肿瘤干细胞表面标记物CD44在胃癌组织中的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
CD44蛋白：即白细胞分化抗原簇第44号，是定位于细胞膜表面的Ⅰ类跨膜糖蛋白，是由单一基因所编码的高度特异性单链膜表面糖蛋白家族，基因位于11号染色体短臂上，由20个高度保守的外显子组成，其与细胞的黏附、侵袭和转移有关。CD44的表达与胃癌恶性转化具有密切联系，在胃癌肿瘤组织中的表达越强，癌细胞的生存能力与肿瘤恶性程度越高，胃癌细胞更容易侵袭周围组织而发生转移，缩短患者的生存期，增加死亡率。
肿瘤标志物：也被称为肿瘤标记物，是肿瘤组织与细胞内因癌基因异常所产生的抗原、生物活性物质，或宿主对肿瘤刺激反应而产生的物质，其特征性存在于恶性肿瘤细胞中，很少发生在正常组织与良性病变组织，能够准确反映肿瘤发生过程中基因变化。

摘要
背景：研究表明，CD44的表达与胃癌恶性转化具有密切联系。
目的：分析肿瘤干细胞表面标志物CD44在胃癌组织中的表达及其临床意义。
方法：对92例胃癌患者的术后癌组织标本及30例经病理检查证实为正常胃组织标本进行免疫组化(S-P法)检测，比较两种组织中CD44蛋白的阳性表达率差异，并分析CD44表达与患者预后的关系。
结果与结论：①胃癌组CD44蛋白的阳性表达率(73%)显著高于正常组(3%)，差异有显著性意义(P < 0.05)；②胃癌组CD44蛋白的阳性表达率与患者的临床TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移有显著关系(P < 0.05)；③胃癌组CD44蛋白阳性表达患者3年存活率(37%)显著低于阴性表达患者(64%)，差异有显著性意义(P < 0.05)；④TNM分期越高、分化程度越低、淋巴结转移、CD44阳性表达是胃癌患者的独立危险因素(P < 0.05)，其异常持续性阳性表达可以在一定程度上提示胃癌患者预后不良。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1465-776X(张泽)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 标志物, CD44, 胃癌

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that CD44 expression is closely associated with malignant transformation of gastric cancer.
OBJECTIVE: To study the expression of CD44 in gastric cancer tissues and its clinical significance.
METHODS: Gastric cancer specimens from 94 cases of gastric cancer after surgery and normal gastric tissue specimens from 30 cases undergoing gastroscope examination were collected and detected using S-P method. The positive expression rate of CD44 protein in these two groups was compared, and the relationship between CD44 and prognosis was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The positive expression rate of CD44 protein in the gastric cancer group (73%) was significantly higher than that in the normal group (3%) (P < 0.05). The positive expression rate of CD44 protein in gastric cancer patients was remarkably associated with TNM stage, differentiation degree, invasion depth and lymph node metastasis (P < 0.05). The 3-year survival rate of gastric cancer patients positive for CD44 protein was significantly lower than that of negative patients (P < 0.05). The higher TNM staging indicated the lower differentiation degree, and lymph node metastasis and CD44 positive expression were independent risk factors (P < 0.05). To conclude, the expression of CD44 protein is related to the clinical pathological features and prognosis of gastric cancer patients to some extents.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stomach Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Antigens, CD44, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张泽，曾祥勇，段珊. 肿瘤干细胞表面标记物CD44在胃癌组织中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6760-6765.

Zhang Ze, Zeng Xiang-yong, Duan Shan. Expression of tumor stem cell surface marker CD44 in gastric cancer tissues and its significance[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6760-6765.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 组织学观察。

1.2 时间及地点 于2009年2月至2012年12月在海南省农垦总医院完成。

1.3 对象 选取92例胃癌患者术后癌组织标本及30例经病理检查证实为正常胃组织标本。胃癌组92例患者，男57例，女35例；年龄46-76岁，平均年龄(62.3±8.7)岁；采取全胃切除根治术25例、根治性远端胃大部切除术37例、根治性近端胃大部切除术30例；TNM分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期25例、Ⅲ期39例、Ⅳ期11例；Lauren分型：肠型60例、弥漫性32例。正常组30例，男18例，女12例；年龄42-75岁，平均年龄(60.1±9.0)岁。两组入选研究对象的年龄、性别构成差异无显著性意义(P > 0.05)。

