膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.014

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (5): 736-741.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.014

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膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎

卓群豪¹，张伟娜¹，李舰²，王红卫³，郑峰⁴，应彬彬¹

1宁波市第一医院口腔科，浙江宁波市 315010
2宁波市妇女儿童医院口腔科，浙江省宁波市 315012
3宁波市临床病理诊断中心，浙江省宁波市 315021
4余姚市第二人民医院口腔科，浙江省余姚市 315400

出版日期:2017-02-18 发布日期:2017-03-20
通讯作者: 应彬彬，博士，宁波市第一医院口腔科，浙江宁波市 315010
作者简介:卓群豪，男，1989年生，浙江省宁波市人，汉族，硕士，2015年中南大学毕业，医师。
基金资助:
国家青年科学基金项目(81200800)；浙江省自然科学基金项目(LY12H14002)

Intra-articular injection of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of knee osteoarthritis

Zhuo Qun-hao¹, Zhang Wei-na¹, Li Jian², Wang Hong-wei³, Zheng Feng⁴, Ying Bin-bin¹

1Department of Stomatology, First Hospital of Ningbo, Ningbo 315010, Zhejiang Province, China
2Department of Stomatology, Women and Children Hospital of Ningbo, Ningbo 315012, Zhejiang Province, China
3Ningbo Diagnostic Pathology Center, Ningbo 315021, Zhejiang Province, China
4Department of Stomatology, Second People’s Hospital of Yuyao, Yuyao 315400, Zhejiang Province, China

Online:2017-02-18 Published:2017-03-20
Contact: Ying Bin-bin, M.D., Department of Stomatology, First Hospital of Ningbo, Ningbo 315010, Zhejiang Province, China
About author:Zhuo Qun-hao, Master, Physician, Department of Stomatology, First Hospital of Ningbo, Ningbo 315010, Zhejiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81200800; Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China, No. LY12H14002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因转染技术的特点：是指通过物理或生物方法将目的基因导入到真核细胞的基因组中，使其调控靶细胞向特定的方向表达。常用的方法分非病毒方法和病毒载体方法，非病毒方法有微粒子轰击法、脂质体转染法、电穿孔法等，病毒方法有反转录病毒法、慢病毒法、腺病毒法及腺相关病毒法。
Sox9：Sox9表达于软骨前体细胞及软骨细胞，体外实验表明Sox9对软骨形成起重要作用，与软骨细胞表型分子Col2a1，Col9a1，Col11a2和Aggrecn结合并激活。

摘要
背景：相关研究认为，骨髓间充质干细胞具有良好的增殖及分化能力，Sox9转录因子在软骨形成及维持软骨细胞表型方面起关键作用。
目的：明确Sox9转染骨髓间充质干细胞对骨关节炎病变软骨的修复作用。
方法：体外以慢病毒为载体介导Sox9基因转染骨髓间充质干细胞。通过切断前交叉韧带建立小鼠膝关节骨关节炎模型，将小鼠随机分为生理盐水组、单纯骨髓间充质干细胞组及Sox9转染骨髓间充质干细胞组，分别将0.1 mL生理盐水、0.1 mL无转染骨髓间充质细胞生理盐水溶液、0.1 mL的Sox9转染骨髓间充质细胞生理盐水溶液注射入小鼠膝关节腔内。注射后4，8，12周后通过甲苯胺蓝及免疫组织化学染色检测病变关节软骨的修复情况。
结果与结论：①关节软骨病变：甲苯胺蓝染色显示，生理盐水组关节软骨病变较间充质干细胞组严重，且时间越长差别越明显，单纯骨髓间充质干细胞组软骨损伤有改善，但改善情况差于Sox9转染骨髓间充质干细胞组；②免疫组织化学染色显示，Sox9转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原表达均强于其他2组，各组随时间阳性轻度减弱；③结果提示，Sox9转染小鼠骨髓间充质干细胞对小鼠膝关节炎病变软骨修复有促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1328-9558(应彬彬)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓干细胞, 间充质干细胞, 骨关节炎, Sox9, 软骨, 小鼠, 膝关节, 慢病毒, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are considered to have good proliferation and differentiation potentials. Sox9 is a transcription factor that is essential for chondrogenesis and has been termed as a “master regulator” of the chondrocyte phenotype.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effects of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cells on knee osteoarthritis.
METHODS: The bone marrow mesenchymal stem cells were transfected with Lenti-Sox9-EGFP in vitro. The model of murine knee osteoarthritis was established by cutting off the anterior cruciate ligament. Thirty model mice were randomly divided into three groups, as normal saline group, bone mesenchymal stem cell group and Sox9-transfected bone mesenchymal stem cell group. 0.1 mL of normal saline, 0.1 mL of normal saline containing non-transfected bone marrow mesenchymal cells (non-transfected group), or 0.1 mL of normal saline containing Sox9-transfected bone marrow mesenchymal cells (Sox9-transfected group) was injected into the knee joint cavity of mice in the corresponding group, respectively. After 4, 8, 12 weeks, the repair of articular cartilage lesions was evaluated by toluidine blue and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The lesions of articular cartilage were more serious in the normal saline group, compared with the other two groups, and the difference became more obvious over time. Damaged articular cartilage was improved in the non-transfected group, but the improvement was less than that in the Sox9-transfected group. Immunohistochemistry staining revealed that in the Sox9-transfected group, the positive type II collagen expression was stronger than that in the other two groups, but this positive expression was decreased over time in all the three groups. These results suggest that Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cells promote the repair of damaged cartilage in mice with knee osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Osteoarthritis, Mesenchymal Stem Cells, Cartilage

