人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (51): 7678-7683.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.012

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

王广宇，王雨，朱艳萍，康煜冬，王伏声，丁毅，董雨，徐旭英

首都医科大学附属北京中医医院疮疡外科，北京市 100010

收稿日期:2016-09-17 出版日期:2016-12-09 发布日期:2016-12-09
通讯作者: 徐旭英，副主任医师，首都医科大学附属北京中医医院疮疡外科，北京市 100010
作者简介:王广宇，男，1971年生，硕士，副主任医师，主要从事慢性溃疡中西医结合治疗。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目面上项目(81673975)；首都中医药研究专项一般项目(15zy16)；医院骨干课题(2014GG-01)

Isolation, cultivation and identification of human skin microvascular endothelial cells

Wang Guang-yu, Wang Yu, Zhu Yan-ping, Kang Yu-dong, Wang Fu-sheng, Ding Yi, Dong Yu, Xu Xu-ying

Department of Ulcer Surgery, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China

Received:2016-09-17 Online:2016-12-09 Published:2016-12-09
Contact: Xu Xu-ying, Associate chief physician, Department of Ulcer Surgery, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China
About author:Wang Guang-yu, Master, Associate chief physician, Department of Ulcer Surgery, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China
Supported by:
the General Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81673975, the General Project of Capital Traditional Chinese Medicine Research, No. 15zy16; the Key Subject of the Hospital, No. 2014GG-01

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内皮细胞：也称血管内皮细胞，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，它形成血管的内壁。它们具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与集体免疫活动功能。
微血管：一般指毛细血管。毛细血管(capillary)是管径最细(平均为6-9 μm)，分布最广的血管，它是连接微动脉和微静脉的血管。它们分支并互相吻合成网。管壁薄，通透性强，其功能是利于血液与组织之间进行物质交换。

摘要
背景：目前，国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养，同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。
目的：探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。
方法：利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后，肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。
结果与结论：①实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞，原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h 后基本完全贴壁，第10 天进入对数生长期，第12 至13 天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7 d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布；②免疫组织化学染色结果显示，培养的细胞中FⅧ因子与CD31 相关抗原呈阳性，细胞阳性率达100%；③MTT 法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。④结果证实，应用贴壁法，并在培养过程中少量短时应用胰酶法，可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5389-9000(王广宇)

关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 微血管, 人皮肤真皮浅层, 原代培养, 免疫组织化学染色, 细胞鉴定, FⅧ因子相关抗原, CD31, MTT法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the enzymatic digestion combined with magnetic activated cell sorting for isolating microvascular endothelial cells are cumbersome and do harm to cells. Therefore, how to simplify the isolation and culture of human dermal microvascular endothelial cells to obtain highly purified endothelial cells in vitro becomes a hotspot.
OBJECTIVE: To explore a simple and effective cultivation method of microvascular endothelial cells from diabetic patient skins in vitro, and to detect the cell growth.
METHODS: Diabetic patients with chronic foot wounds after amputation were enrolled to collect the limb proximal skin and topical skin around the wound superficial dermal tissue. Human dermal microvascular endothelial cells were obtained using adherent method and trypsin method, folloewd by purified utilizing trypsin digestion and repeated attachment method when passage culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Human dermal microvascular endothelial cells were obtained successfully, Primary cultured endothelial cells completely adhered to the wall at 24 hours, entered the logarithmic phase at the 10th day, and the cell concentration reached 80% at the 12th-13th day. While the passage cells grew more actively than primary cells, and fully covered the bottom in a “cobblestone” arrangement after 5-7 days of culture. Immunohistochemical staining showed that cultured cells were positive for FVIII and CD31-associated antigens with 100% positive rate. MTT assay showed that cell growth curves of 2, 4, and 5 generations of dermal microvascular endothelial presented the inverted "S" shape. These results suggest that abundant highly purified human dermal microvascular endothelial cells can be obtained through the adherent method and a small amount of short-term trypsin method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Skin, Endothelial cells, Blood Vessels, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王广宇，王雨，朱艳萍，康煜冬，王伏声，丁毅，董雨，徐旭英. 人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(51): 7678-7683.

