磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.009

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (38): 5684-5690.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.009

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磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性

官晨雨，侯世达，周洋，曾融生

中山大学光华口腔医学院•附属口腔医院口腔颌面外科，广东省口腔医学重点实验室，广东省广州市 510055

收稿日期:2016-07-08 出版日期:2016-09-16 发布日期:2016-09-16
通讯作者: 曾融生，硕士，博士生导师，主任医师，中山大学附属口腔医院口腔颌面外科，广东省广州市 510055
作者简介:官晨雨，女，1989年生，福建省南平市人，汉族，中山大学在读硕士，主要从事口腔颌面外科学的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070818)

Biocompatibility of magnetic ferrosoferric oxide nanoparticles in preosteoblasts

Guan Chen-yu, Hou Shi-da, Zhou Yang，Zeng Rong-sheng

Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China

Received:2016-07-08 Online:2016-09-16 Published:2016-09-16
Contact: Zeng Rong-sheng, Master, Doctoral supervisor, Chief physician, Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China
About author:Guan Chen-yu, Studying for master’s degree, Guanghua School of Stomatology, Hospital of Stomatology, Sun Yat-sen University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology, Guangzhou 510055, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070818

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
磁性纳米颗粒：为一种纳米尺度的粒子，一般由铁、钴、镍等金属氧化物组成，具有别于一般纳米材料的特殊磁响应性，即在外加磁场作用下，可定向移动或吸收交变磁场电磁波产热等。近年来，由于其特殊的纳米特性及磁响应性，在医疗领域中，如MRI造影增强剂、磁感应热疗及基因转染等方面广为运用。
纳米毒性：纳米颗粒作用于机体或细胞后，影响机体器官及相关生理功能，在细胞层面，可引起细胞膜或细胞骨架结构损伤，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和或功能的紊乱，所引发的不良反应。

背景：将磁性纳米颗粒作为骨组织工程领域新兴材料并植入生物体时，其毒性机制基础研究及安全性评价就显得格外重要。
目的：探索磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性。
方法：将含有0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒的细胞培养液作用于小鼠前成骨细胞24 h后，采用碱性磷酸酶活性测试试剂盒、骨钙素酶联免疫试剂盒、CCK-8试剂盒、倒置显微镜、细胞骨架荧光染色法及实时荧光定量PCR，观察处理后小鼠前成骨细胞的碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度、细胞增殖率、细胞形态和骨架改变、细胞凋亡以及自噬相关半胱氨酸蛋白酶3、LC3A、LC3B基因mRNA表达情况。
结果与结论：①磁性四氧化三铁纳米颗粒作用小鼠前成骨细胞24 h后，200 mg/L组与对照组(0 mg/L)相比，各项指标差异无显著性意义；②作用24 h后，400，800 mg/L组细胞内碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度上升，细胞增殖率明显下降，细胞形态及骨架结构改变明显，LC3B基因转录水平升高，而半胱氨酸蛋白酶3、LC3A基因转录水平与对照组相比差异无显著性意义；③结果提示，高质量浓度的磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于小鼠前成骨细胞24 h后，虽具有一定的促成骨作用，但同时可造成细胞毒性损伤，促进细胞自噬相关基因LC3B表达上调，影响细胞形态、骨架结构及细胞增殖率。

ORCID: 0000-0002-5958-9505(官晨雨)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 磁性四氧化三铁纳米颗粒, 前成骨细胞, 生物材料与纳米技术, 生物相容性, 成骨分化, 矿化, 细胞毒性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Investigations on toxic mechanism and safety of magnetic ferrosoferric oxide (Fe3O4) nanoparticles are extremely necessary when these nanoparticles as an emerging material for bone tissue engineering are implanted into the living body.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of magnetic Fe3O4 nanoparticles with preosteoblasts.
METHODS: Mouse preosteoblasts were cultured in 0, 200, 400, 800 mg/L magnetic Fe3O4 nanoparticles. After 24 hours, alkaline phosphatase activity, osteocalcin level, cell proliferation rate, cellular morphology, cytoskeleton variation, cell apoptosis and autophagy-related genes, such as Caspase-3, LC3A, LC3B, were detected by alkaline phosphatase assay kit, ELISA kit, cell counting kit-8 kit, inverted microscope, laser confocal microscopy and real-time PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After 24 hours of culture, there ware no significant differences between 200 mg/L group and control group. However, in the groups of 400 and 800 mg/L, the ratio of alkaline phosphatase activity to total protein and osteocalcin level increased, the cell proliferation rate decreased, cellular morphology and cytoskeleton changed remarkably, LC3B expression was up-regulated compared with the control group. Additionally, there were also no significant differences in the expression of Caspase-3 and LC3A between 400 and 800 mg/L groups and control group. Therefore, magnetic Fe3O4 nanoparticles at high level contributes to cytotoxicity and up-regulation of LC3B expression, and affects cellular morphology, cytoskeleton and cell proliferation rate, although these nanoparticles can increase the osteoblastic differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Ferrosoferric Oxide, Nanocomposites, Osteoblasts, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