中图分类号:

R394.2

卓群豪，张伟娜，李舰，王红卫，郑峰，应彬彬. 膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(5): 736-741.

Zhuo Qun-hao, Zhang Wei-na, Li Jian, Wang Hong-wei, Zheng Feng, Ying Bin-bin . Intra-articular injection of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(5): 736-741.

图/表（结果） 2

2.1 Sox9 基因转导的骨髓间充质干细胞鉴定 经流式细胞仪鉴定显示，检测的标记物CD34(-)，CD45(-)，CD44(+)，CD105(+)，证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。

2.2 基因转染效率 在荧光显微镜下，骨髓间充质干细胞转导3 d后，可观察到绿色荧光蛋白阳性细胞最多，流式细胞仪检测其转染效率为65%, 免疫组织化学检测提示Sox9表达阳性。RT-PCR结果提示：Lenti-Sox9-EGFP转染骨髓间充质干细胞在转染后1周时Sox9表达率最高，并在其后3周内维持在较高水平。

2.3 关节软骨组织学变化

甲苯胺蓝染色：注射后4周，生理盐水组甲苯胺蓝染色稍变浅，软骨表层有裂缝；单纯骨髓间充质干细胞组软骨细胞增多，软骨层增厚；Sox9转染骨髓间充质干细胞组与正常关节软骨比较无显著差异(图1)。注射后8周，生理盐水组软骨细胞减少，可见软骨细胞簇，排列紊乱，甲苯胺蓝染色变浅；单纯骨髓间充质干细胞组软骨细胞成簇增殖明显，甲苯胺蓝染色中度减退；Sox-9转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞轻度减少，软骨层变薄，甲苯胺蓝色染色稍变浅(图2)。注射后12周，生理盐水组软骨细胞明显减少，软骨层剥脱，软骨下骨暴露，甲苯胺蓝色染色几乎消失；单纯骨髓间充质干细胞组软骨表层裂隙达软骨全层，甲苯胺蓝染色重度减退；Sox9转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞减少，软骨表层有浅的裂隙，甲苯胺蓝染色中度减退(图3)。

各组各时间点标本改良Mankin评分结果如表2所示。生理盐水组软骨损伤程度较单纯骨髓间充质干细胞组、Sox9转染骨髓间充质干细胞组明显严重，且时间越长差别越明显，单纯骨髓间充质干细胞组软骨损伤有改善，但改善情况差于Sox9转染骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：Sox9转染骨髓间充质干细胞组阳性强于其他2组，随注射时间延长，各组染色阳性都变弱(图4)。

2.4 Sox9转染骨髓间充质干细胞追踪 关节腔内注射2周后，荧光显微镜下观察Sox9转染骨髓间充质干细胞组膝关节软骨，见大量阳性的分化的形态较好的软骨细胞(图5)，提示Sox9转染骨髓间充质干细胞成功分化为软骨细胞并发挥作用。

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引言

骨关节炎是一种临床上常见的退行性关节疾病，以进行性软骨退变、软骨下骨改变、骨赘形成等为其主要病理特征^[1-4]。临床上骨关节炎患者常出现疼痛及功能受限，是老年人中引起关节疾病的最常见原因^[4-6]。骨关节炎状态下，软骨细胞表型发生改变，合成-分解代谢失衡，最终导致软骨的破坏。目前，临床上治疗骨关节炎的方法效果不佳^[7-10]。