纳入标准：①所有纳入对象均经过病理学检查证实确诊；②胃癌患者术前未接受放疗、化疗治疗；③入选研究对象具备完整的手术、检查及随访资料。

排除标准：①术后存活时间< 3个月的患者；②术前接受放疗、化疗的患者；③转移性胃癌患者；④合并其他部位重大疾病的患者。

1.4 主要试剂和仪器 牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、二甲苯、枸橼酸(上海前尘生物科技有限公司)；羊肿瘤干细胞表面标志物CD44抗体即单克隆抗体(南京凯基生物科技有限公司)；免疫组化试剂盒(江苏泰州生物科技制药公司)；链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体(南京凯基生物科技有限公司)；光学显微镜(深圳海量光有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 免疫组化检测方法 采用免疫组化链霉素抗生物素氧化蛋白-过氧化物酶连接法，以正常组织标本作为对照，石蜡块标本连续切片，切片厚度为4 μm，采用枸橼酸缓冲液进行抗原修复5-10 min，BSA蛋白封闭2 h，PBS洗涤3次，每次5 min，以0.01 mmol/L PBS作为替代一抗， DAB显色，苏木紫复染，树胶封固，镜下观察。

1.5.2 判断标准 CD44的阳性表达主要为细胞膜、细胞质出现黄色、棕黄色、褐色着色，采取半定量评分方法对结果进行评价：①根据着色强度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为褐色、黑色；②根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例< 10%为1分，阳性细胞所占比例11%-50%为2分，阳性细胞数51%-75%为3分，阳性细胞数所占比例>75%为4分，两种积分相乘总分≤3分为阴性、>3分为阳性。

1.6 主要观察指标 ①免疫组化检测CD44蛋白的阳性表达率；②CD44蛋白的阳性表达率与临床病理因素的相关性；③CD44蛋白的阳性表达率与患者3年生存率的关系；④影响胃癌患者的生存的相关性因素。

1.7 统计学分析 数据分析及统计用专业软件SAS 9.0软件包处理，计数资料采用百分率表示，组间比较采用卡方检验；生存影响因素分析采用Cox风险比例回归模型，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着人们生活水平的提高、膳食结构变化、营养过剩、活动量减少，胃癌的发病率逐渐升高^[7-8]。早期胃癌患者无明显外在症状，部分患者可能伴有胃息肉、慢性胃炎等癌前病变症状，当患者出现腹水、呕血、便黑、锁骨淋巴结肿大等明显胃癌症状时，患者疾病已步入中晚期，此时治疗难度极大，因此早期发现和治疗对胃癌的诊治至关重要^[9-10]。研究发现，胃癌的生长受多种基因、蛋白以及细胞因子共同调节，发病过程中涉及肿瘤细胞的黏附、降解以及增殖等多个环节，分子生物学研究发现，许多血清标志物即肿瘤标志物与肿瘤密切相关，并在肿瘤的早期诊断以及预后中发挥重要作用^[11-12]。

肿瘤标志物是肿瘤组织与细胞内癌基因异常所产生的抗原、生物活性物质，或宿主对肿瘤刺激反应而产生的物质，其特征性存在于恶性肿瘤细胞中，很少发生在正常组织与良性病变组织，能够准确反应肿瘤发生过程中基因变化^[13-14]。随着分子生物学发展，很多肿瘤标志物在肿瘤发展中的作用逐渐被发现，为治疗肿瘤开辟新的方向^[15-16]。恶性肿瘤干细胞为肿瘤生发、侵袭转移过程中的重要调控成分，近年来肿瘤微环境理论重点关注了肿瘤干细胞在调节肿瘤微环境、细胞间信号传递以及协助CD8⁺T淋巴细胞免疫监查过程中的作用^[17]。胃癌预后与癌组织局部侵袭、淋巴结转移以及TNM临床分期紧密相关，但对于胃肠道根治性术后远期临床效果的评估缺乏有效指标^[18]。部分学者认为肿瘤微环境中相关干细胞表面抗原转录翻译蛋白对于远期胃癌的预后具有一定的临床指导意义^[19-20]。流行病学显示，胃癌的发病机制与遗传、环境、幽门螺杆菌感染等因素相关^[21]，是多种基因共同作用的结果。早期诊断胃癌，对提高临床治疗效果、改善患者预后均具有重要作用。

