骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.020

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (50): 7586-7593.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.020

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骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展

谢树才，张剑权，蒋锡丽，周帅

中南大学湘雅医学院附属海口医院(海口市人民医院)，海南省海口市 570208

修回日期:2016-10-08 出版日期:2016-12-02 发布日期:2016-12-02
通讯作者: 张剑权，博士，主任医师，中南大学湘雅医学院附属海口医院(海口市人民医院)，海南省海口市 570208
作者简介:谢树才，男，1990年生，湖南省衡阳市人，汉族，在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞增殖及分化的相关研究。
基金资助:
海南省科技资助项目(ZDXM2015082)

Methods of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into hepatocytes and the underlying mechanisms

Xie Shu-cai, Zhang Jian-quan, Jiang Xi-li, Zhou Shuai

Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine (Haikou People’s Hospital), Haikou 570208, Hainan Province, China

Revised:2016-10-08 Online:2016-12-02 Published:2016-12-02
Contact: Zhang Jian-quan, M.D., Chief physician, Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine (Haikou People’s Hospital), Haikou 570208, Hainan Province, China
About author:Xie Shu-cai, Studying for master’s degree, Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine (Haikou People’s Hospital), Haikou 570208, Hainan Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Fund of Hainan Province, No. ZDXM2015082

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Notch信号通路：Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体，它们调节从海胆到人等多种生物细胞的发育。Notch信号影响细胞正常形态发生的多个过程，包括多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖及细胞边界的形成。Notch基因位点突变引起的表型改变，表明Notch信号作用的多样性。
miR-122：是一种专一表达于肝脏的miRNA，在生理状态下参与肝细胞发育、肝细胞表型、分化代谢，以及肝细胞应急应答等基本生命活动过程。在病理状态下，miR-122有促进HCV复制和翻译的作用，还可促进肿瘤细胞的凋亡，在肝细胞癌发生、发展过程中发挥抑癌基因样作用。

摘要
背景：已有多项研究证明骨髓间充质干细胞可以跨胚层分化为肝细胞，其向肝细胞定向诱导分化的方案很多，但其具体的分子机制目前尚不清楚。
目的：综述骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方案及分化机制。
方法：检索CNKI数据库、维普、万方和PubMed数据库2004至 2015 年期间关于骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的文章。检索词分别为“肝细胞(肝样细胞)，骨髓间充质干细胞，诱导分化”和“hepatocyte(-like) cells，bone marrow mesenchymal stem cells，differentiation”。最后选择62篇文章纳入结果分析。
结果与结论：骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方案很多，但其具体的分化机制仍不甚清楚，目前国内外研究较多的主要有Notch信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路、P38信号通路、miR-122及钙离子的影响等；骨髓间充质干细胞定向分化的成熟肝细胞为肝细胞移植和人工肝提供了理想的细胞来源，从而使肝细胞移植和人工肝运用于临床治疗终末期肝病提供了新的策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0513-4097(张剑权)

关键词: 干细胞, 分化, 骨髓间充质干细胞, 诱导分化, 肝细胞, 分化机制

Abstract:

BACKGROUND: A number of studies have shown that there are many inducible methods by which bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocytes, but the specific molecular mechanism is unclear yet.
OBJECTIVE: To review the programs and underlying mechanisms by which bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes.
METHODS: A computer-based online search of CNKI, VIP, WanFang and PubMed databases was performed to retrieve articles about directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes published between 2004 and 2015. The key words were “hepatocyte (-like) cells, bone marrow mesenchymal stem cells, differentiation” in Chinese and English, respectively. Finally, 62 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: There are many programs for hepatic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but the specific molecular mechanism is still unclear. Many studies mainly focus on Notch signaling pathway, Wnt/β-catenin signaling pathway, P38 signal pathway, miR-122 and effect of calcium ions. Bone marrow mesenchymal stem cells that can be induced to differentiate into mature hepatocytes provide an ideal cellular source for hepatocyte transplantation and artificial liver, which is proposed to be a new strategy for clinical treatment of end-stage liver disease.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

谢树才，张剑权，蒋锡丽，周帅. 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7586-7593.