官晨雨，侯世达，周洋，曾融生. 磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5684-5690.

Guan Chen-yu, Hou Shi-da, Zhou Yang，Zeng Rong-sheng.

Biocompatibility of magnetic ferrosoferric oxide nanoparticles in preosteoblasts

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5684-5690.

图/表（结果） 8

2.1 细胞增殖率图1可知，随着材料质量浓度升高，细胞增殖率下降，其中200 mg/L磁性Fe₃O₄纳米颗粒组吸光度值为1.91±0.16，与对照组(0 mg/L)相比差异无显著性意义(P=0.600)，400 mg/L和800 mg/L磁性Fe₃O₄纳米颗粒组吸光度值明显减少，分别为1.57±0.05，1.31±0.14，细胞增殖率显著降低(P=0.001，P=0.000)。提示400 mg/L和800 mg/L磁性Fe₃O₄纳米颗粒可抑制细胞增殖。

2.2 碱性磷酸酶活性/总蛋白比值测试由图2可知，200 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于小鼠前成骨细胞后，碱性磷酸酶活性/总蛋白比值与对照组相比差异无显著性意义(P=0.065)。400 mg/L，800 mg/L组与对照组相比比值升高，差异有显著性意义(P=0.02，P=0.03)。

2.3 骨钙素水平测试磁性四氧化三铁纳米颗粒处理小鼠前成骨细胞24 h后，可见上清中骨钙素质量浓度在 200 mg/L组降低(P=0.08)，但差异无显著性意义，见图3。400 mg/L组升高(P=0.015)，而800 mg/L与对照组相比差异无显著性意义(P=0.316)。故此，可见400 mg/L磁性纳米四氧化三铁纳米颗粒在24 h时具有一定的促进骨钙素表达的作用。

2.4 细胞凋亡及自噬基因的表达量采用2^-^??Ct法将实时荧光定量 PCR结果进行分析，检测细胞凋亡及自噬基因的Caspase-3、LC3A及LC3B的mRNA相对表达量。结果提示，经不同质量浓度磁性四氧化三铁纳米颗粒处理后，小鼠前成骨细胞Caspase-3及LC3A基因表达量与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)(图4，5)，而 400 mg/L及800 mg/L组与对照组相比，LC3B基因表达升高，差异有显著性意义(P=0.025，P=0.028)(图6)。提示高质量浓度磁性四氧化三铁纳米颗粒对成骨细胞的相关功能损伤，可能借由细胞自噬方式产生。

2.5 细胞形态观察倒置显微镜下可见，随着磁性四氧化三铁纳米颗粒浓度增加，小鼠前成骨细胞形态发生改变，由纺锤形变为长梭形、不规则形，细胞内可见内吞的纳米颗粒，部分细胞呈黑色，细胞数量减少(图7)。

2.6 细胞骨架形态观察随着磁性四氧化三铁纳米颗粒浓度增加，小鼠前成骨细胞骨架发生改变，纺锤形、规则的细胞骨架结构，变为长梭形、不规则，细胞骨架结构排列紊乱，细胞缩小(图8)。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察体外细胞学实验。

1.2 时间及地点于2015年7月至2016年1月在中山大学附属光华口腔医学院研究所完成。

1.3 材料小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1 Subclone 14细胞株(北京协和细胞资源中心)。