Wang Guang-yu, Wang Yu, Zhu Yan-ping, Kang Yu-dong, Wang Fu-sheng, Ding Yi, Dong Yu, Xu Xu-ying . Isolation, cultivation and identification of human skin microvascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(51): 7678-7683.

图/表（结果） 2

2.1 倒置相差显微镜下观察原代培养的人皮肤微血管内皮细胞形态原代培养24 h细胞从组织块中爬出，逐渐贴壁，但此时形态、大小差异较大，多呈不规则形，

如三角形、短条形、短细梭形，少数细胞伸展呈单个或簇团存在，较为稀疏，创面组织较截肢近心端皮肤组织培养细胞形态更为散乱；原代细胞贴壁后生长缓慢， 10 d左右才进入对数生长期，随后两三天细胞可达80%融合。48 h贴壁细胞逐渐增加，形态逐渐趋于饱满，形态逐渐趋于较为一致，短梭形、小三角形、较粗的短棒状(图1)，创面组织生长更为缓慢，形态散乱；60 h时贴壁细胞数量继续增加，多呈短梭、三角形、甚至条状，较前饱满，可见圆形、椭圆形细胞核，部分细胞核内可见点状核仁。三四天后，细胞开始融合，细胞形态拉长呈“纺锤形”；培养5-7 d细胞铺满，呈典型“铺路石样”排布。

传代至第5代细胞进入对数增长期时间较原代要长，细胞形态较之更加饱满圆润。

2.2 人皮肤微血管内皮细胞的鉴定结果细胞免疫组织化学染色后表明，人皮肤微血管内皮细胞对Ⅷ因子及CD31相关抗原抗体呈阳性反应，阳性率为95%，可见胞浆内有大量褐色颗粒(图2)；其中颗粒褐染第5代较原代明显增加。

2.3 人皮肤微血管内皮细胞生长情况 MTT法测定培养第2，4，6代细胞的生长曲线显示，总的规律为：接种第1，2天细胞数较少，第3天细胞数明显增加，第3-5天为对数生长期；接种5 d后细胞增殖速度较前下降，细胞生长曲线近似横置“S”形，为“潜伏期-对数生长期-平台期”的生长模式(图3)。传代至第5代细胞进入对数增长期时间较原代要短，细胞形态较之更加饱满圆润。

参考文献

[1] 赵景宏,黄岚,王军平,等.大鼠肾小球内皮细胞培养及高糖对其分泌NO的影响[J].免疫学杂志,2007,23(1):13-15.

[2] 瞿海龙,陈晓春.大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进[J].内蒙古医学院学报,2007,29(3):164-166.

[3] 王征,齐炜炜,陈少波,等.一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法[J].热带医学杂志,2012,12(1): 1-3+21.

[4] 贾建桃,张慧英,王黎敏,等.肺微血管内皮细胞原代培养方法的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2014,30(7): 763-766.

[5] 彭岳,李树民,黎桂玉,等.肝窦内皮细胞分离、培养与鉴定的研究概况[J].世界华人消化杂志,2015,23(5):728-734.

[6] 黄健兵,龚德军,胡丰庆,等.兔静脉血管内皮及平滑肌细胞原代培养方法的改进及鉴定[J].山东医药,2008,48(27): 35-36.

[7] 王莉,张端莲,陕声国,等.血管瘤内皮细胞培养方法的改进及鉴定[J].数理医药学杂志,2005,18(6):12-13.

[8] 葛敏,蒋朝华,戴婷婷,等.不同血清浓度对淋巴管内皮细胞培养的影响[J].组织工程与重建外科杂志,2013,9(3): 121-124.

[9] 彭岳,李树民,黎桂玉,等.肝窦内皮细胞分离、培养与鉴定的研究概况[J].世界华人消化杂志,2015,23(5):728-734.

[10] 李玉珍,刘秀华,蔡莉蓉.改良的心肌微血管内皮细胞分离培养方法[J]. 微循环学杂志,2006,16(4):10-11.

[11] 王荫静,朱美财,占志,等.牛肾上腺毛细血管内皮细胞的长期培养及用于测定内皮细胞抑素活性[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2001,17(1):88-89.