Xie Shu-cai, Zhang Jian-quan, Jiang Xi-li, Zhou Shuai. Methods of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into hepatocytes and the underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7586-7593.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 骨髓间充质干细胞常用的分离方法主要有全骨髓贴壁分离法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法4种^[6-7]，4种方法的原理、优缺点见表1。荧光倒置显微镜下人骨髓间充质干细胞形态见图1。目前国内外大多采用的是全骨髓贴壁分离法联合密度梯度离心法。近来也有学者提出在全骨髓贴壁法的基础上进行优化^[8]，即在1.5 h收集未贴壁的细胞悬液重新接种，接种后12，24 h早期各换液1次，此法主要是利用细胞贴壁性能的差异，可以提高细胞的纯化率和减少混杂细胞的影响。

目前为止，尚未发现骨髓间充质干细胞特异的表面标志^[9]，一般采取阴性选择和阳性选择相结合的方式进行分离和鉴定。它不表达造血干细胞的表面标志^[9-10]，包括CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD11等，不表达共刺激分子CD40、CD80、CD86，不表达与人类白细胞抗原(HLA)识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子，也不表达CD31、CD18、CD56，低水平表达CD44、CDW90、CD11b、CD54、CD106(血管细胞黏附分子)，表达人白细胞抗原Ⅰ类分子(HLAⅠ)、Stro-1，高表达 CD29、CD44、CD49e、CD73(SH3/4)、CD105(SH2)、CD13、CD48、CD71、CD56、CD90、CD166。

2.2 肝(样)细胞的鉴定

2.2.1 细胞的形态 正常肝细胞光镜下为多边形或类圆形，呈典型上皮样细胞形态，并可融合成单层片状细胞，而未经诱导分化的骨髓间充质干细胞多表现为成纤维细胞样长条形或内皮细胞样梭形，贴壁较紧，在体外诱导后细胞形态逐渐由梭形或长条形转变为不规则圆形或类圆形，在透视电镜和扫描电镜下骨髓间充质干细胞具有幼稚细胞的结构特点，而肝样细胞的胞内细胞器明显增多，具有上皮样细胞的极性结构特点^[11]。

2.2.2 细胞功能和细胞标志物 白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白、糖原及尿素均为肝系细胞的特异性标志物。甲胎蛋白、细胞角蛋白19为不成熟肝细胞标志物，随着肝细胞的成熟少量表达甚至不表达，白蛋白和细胞角蛋白18是成熟肝细胞的标志^[12]。检测白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的存在可以支持骨髓间充质干细胞向肝系细胞的分化。肝脏是糖原合成与储存的主要场所，也是氨转化为尿素的惟一场所，因此检测胞内糖原的存在和尿素合成也能证明骨髓间充质干细胞成功诱导分化为肝细胞。成熟的肝细胞还表达一些酶类，如药物代谢酶细胞色素 P450(CYP450)、糖类代谢酶如6-磷酸葡萄糖磷酸酶(G6P)，还有氨基酸代谢的主要酶类，包括酪氨酸转氨酶(TAT)、丙氨酸转氨酶(AAT)、色氨酸2，3-双加氧酶(TDO)^[13]。

2.3 骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化常用的诱导方案

2.3.1 添加特定的细胞因子 在胚胎干细胞分化成熟肝细胞的发育过程中，体内多种细胞因子(如肝细胞生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、转化生长因子α等)参与了肝细胞的分化成熟，调控着肝细胞发育的各个阶段，在培养基中加入上述因子，就能促进骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化成熟。Wang等^[14]用肝细胞生长因子将大鼠骨髓间充质干细胞成功诱导分化为肝细胞样细胞；Ishikawa等^[15]观察到成纤维生长因子2能促进小鼠骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化并提高白蛋白的分泌；胡晶、王佐周等^[16-17]发现20 μg/L成纤维生长因子2比10 μg/L成纤维生长因子2更能诱导骨髓间充质干细胞表达白蛋白、细胞角蛋白19和合成糖原，进一步研究显示20 μg/L成纤维生长因子2比同样浓度的肝细胞生长因子具有更强的诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的能力。也有研究者发现联合添加上述因子其诱导效果可能更好。Ayatollahi等^[18]用肝细胞生长因子联合胰岛素样生长因子在体外将间充质干细胞诱导分化为肝样细胞，并检测出此肝样细胞拥有分泌白蛋白、尿素和储存糖原的功能。Sun等^[19]在培养基中加入肝细胞生长因子和成纤维生长因子4成功将骨髓间充质干细胞诱导成肝细胞样细胞，并表达甲胎蛋白、细胞角蛋白18、白蛋白；国内学者曹亮等^[20]发现肝细胞生长因子联合表皮生长因子比单用肝细胞生长因子和表皮生长因子时更能诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化。