近年来，干细胞移植相关研究为骨关节炎的治疗带来希望。其中，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)因其具有良好的增殖及分化能力，广泛应用于体内外研究中^[11-15]。其中，生长因子被发现对骨髓间充质干细胞的增殖及分化起重要作用，不同的细胞因子或生长因子，如胰岛素样生长因子，骨形态蛋白，转移生长因子β，均已被证明可以促进软骨基质合成及促进软骨病损的修复^[13^，^16-20]。然而生长因子主要通过分泌到细胞外发挥作用，其浓度会受到局部环境的影响，因而生物性效应难以调控^[21]。

Sox9属于SOX(Sry-type HMG box)蛋白家族，是细胞内的调控因子，其发挥生物学效应主要在细胞内。Sox9表达于软骨前体细胞及软骨细胞，体外实验表明，Sox9对软骨形成起重要作用，与软骨细胞表型分子Col2a1，Col9a1，Col11a2和Aggrecn结合并激活^[22-32]。此外，Sox9 能够阻止软骨细胞肥大及促进未分化的软骨细胞再分化^[33-34]。

实验旨在探讨转染Sox9骨髓间充质干细胞对小鼠膝关节骨关节炎的治疗作用，为临床上治疗骨关节炎提供实验依据。

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2013年1月至2015年1月在宁波大学细胞生物实验室完成。

1.3 材料 CBL57小鼠46只，雌雄不限，体质量20-30 g，由宁波大学实验动物中心提供。所有动物允许自由活动，喂养于严格消毒的动物房内，环境温度25 ℃，空气湿度70%，饲料和水经消毒后进食均为无菌动物。实验过程中对动物的处理符合实验动物的伦理学要求^[35]。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞提取及分离培养 C57BL小鼠6只过量麻醉处死，体积分数75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在含有青链霉素的PBS中。倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨髓腔3遍。用1 mL一次性注射器吸取间充质干细胞培养基(ScienCell，CA，USA)，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲，至骨腔颜色变白。将骨髓冲出的细胞生长液至60 mm培养皿中，将培养皿放置在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱(Forma，USA)中常规培养。48 h后半量更换细胞生长液，以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 通过CD34，CD44，CD45，CD105这4种骨髓间充质干细胞表面抗原进行鉴定，证明所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。取第3代生长良好的干细胞，用胰蛋白酶(Sigma美国)消化，吹打成细胞悬液并计数，细胞数大于1×10⁹ L^-¹，放置与离心管中，1 200 r/min离心，弃上清保留细胞，加入PBS 500 μL吹打成悬液标记清楚，第1管中加入CD34，CD45，第2管中加入CD44，CD105，第3管中加入CD105，CD45，第4管不加任何抗体。利用流式细胞仪(美国BD公司)进行干细胞表型的鉴定。

1.4.3 Sox9-慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞 取第3代生长良好的小鼠骨髓间充质干细胞，细胞达80%融合时，用慢病毒基因载体Lenti-Sox9-EGFP(清弘公司，上海，中国)对其进行转染，并在倒置荧光显微镜(Olympus，日本)下观察荧光表达情况，并用流式细胞仪检测转染效率。通过RT-PCR(Primescript RT Master Mix，Takara，日本)定量分析转染后骨髓间充质干细胞Sox9表达情况及检测转染率：分别提取正常细胞及转染后 3，7，14 d的细胞RNA (Trizol试剂，Invitrogen，美国)，然后反转录成cDNA，PCR仪(Bio-Rad，美国)扩增分析，测定Sox9含量的变化。引物：Sox9：上游引物：5’-GGT GCT CAA GGG CTA CGA CT-3’，下游引物；5’-GGG TGG TCT TTC TTG TGC TG-3’。

1.4.4 动物建模、分组及膝关节腔内注射 通过切断小鼠膝关节前交叉韧带建立骨关节炎模型^[36-37]。用体积分数3.5%水合氯醛(10 μL/g)腹腔注射麻醉小鼠后，常规备皮消毒手术区域。取髌旁内侧切口，切开皮肤及关节囊进入关节腔向外侧牵开髌骨，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带及内侧半月板前角，切断双侧前交叉韧带并行前抽屉试验确认已完全切断。术中注意保护关节软骨面。生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合关节囊及皮肤。