[12] 张慧丽,杜培丽,方元龙,等.人皮肤微血管内皮细胞的分离培养及鉴定[J].中国组织工程研究,2014,18(11): 1706-1711

[13] 朱澄,邱孝芝. 兔和人角膜内皮细胞培养方法研究[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2000,5(2):3-7.

[14] 张军霞,向光大,孙慧伶,等.α-硫辛酸对高糖作用下人脐静脉内皮细胞护骨素表达的影响[J]. 中国糖尿病杂志, 2010, 18(8):579-581.

[15] Yan LF, Wei YN, Nan HY, et al. Proliferative phenotype of pulmonary microvascular endothelial cells plays a critical role in the overexpression of CTGF in the bleomycin- injured rat.Exp Toxicol Pathol. 2014;66(1): 61-71.

[16] Sölder E, Böckle BC, Nguyen VA, et al. Isolation and characterization of CD133+CD34+VEGFR-2+CD45- fetal endothelial cells from human term placenta. Microvasc Res.2012;84(1): 65-73.

[17] An P, Xue YX. Effects of preconditioning on tight junction and cell adhesion of cerebral endothelial cells. Brain Res.2009;1272:81-88.

[18] Nguyen VA, Fürhapter C, Obexer P, et al.Endothelial cells from cord blood CD133+CD34+ progenitors share phenotypic,functional and gene expression profile similarities with lymphatics. J Cell Mol Med. 2009;13(3):522-534.

[19] Dye JF, Vause S, Johnston T, et al. Characterization of cationic amino acid transporters and expression of endothelial nitric oxide synthase in human placental microvascular endothelial cells. FASEB J. 2004; 18(1): 125-127.

[20] Laranjeira MS, Fernandes MH, Monteiro FJ.Reciprocal induction of human dermal microvascular endothelial cells and human mesenchymal stem cells: time-dependent profile in a co-culture system. Cell Prolif.2012;45(4):320-334.

[21] Talavera-Adame D, Ng TT, Gupta A,et al. Characterization of microvascular endothelial cells isolated from the dermis of adult mouse tails. Microvasc Res. 2011;82(2):97-104.

[22] Sievers H, Bahramsoltani M, Kässmeyer S,et al.In vitro angiogenic potency in human microvascular endothelial cells derived from myocardium, lung and skin. ClinHemorheolMicrocirc. 2011;49(1-4):473-486.

[23] Dunk CE, Roggensack AM, Cox B, et al. A distinct microvascular endothelial gene expression profile in severe IUGR placentas.Placenta.2012;33(4):285-293.

[24] Ugele B, Lange F.Isolation of endothelial cells from human placental microvessels: effect of different proteolytic enzymes on releasing endothelial cells from villous tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2001;37(7): 408-413.

[25] 贾建桃,张慧英,王黎敏,等.肺微血管内皮细胞原代培养方法的建立[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2014,29(7): 763-766.

[26] 瞿海龙,陈晓春.大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进[J]. 内蒙古医学院学报,2007,48(3):164-166.

[27] 殷杰,马珍妮,赵小娟,等.人外周血来源的过度生长内皮细胞的分离、培养及鉴定[J].中国实验血液学杂志,2014, 21(6):1711-1715.

[28] 张步春,王安才,李利芳,等.血管内皮细胞体外培养方法的实验研究[J]. 实用医学杂志,2009,37(7):1048-1049.

[29] 黎胜苗,罗春芬,卢兰琴,等.原代人脐静脉内皮细胞分离培养模型的建立[J].医学研究杂志,2013,41(5):94-96.

[30] 黄盛东,刘晓红,杨立信,等.血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞[J]. 第二军医大学学报,2003,23(12):1280-1283

[31] State Council of the People's Republic of China. Administrative Regulations on Medical Institution. 1994-09-01.

[32] 常冰梅,李美宁,刘志贞,等.肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响[J]. 中国免疫学杂志, 2011,26(8):686-690.

[33] 刘婷,杜雪莲,盛修贵,等.人卵巢上皮癌微血管内皮细胞分离培养与鉴定[J].中华肿瘤防治杂志,2013,19(15): 1168-1171.