2.3.2 运用损伤肝组织或血清 损伤的肝组织或血清可以分泌促进干细胞分化的生长因子，如肝细胞生长因子、白细胞介素2、转化生长因子β1，被认为是骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的良好条件。Saulnier等^[21]用射频消融损伤的肝脏血清成功将间充质干细胞诱导分化为肝细胞；范莎莎等^[22]发现肝纤维化大鼠血清中转化生长因子β1增加促使骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化。Avital等^[23]采用含瘀胆血清的培养液成功诱导出肝细胞表型的细胞，并观察到此细胞具有将氨代谢为尿素的功能；Zhong等^[24]研究发现5%瘀胆血清对骨髓间充质干细胞有一定的促增殖作用并能有效诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，联合使用肝细胞生长因子可以显著提高其分化率。

2.3.3 提供特殊的细胞外微环境 随着三维细胞培养技术的发展，越来越多的证据表明，三维细胞培养系统比传统二维培养系统更贴近体内的生理条件，能为干细胞的分化成熟提供理想的组织结构支持，促进生长因子和细胞外基质相互作用^[25]。Li等^[26]利用三维聚乳酸-乙醇酸支架动态培养大鼠骨髓间充质干细胞，结果提示三维支架培养较二维培养更能促进骨髓间充质干细胞向类肝细胞分化，表达更高水平的肝细胞功能。Piryaei等^[27]和Kazemnejad等^[28]分别利用不同结构的纳米三维支架成功将骨髓间充质干细胞体外诱导成类肝细胞。Lin等^[29]用三维藻酸盐支架诱导骨髓间充质干细胞成功分化为肝样细胞；Ji等^[30]研究发现动态培养肝支架具有诱导骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化的能力；联合生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化的程度显著高于单纯生长因子诱导。卫金花等^[31]在体外用胶原三维培养体系将骨髓间充质干细胞成功诱导分化为肝细胞并形成具有肝组织特征性的极化。也有学者利用生物活性材料仿生构建干细胞外微环境，调控干细胞增殖及其分化，徐建斌等^[32]研究发现人E-cadherin-Fc融合蛋白作为一种稳定的仿生细胞间相互作用的细胞外基质联合HGF/FGF/OMS/Dex等诱导因子共同作用下，可以有效促进人骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化。

2.3.4 细胞基因修饰 Ishii等^[33]通过四环素上调骨髓间充质干细胞中HNF-3β的表达，使得骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞内AFP、TAT和EpCAM的基因表达水平显著升高，并且超过80%的细胞分泌白蛋白。Chen等^[34]通过腺病毒载体将肝细胞生长因子导入骨髓间充质干细胞使其过表达肝细胞核因子4α(HNF-4α)，结果表明其能促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，国内学者利用gateway技术将肝细胞核因子4α导入人骨髓间充质干细胞也获得了同样的结果^[35]。陈丽、崔洁等^[36]通过转染pcDNA3.1(+)- hHGF上调肝细胞生长因子在人骨髓间充质干细胞中的表达，经酒精性肝硬化血清诱导可以促进骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。

2.3.5 中药诱导及其他诱导方法 Ouyang等^[37]用红景天苷成功诱导间充质干细胞定向分化为肝细胞，并认为ERK1/2或PI3K信号通路在此过程中发挥了重要作用；杜超等^[38]用红景天苷联合淤胆血清体外诱导培养骨髓间充质干细胞，发现红景天苷联合淤胆血清比传统的淤胆血清更能诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化。张玮等^[39]认为针刺穴位和筋膜可使大鼠血清细胞因子水平提高，从而促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化；韩海啸等^[40]用含调肝益气通络方的含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞，发现高剂量组显示出更优于肝细胞生长因子的诱导能力。Ping等^[41]用一贯煎可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞分化，并认为其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

2.4 骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的机制 已有各种不同的诱导分化方案被证实可以将骨髓间充质干细胞成功诱导分化为肝细胞，但是调控这一过程的分子机制目前还不甚清楚。大量学者认为，骨髓间充质干细胞向肝细胞的定向分化是基因部分被选择性地激活或差异性表达，从而控制某一些特异性蛋白合成和及其空间排布的结果。