主要试剂及仪器：100-300 nm磁性四氧化三铁纳米颗粒(阿拉丁，上海)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Biological Industries，以色列)；抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠(Sigma，美国)；碱性磷酸酶活性测试试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海)；BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所，上海)；骨钙素酶联免疫试剂盒(华美生物工程有限公司，武汉)；Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；PCR试剂盒(Roche，瑞士)；Actin-Tracker Green染液(碧云天生物技术研究所，上海)；细胞培养箱(Heraeus，德国)；超净工作台(Heraeus，德国)；激光共聚焦显微镜(Zeiss，德国)；LightCycler480(Roche，瑞士)；酶联免疫检测仪(TECAN，瑞士)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养按常规步骤复苏冻存的小鼠前成骨细胞株MC3T3-E1 Subclone 14，加入培养液(含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液)，反复吹打均匀后接种于25 cm培养瓶中，并放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，待细胞长满培养瓶约80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代，每二至三天换液。

1.4.2 细胞增殖率常规消化细胞，以2×10⁵个/孔细胞加入6孔板中。分别加入2.5 mL的0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒培养液。37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，每孔加入1 mL基础培养基和100 μL CCK-8试剂，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中放置30 min。吸取上清，加入24孔板中，测450 nm处样本吸光度(A)值。

1.4.3 碱性磷酸酶活性/总蛋白测试细胞以4.0×10⁵个/瓶接种于25 cm培养瓶。细胞贴壁培养后，实验组加入5 mL含0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒的成骨诱导培养液(50 mg/L 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松和10%胎牛血清的α-MEM培养基)。24 h后，各组细胞加入200 μL/瓶RIPA裂解液，冰上裂解30 min后，按照碱性磷酸酶试剂盒说明，测405 nm波长吸光度(A)值，并按BCA试剂盒说明，检测562 nm波长A值，通过标准曲线计算样本中细胞内碱性磷酸酶和总蛋白浓度，计算单位蛋白碱性磷酸酶活性。

1.4.4 骨钙素浓度测试细胞以4.0×10⁵个/瓶接种于25 cm培养瓶。细胞贴壁培养后，实验组加入5 mL含0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒的成骨诱导培养液，处理24 h后，收集上清，1 000 r/min离心，按照骨钙素免疫酶联试剂盒说明操作，测562 nm波长A值，通过标准曲线计算上清中骨钙素浓度。

1.4.5 RNA的提取和实时荧光定量PCR 按上述步骤接种和处理细胞，PBS洗3遍，加入Trizol反复吹打细胞，抽提总RNA。Nanodrop 2 000 c分光光度计检测总RNA浓度和纯度。根据反转录试剂盒提供的实验步骤，反转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，按照SYBR Green I Master说明书加入试剂并设置反应程序，进行PCR反应。引物序列见表1，数据采用2^-^??^Ct法进行分析。

1.4.6 细胞形态观察细胞以5×10³个/孔细胞加入6孔板中，待细胞贴壁后，分别含0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒培养液，培养24 h后，倒置荧光显微镜观察细胞形态。

1.4.7 细胞骨架形态观察细胞以5×10³个/孔细胞加入激光共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后，分别含0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒培养液，培养 24 h后，吸去培养液，PBS轻柔清洗3次，室温下40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3遍，0.1%Triton X-100透膜5 min，培养皿中滴加200 μL 1∶40 的Actin-Tracker Green染液，室温避光孵育30 min，0.1% Triton X-100的PBS洗3次，DAPI复染细胞核，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态。

1.5 主要观察指标检测经0，200，400，800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒培养液处理24 h，采用碱性磷酸酶活性测试试剂盒、骨钙素酶联免疫试剂盒、CCK-8试剂盒、倒置显微镜、细胞骨架荧光染色法检测处理后小鼠前成骨细胞细胞增殖率、碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度，荧光定量PCR检测细胞Caspase-3、LC3A及LC3B mRNA表达情况，观察细胞形态及细胞骨架的改变。

1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计学分析，实验数据采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

磁性纳米颗粒是一种纳米尺度的粒子，一般由铁、钴、镍等金属氧化物组成^[13]。具有别于一般纳米材料的特殊磁响应性，即在外加磁场作用下，可定向移动或吸收交变磁场电磁波产热等^[14]。由于钴、镍金属的毒性，限制了其在生物医疗领域的运用^[15]。而氧化铁类磁性纳米颗粒的低毒性及良好生物相容性，目前在磁性分离、磁转染、免疫分析、药物靶向治疗、肿瘤热疗、核磁共振成像等领域中广泛运用^[16-18]。