[34] Rohde LH, Janatpore MJ, McMaster MT, et al. Complementary expression of HIP, a cell-surface heparin sulfate binding protein, and perlecan at the human fetal-maternal interface. BiolReprod. 1998; 58(4):1075-1083.

[35] Lang I, Schweizer A, Hiden U, et al. Human fetal placental endothelial cells have a mature arterial and a juvenile venous phenotype with adipogenic and osteogenic differentiation potential. Differentiation. 2008;76(10):1031-1043.

引言

糖尿病伴慢性难愈合创面的治疗是目前临床上的难点，对于慢性创面的清创、截趾、切开等处理，要建立在局部循环改善的基础下，所以破溃处循环的进一步增加显得尤为重要。目前干预方法较多，例如腔内介入治疗、扩张血管的药物、外用药物、创缘干细胞移植等方法。随着外用药物的不断出现，如果能够掌握创面内皮细胞的病理生理特点，为临床药物效果、机制、特点的研究创造良好的条件，能更有针对性地去纠正局部的偏差，建立创面人皮肤微血管内皮细胞培养体系，显得十分必要。

目前细胞培养上主要来源于动物的内皮细胞，如大鼠、小鼠、牛等，内皮细胞来源的组织，主要有肾小球、主动脉、视网膜微血管、肺动脉、肝窦、心肌微血管、静脉、肾上腺微血管、淋巴管等内皮细胞^[1-11]。人来源组织中内皮细胞培养较少，主要有脐静脉、角膜细胞、胎盘微血管内皮细胞等^[12-14]，并未查到关于来源于人局部创面微血管内皮细胞的培养文献报道。

内皮细胞作为人体内遍布所有组织的一种细胞，具有相对异质性，其不同位置、不同组织器官、甚至同一区域的内皮细胞，在细胞形态结构、表型、生理功能、病理特点，都表现出明显有差异^[15-19]。国外在皮肤微血管内皮细胞培养上，近年来主要集中基础研究，如与间充质干细胞的共培养^[20]、表型特点^[21]、不同组织来源的内皮细胞的不同等^[22]。目前内皮细胞培养的方法，按照提取、分离的方式不同，即是如何得到相对纯净的内皮细胞，分为4种方法：一是采用免疫磁珠分选微血管内皮细胞培养^[23]，虽能获得较纯净的内皮细胞，然而磁珠分选法对细胞的损伤较大，尤其是对于创面内微血管内皮细胞，本来存在一定的损伤，故在临床研究中应用性

不高；二是取得皮肤组织后，应用不同种类的酶进行组合，然后依次消化，步骤极度繁琐，仍有一定程度损伤，此方法实际应用很少；三是Perco Ⅱ密度梯度分选方法的基础上^[24]，采用多个非连续Perco Ⅱ密度梯度，但所收获的内皮细胞最高纯度只有80%-85%；四是采用贴壁法^[25-26]，利用内皮细胞的贴壁特点进行纯化，多与其他方法共同应用。实验应用贴壁法进行人皮肤微血管内皮细胞培养和纯化，并进行了初步的鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2015年6至12月在北京中医医院疮疡外科住院部完成。

1.3 材料实验标本均来自北京中医医院疮疡外科住院部2015年6至12月行大腿截肢患者，取大腿截肢后足部创面周围皮肤和截除大腿近端皮肤的真皮层。根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[25]，经过医院伦理委员会论证并同意，在取标本前将实验方案充分告知患者，签署知情同意书。

试剂及仪器：DAB显色液(Cat.NoP0202，中国碧云天)；胰酶 (Cat.NoREK3012，锐尔康)；山羊抗兔IgG(H+L)-HRP(Cat.NoCW0103，CWbio.Co.Ltd)；Factor Ⅷ抗体(美国Roche公司)；CD31抗体(美国Roche公司)；倒置显微镜(重庆光电)。

主要试剂配制：完全培养液，加入终浓度10×10⁴ U/L青霉素/环丙沙星及终浓度为25 mg/L两性霉素B溶于DMEM培养液80 mL及20 mL优质胎牛血清中，制成100 mL完全培养液。