2.4.1 Notch信号通路 Notch家族是由一组广泛分化且高度保守的蛋白质组成，通过蛋白质间相互作用或胞间的信息传递而实现基因转录的调控，已有研究显示Notch家族在干细胞的早期分化中发挥重要作用^[42]，且在肿瘤细胞的增殖分化中也同样起着重要的作用，当Notch信号通路持续异常存在时细胞不能正常分化就很可能形成肿瘤^[43]。徐洪雨等^[44]应用肝细胞生长因子联合成纤维生长因子4诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，结果发现第3天出现分化细胞，Notch-1蛋白表达开始降低，Notch-1 mRNA表达也随之减低，而且随着分化率的升高，Notch-1蛋白和Notch-1 mRNA表达都持续降低。Ke等^[45]认为Notch信号的下调在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中是必要的，并观察到第21天时Jagged2、Delta1、Delta3、Notch-1、Notch-2、Notch-3 及Presenilin1的mRNA表达量明显较第0，7，11天降低；柳柯等^[46]研究发现骨髓间充质干细胞向肝细胞分化第11天时，Jagged2、Delta1、Delta3、Notch-1、Notch-2、Notch-3 及Presenilin1的mRNA表达量降低至最低值；通过Jagged上调Notch信号通路则发现M2-PK和GST-P表达明显晚于对照组，而且至第26天都未表达白蛋白，都证明了下调Notch信号通路可以促进骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。

2.4.2 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin信号通路在肝细胞形成过程发挥了重要作用，Williams等^[47]阻断此通路结果是卵圆细胞未分化为肝细胞。平键等^[48]发现一贯煎可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞分化，其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。Ke等^[49]在骨髓间充质干细胞分化为肝细胞过程中观察到Wnt-1和Wnt-5α的mRNA水平显著低于第0，7，11天，并且发现用Dkk1抑制Wnt-1信号诱导骨髓间充质干细胞更早表达白蛋白，相反，上调 Wnt-1 信号抑制骨髓间充质干细胞分化为肝细胞，都证明了下调 Wnt/β-catenin 信号通路促进了骨髓间充质干细胞向肝细胞分化。也有研究者在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中发现Wnt/β-catenin 与TGF-β/Smad 信号通路通过β-catenin 存在交叉^[50]，Li等^[51]证实了下调转化生长因子β通路有可能促进骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化。

2.4.3 p38信号通路 Forte等^[52]发现肝细胞生长因子通过p38信号通路的参与促进间充质干细胞增殖，通过PI3K信号通路促进其迁移；Wang等^[53]研究证明转化生长因子通过MEK，p38，PI-3K信号通路刺激间充质干细胞产生肝细胞生长因子；杨超等^[54]通过加入p38信号转导通路抑制剂SB203580诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，与正常诱导组相比，其可以减少骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的比例，由此认为丝裂原激活蛋白酶p38在损伤肝脏条件培养液中诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞过程中起重要作用，其可能机制为p38是骨髓间充质干细胞产生肝细胞生长因子的重要通路，再由肝细胞生长因子刺激骨髓间充质干细胞分化为肝细胞。

2.4.4 miR-122及钙离子的影响 miR-122是成熟肝细胞特异性高表达的一种miRNA，在肝细胞生长、成熟、分化、调节细胞代谢过程中发挥了重要作用^[55]，Zeisel等^[56]研究发现miR-122在肝脏干细胞以及肝癌细胞等分化不成熟的细胞中低表达，当诱导分化为成熟细胞后，miR-122表达显著升高；Cui等^[57]发现7种异位表达的miRNA(miR-1246，miR-1290，miR-148a，miR-30a，miR-424，miR-542-5p，miR-122)过量表达可以促进间充质干细胞分化为成熟的肝细胞。Alizadeh等^[58]发现曲古霉素A可以促进脂肪来源间充质干细胞向肝样细胞分化并提高miR-122的表达水平，赵民学等^[59]研究表明上调miR-122表达水平能促进骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。

焦淑贤等^[60]用钙离子拮抗剂尼莫地平对诱导分化中的骨髓间充质干细胞进行干预，结果显示肝样分化细胞较对照组明显减少，提示Ca²⁺不仅参与了细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化过程，也影响了骨髓间充质干细胞的正常代谢，其可能的原因是骨髓间充质干细胞的分化受到基质金属蛋白酶及其抑制物的调节，而基质金属蛋白酶需要Ca²⁺金属离子作为辅助因子^[61-62]。

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骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法及机制研究与进展

Methods of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into hepatocytes and the underlying mechanisms

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