原始骨痂形成期和骨板形成塑性期。血肿炎症机化期中，骨钻孔处的骨膜及周围组织血管破裂形成血肿，并在骨折断端形成无菌炎症反应，形成肉芽组织，此过程一般2周左右完成。原始骨痂形成期中，膜内成骨过程激活，骨内外膜增生，新生血管长入，成骨细胞大量增生，合成并分泌骨基质，使骨缺损处骨样组织逐渐骨化形成新骨，一般需4-8周。骨板形成塑性期中，原始骨痂中新生骨小梁逐渐增粗，排列更为规则致密。骨缺损断端由成骨反应和破骨反应交替进行，完成死骨清除和新骨替代的爬行过程。原始骨痂被板层骨替代，形成坚硬的骨性连接，这一过程需8-12周^[34]。本研究体外修复检查结果表明术后19 d第1次CT，处于血肿炎症机化期完成阶段，检查结果示对照组和打孔处均未见骨缺损段愈合及骨痂形成倾向，实验组可见有骨痂形成并有周围组织的炎症机化反应。实验组骨修复效果明显优于对照组和打孔处。术后40 d第2次CT，处于原始骨痂形成期中段，对照组和打孔处均可见明显的圆形骨缺如，实验组可见骨缺如孔不明显，边缘模糊，缺如部位基本愈合，骨痂形成，见不规则略高密度影，实验组骨修复明显优于对照组和空孔组。成骨修复实验病理组织学检查结果显示，聚乳酸附着成骨干细胞再加分化剂组在骨折创伤的组织吸收过程与骨折后愈合的过程中的效果均优于空白材料和阴性材料；骨缺损模型组未见明显骨折修复病理过程。体外研究和体内骨修复实验均表明，研究中以3D打印技术制备聚乳酸-羟基乙酸：羟基磷灰石复合骨支架，接种人骨髓间充质干细胞细胞后能够在生物反应器中进行三维立体培养，进一步体内修复实验表明，其修复能力明显优于对照组，为进一步用于临床研究提供了依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

生物骨组织立体培养分化和动物体内修复实验

Three-dimensional culture and differentiation of biological bone tissue and its in vivo repair effect in an animal model

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