CD44是一种恶性肿瘤干细胞表面标志物，属于跨膜糖蛋白，是由单一基因所编码的高度特异性单链膜表面糖蛋白家族，基因位于11号染色体短臂上，由20个高度保守的外显子组成，主要表达在上皮源性细胞与肿瘤细胞，为肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭与转移提供有效微环境^[22-23]。CD44同时作为细胞黏附分子，是透明质酸、层黏连蛋白受体，通过ankytin与骨架蛋白结合，参与细胞的迁徙运动，与肿瘤的侵袭及转移有关^[24]。近年来发现其在卵巢癌或者结肠癌上皮细胞膜上显著表达，CD44阳性表达促进了卵巢癌的腹腔内种植侵袭以及结肠癌的淋巴结转移，促进了远期不良预后的发生，但对于CD44蛋白在胃癌中的表达研究较少^[25]。作为一种特殊的肿瘤干细胞表面标记物，CD44可以通过自我更新与增殖促进胃癌组织细胞的生长，具有较强的迁徙与运动能力，促进胃癌肿瘤细胞的转移、浸润^[26]；在正常状态下还能够保持长期、稳定的休眠状态，具有高致瘤性与耐药性^[27]。正常状态下，CD44蛋白不会出现在健康机体的胃黏膜中，若检测出CD44的表达，则表示预后效果不佳^[28-29]，常利用其特异性分选干细胞，利于研究胃癌干细胞生物学特征、信号通路与耐药机制^[30]。试验结果显示胃癌组CD44蛋白的阳性表达率(73%)显著高于正常组(3%)，差异有显著性意义(P < 0.05)，这提示了CD44蛋白在胃癌中异常高表达，免疫组化结果分析可见CD44在胃癌组织中染色强度较深，并主要定位于胃癌细胞膜上，CD44参与了胃癌的发展过程^[31]。Lin等^[32]学者通过回顾性分析87例中晚期食管癌患者的临床资料，发生肺部转移的患者CD44阳性率增加了80%，并通过细胞实验证实CD44阳性细胞的侵袭能力更强。CD44作为一种透明质酸受体，其过度表达能够使得胃癌细胞牢固锚定于宿主细胞基底膜与细胞外间质，发生侵袭与转移，提升胃癌细胞周围透明质酸水平，促进细胞间质的高渗状态，破坏细胞外间质的致密结构，导致胃癌细胞向周围浸润^[33]。试验结果显示，胃癌组CD44蛋白的阳性表达率与患者临床TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移具有显著关系(P < 0.05)，且Ⅲ+Ⅳ期患者阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期患者，低分化患者阳性率显著高于高+中分化期患者，T3+T4期患者阳性率显著高于T1+T2期患者，发生淋巴结转移患者阳性率显著高于未发生淋巴结转移患者，差异有显著性意义 (P < 0.05)，提示了CD44参与到胃癌的转移侵袭过程，胃癌分型越晚、肿瘤较大同时伴有淋巴结转移的患者，其CD44表达水平越高。研究表明，癌组织侵袭黏膜下层时，CD44即可出现阳性表达^[34-35]，随着锁骨上淋巴结或者腋窝淋巴结的转移，CD44的阳性表达率呈现上升趋势。试验并未发现CD44的表达与淋巴结转移数量的关系，且未检测胃癌黏膜或者黏膜下组织中CD44表达，这是此研究不足之处。

试验并未发现Lauren分型对于CD44的差异性影响，考虑CD44的表达主要与细胞学异型性或者分化改变相关，而与大体标本或者肠道分型关系不大。胃癌组CD44蛋白阳性表达患者的3年存活率显著低于阴性表达患者，差异有显著性意义(P < 0.05)，这提示了CD44对于远期预后的判断价值，CD44阳性率的增加将降低患者术后3年的生存率。采用Cox比例回归风险模型对92例胃癌患者的3年生存影响因素进行分析，结果显示：TNM分期越高、分化程度越低、淋巴结转移、CD44阳性表达是胃癌患者的独立危险因素(P < 0.05)，这些均提示胃癌组织中的CD44表达与胃癌预后有关，可能成为检测胃癌患者病情以及评估胃癌患者预后的重要指标。然而需要注意的是，CD44蛋白包括标准型编码蛋白以及变异型CD44蛋白，两者在影响淋巴细胞归巢、AKT信号通路介导、调控EMT转移过程等方面的差异，是否会影响胃癌患者的临床特征或者远期预后，需要进一步探讨。

综上所述，CD44蛋白在胃癌组织中异常高表达，其阳性表达往往与胃癌的淋巴结转移、局部侵袭、远处转移有关，其异常持续性的阳性表达可以在一定程度上提示胃癌患者预后不良，并为靶向药物作用靶点的研究提供可靠参考。