建模后2周，将建模成功的36只C57BL小鼠随机分为3组，每组12只，各24个膝关节标本，生理盐水组为0.1 mL生理盐水膝关节腔内注射；单纯骨髓间充质干细胞组为0.1 mL含1×10⁷无Sox9转染骨髓间充质干细胞生理盐水溶液膝关节腔内注射；Sox-9转染骨髓间充质干细胞组为0.1 mL含1×10⁷ Lenti-Sox9-EGFP转染骨髓间充质干细胞生理盐水膝关节腔内注射。另外4只建模小鼠注射Lenti-Sox9-EGFP转染骨髓间充质干细胞，2周后处死荧光显微镜下追踪Sox9转染细胞。

1.4.5 组织学观察 注射后4，8，12周分别处死各组小鼠，取双侧膝关节标本，进行甲苯胺蓝染色和及Ⅱ型胶原兔抗鼠单克隆抗体及羊抗兔二抗(Abcam，美国)免疫组织化学检测，并根据改良Mankin评分表(表1)对各组软骨情况进行评分^[38]。

1.5 主要观察指标 注射后4，8，12周3组的组织学甲苯胺蓝染色、关节软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及注射后2周Sox9转染骨髓间充质干细胞组膝关节软骨的细胞免疫荧光检测。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据采用x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨是一种无血管和神经组织，因此，发生疾病及创伤后其自我修复能力有限。关节软骨主要有软骨细胞及其分泌的软骨细胞基质构成。骨关节炎时，软骨细胞终末向分化，基质分解与合成代谢失衡，导致软骨发生破坏。目前临床上病变软骨的修复仍是一个棘手的难题^[39]。

组织工程技术可能是一种新的替代治疗方法。但种子细胞的获得及生理特性的维持是一个难题。自体软骨细胞移植面面临骨细胞传代过程中的脱分化及供区损伤的问题，采用干细胞移植，则需要解决其软骨向分化和维持软骨表型特征的问题^[40]。与基因工程技术相结合，可以使得生长因子以较稳定的浓度持续地发挥作用^[17]。

Sox9主要在软骨细胞中表达，是软骨发育过程中的关键转录因子，对胚胎时期的软骨发育，成熟有着重要的调节作用。启动 Sox9基因可促使骨髓间充质干细胞向软骨方向分化，并且在软骨内成骨过程中将Sox9基因转入增殖期软骨细胞。另外，Sox9的过表达会导致成骨特异性分子 Runx2表达延迟和减少，抑制成骨过程^[30^，^41]。同时Sox9可激活软骨细胞特征分子如Ⅱ型胶原、aggrecan蛋白等的表达，调控软骨主要基质成分基因，如 Col9a1，Col9a2和Col11a2等的表达，从而调控软骨分化。有研究表明多种生长因子如妆花生长因子β等可促进Sox9表达，促进成软骨过程。因此，Sox9是促使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的重要环节。

既往有Sox9-慢病毒转染至软骨缺损模型中研究对软骨损伤修复的研究^[29]，尚无关于其对骨关节炎病变关节软骨修复作用的报道。实验首先通过前交叉韧带切除建立骨关节炎模型，通过生理盐水组标本不同时间点Mankin评分结果及免疫组织化学染色结果，提示骨关节炎模型建立成功。

实验采用慢病毒基因诱导的方法，将Sox9基因转导到骨髓间充质干细胞中，相较单纯注射生长因子产生持续、稳定、长时间的表达。首先，实验通过甲苯胺蓝染色及改良Mankin评分对Sox9基因通过慢病毒转染到骨髓间充质干细胞中治疗作用并进行评定。实验表明，Sox9基因过表达后的骨髓间充质干细胞对于病变软骨修复作用强于单纯的骨髓间充质干细胞。免疫组织化学结果可以得出Sox9转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原表达强度强于单纯骨髓间充质干细胞组，提示Sox9基因过表达后的骨髓间充质干细胞在体内对关节缺损修复的具体作用及效果，这与之前的研究结果一致^[29^，^32]。其次，随着时间推移，关节软骨病变逐渐加重，Sox9转染骨髓间充质干细胞组也呈现一定程度的骨关节炎病变，提示如何维持Sox9基因的作用时间对治疗骨关节炎十分重要。

综上，Sox9转染小鼠骨髓间充质干细胞对病变软骨修复有促进作用，可为临床治疗关节软骨损伤提供一种新的方法和途径。

膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎

Intra-articular injection of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for treatment of knee osteoarthritis

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