1.4 实验方法

1.4.1 标本保存将所取标本尽量剪成小块，最好为2-4 cm³，如体积偏大，要求行长条状，立即放入DMEM培养基中，注意培养液要充分浸泡所取组织，可放在 5 ℃冰箱中冷藏保存。培养基中要提前放入一定量的抗菌素。

1.4.2 人皮肤微血管内皮细胞原代培养将组织从保存培养基中取出，并应用10×10⁴U/L的青霉素+10×10⁴U/L乳酸环丙沙星清洗3次；将组织修剪成1 mm×1 mm× 1 mm大小的组织块，置于预先用培养基湿润的培养皿中，CO₂孵箱内静置2 h后加入完全培养液；60 h左右去除组织块，待细胞汇合成单层后冻存或进行后续实验。

1.4.3 内皮细胞纯化每24 h可更换培养基，先滴入胰酶两三滴，10 s后弃去培养基，再更换新的培养基。

传代培养：倒置显微镜下观察，待细胞融合80%以上时，用0.25%胰酶消化一两分钟，细胞皱缩变圆，加入等体积完全培养基终止消化。收集消化细胞置15 mL离心管中，1 000 r/min 离心10 min。加入适量培养液重悬细胞，吹打混匀，按1∶2传代。

单细胞悬液制备：同传代培养。

1.4.4 人皮肤微血管内皮细胞的鉴定^[27-28]：

形态学观察：倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，并摄片。

细胞表面CD31抗体及FⅧ因子相关抗原的免疫细胞化学染色检测：提前24 h将细胞铺于细胞爬片上；将细胞爬片用10 mmol/L的PBS洗涤2次后用40 g/L多聚甲醛固定；体积分数3% H₂O₂室温孵育10-15 min以消除内源性过氧化物酶活性；0.1% TritonX-100室温孵育10 min细胞穿孔；PBS洗3次，滴加特异性第一抗体：抗八因子抗体1∶200稀释，CD31抗体1∶400稀释， 4 ℃湿盒过夜孵育；PBS洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔IgG 1∶50 稀释二抗；37℃湿盒孵育45 min；PBS洗3次，DAB避光显色4 min，蒸馏水洗片终止显色，镜下观察拍照。荧光倒置相差显微镜下观察细胞，随机取10个高倍视野(×200)计数阳性细胞及细胞总数。阳性染色细胞率=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。设立相应的阴性对照组，以PBS代替一抗，其他步骤同上。

1.4.5 细胞生长曲线测定^[29-30] 选取第2，4，6代皮肤微血管内皮细胞，调整接种浓度为2×10⁷ L^-1接种于96孔板上，每隔24 h取6孔细胞加MTT溶液(质量浓度5 g/L) 20 μL/孔，37 ℃孵育4 h后终止培养，小心吸弃培养液清液，每孔加150 μL二甲基亚砜，震荡10 min使结晶物充分溶解。酶联免疫监测仪上以490 nm波长处测定各孔吸光度值(A)，连测7 d。以时间为横轴，每日所测平均A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.5 主要观察指标人皮肤微血管内皮细胞的形态学及免疫组织化学染色的鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

实验组织取自截除肢体近心端，虽为“正常”组织作为对照，但因患者糖尿病病程长，下肢缺血等情况存在，细胞功能仍有一定下降，在实验过程中也有一定体会，两种来源的细胞易于被破坏，不易进行过多的干预。所以实验采用了较温和的方法分离皮肤微血管内皮细胞。笔者观察应用胰酶时细胞破坏较多，导致培养后期细胞损失过多。故实验中，应用胰酶时间要短，多在10 s左右即可。培养前组织块体积尽量小，第1次贴壁时间较长，避免太早第1次换液，控制在24-36 h，或采用滴加培养基的方法。不应用Percoll分离液、胰酶消化法纯化细胞，尽量应用反复贴壁法，也能够达到要求。

在实验中观察到所取两种组织存在相对异质性，局部创面组织来源的内皮细胞在培养中更易损伤、培养难，可能存在质、量上的变化，需要有进一步研究；另外随着传代次数增加，两种组织培养的细胞生长速度及形态更加趋于一致，似乎随着传代细胞的损失的功能得到部分恢复。这提示在进行药理、病理机制等研究时必须应用原代或者1-3代的内皮细胞作为研究细胞。

通过实验体会到，要成功获取皮肤微血管内皮细胞应注意：①所取组织尽量新鲜无菌，严格遵守无菌操作，保存组织的培养基、原代应用培养基中一定要加入抗菌素，并且最好覆盖球菌和杆菌，甚至可依据药菌结果选择，抗菌素浓度要在最小抑菌浓度以上，有助于提高细胞成活率。作者的经验是青霉素和环丙沙星较为可靠；②组织要尽量剪碎，避免研磨以减轻损伤细胞，并且要去掉表皮及皮下组织；③细胞纯化时不应用Percoll密度梯度离心、和酶解法，减少对细胞的损伤，应用反复贴壁法进行培养细胞纯化，虽然不能达到100%，但对于药理及机制研究已经足够；为了获得更纯的内皮细胞，可在传代时短时(10 s)、少量应用胰酶(一两滴)，即终止消化，这样可以去除对胰酶更敏感的成纤维细胞^[31]。

用MTT法检测纯化人皮肤微血管内皮细胞生长曲线^[32-33]，细胞生长曲线近似横置“S”形，符合细胞“缓慢增殖期、对数生长期、增殖平台期”的生长模式。但似乎创面微血管内皮细胞横置“S”更加趋于平坦和右移，说明他们存在相对异质性。

实验采用CD31及Ⅷ因子相关抗原抗体免疫组织化学染色，进一步证实培养的是人皮肤微血管内皮细胞，结果显示实验所培养的目的细胞中CD31与vWF抗体呈高表达状态(阳性率为95%)，与以往文献报道结果相似^[34]。Ⅷ因子及CD31被认为是鉴定血管内皮细胞的特异性、传统标记物^[35]。

综上所述，实验在依据传统方法上，多次实践，应用贴壁法、胰酶的短时少量应用，成功获取人皮肤微血管内皮细胞，通过鉴定符合血管内皮细胞性质，为体外研究皮肤血管内皮细胞生物学特性、不同来源内皮细胞的对比、药物机制的研究提供良好的实验模型，对糖尿病伴慢性难愈合足部创面治疗的研究提供了一条新的途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

Isolation, cultivation and identification of human skin microvascular endothelial cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[2]	马子越, 巨啸晨, 张磊, 孙荣鑫. 保留与不保留残端重建前交叉韧带后移植物腱骨愈合的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 582-587.
[3]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[4]	曹阳, 张军平, 彭立, 丁义, 李光辉. 兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3000-3003.
[5]	刘涛, 张霓霓, 黄桂林. 细胞外囊泡与放射性组织损伤的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2121-2126.
[6]	古晶晶, 周芮, 杨婷婷, 杨小萍, 许飞, 郑波. 人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 50-55.
[7]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[8]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[9]	张聪, 赵岩, 杜小宇, 杜欣瑞, 庞廷娟, 付怡凝, 张浩, 张步洲, 李筱贺, 王利东. 青少年特发性脊柱侧凸腰主弯患者腰椎-骨盆的生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1155-1161.
[10]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[11]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[12]	林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.
[13]	岑妍慧, 夏猛, 贾微, 罗伟生, 林江, 陈松林, 陈炜, 刘鹏, 黎明星, 李景云, 李曼莉, 艾丁丁, 蒋云霞. 黄芩素能下调诱捕受体3表达抑制肝癌干细胞的生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1023-1029.
[14]	刘群, 孙东东, 高丽兰, 何志江, 孙明林. 经皮椎体后凸成形后再发骨折相关因素的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 976-984.
[15]	和雨洁, 王海燕, 李志军, 李筱贺, 蔡永强, 戴丽娜, 许阳阳, 王一丹, 徐雪彬. 学龄期儿童胸椎经“椎弓根-肋骨”单元内固定的数字化测量[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(6): 869-876.