部分学者根据传统磁体材料的促成骨效应^[19-20]，尝试将磁性纳米颗粒合成纳米级磁性骨缺损修复材料，以期利用材料的磁感应及纳米特性，促进骨组织缺损修复。Meng等^[21]将MC3T3-E1细胞培养于含三氧化二铁纳米颗粒的纳米纤维复合材料，与不含三氧化二铁纳米纤维相比，细胞碱性磷酸酶分泌增高。文章将磁性四氧化三铁纳米颗粒单独作用于成骨细胞24 h后，200 mg/L组与0 mg/L组相比，成骨相关指标碱性磷酸酶/总蛋白比、骨钙素表达差异无显著性意义，然而在400 mg/L和800 mg/L组中，碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度升高，且差异有显著性意义(P < 0.05)，提示未加载磁场的400 mg/L磁性纳米颗粒可促进前成骨细胞向成骨细胞分化的相关因子表达，但目前尚缺乏文献对该材料引起的小鼠前成骨细胞成骨相关蛋白表达的升高的机制研究，仍需进一步探索。

然而，由于磁性纳米颗粒可通过巨胞饮和内吞作用进入胞内^[22-23]，加之其大表面积等特点，造福生物体的同时，也可带来潜在危害，使得对磁性纳米材料的生物安全性研究尤为重要^[24]。实验首先对该材料引起的细胞增殖率改变进行检测，发现高浓度组400 mg/L和 800 mg/L组小鼠前成骨细胞增殖率明显下降，且差异有显著性意义。提示当该材料浓度超过一定范围时，可抑制前成骨细胞的增殖活力。但细胞增殖率减低，是否与细胞成骨向分化相关，或是由于该材料毒性所引起，有待进深入研究。近些年来，随着生物材料的广泛运用，对于磁性纳米材料安全性已从简单的细胞数量、形态及分化的观察，深入为对遗传物质、相关功能蛋白表达及信号通路等分子水平方向上进行研究^[25]。实验中发现，将400 mg/L及800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒作用成骨细胞后，可引起细胞自噬相关基因LC3B表达上调。Zhang等^[26]研究中也发现100 mg/L磁性四氧化三铁纳颗粒作用3 h后，即出现LC3蛋白表达上升，p62表达下降。处理24 h后，Beclin-1和VPS34等细胞自噬相关蛋白也表达上升。Tian等^[27]研究中发现经20 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒处理48 h后，SMMC-7721细胞生存素、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-8蛋白表达与对照组差异无显著性意义。由于细胞自噬在代谢应激状态、重要生理过程以及细胞存亡发挥重要作用^[28]，一方面细胞自噬作为生物体应激适应机制，可促进细胞生存。另一方面，细胞自噬又可诱导非细胞凋亡的程序性细胞死亡，不依赖与Caspase的程序性细胞死亡^[29-30]。LC3自噬体的标记蛋白，参与自噬体的形成，并在自噬体膜的延伸过程中发挥重要作用^[31]。上述实验研究结果及本实验RT-PCR结果显示LC3B基因表达与对照组差异有显著性意义，推测小鼠前成骨细胞相关细胞因子表达的改变，细胞增殖率减低及细胞骨架形态改变，还可能与纳米材料介导细胞自噬作用有关。

实验中小鼠前成骨细胞经磁性四氧化三铁纳米颗粒处理后，细胞形态结构，以及细胞骨架免疫荧光染色后示，细胞形态结构改变，细胞由纺锤形变成长梭形、长条形，高浓度组时细胞数量明显减少，细胞变短，细胞骨架结构大部分破坏，细胞内可见内吞的纳米颗粒，并随着处理组浓度升高而增多。由于细胞骨架在维持细胞形态，物质运输、能量转化、细胞增殖及分化等生理活动中发挥重要作用^[32-33]。细胞骨架结构改变，可使相关的粒子通道和受体活性增加，借助第二信使，将刺激传递到细胞核，调节相关基因的表达^[34-37]。该实验中高浓度处理组的小鼠前成骨细胞增殖率降低，可能还与细胞骨架结构损伤的细胞毒性相关，而非单纯的细胞成骨向分化所致。Noel等^[38]在研究0-100 mg/L 20 nm金纳米颗粒对人中性粒细胞毒性时发现，金纳米颗粒可导致细胞骨架相关蛋白凝胶溶素、波形蛋白及核纤层蛋白B1表达改变。

此外，磁性纳米颗粒还可通过影响ATP酶活性、Ca²⁺离子浓度、细胞膜流动性、线粒体电位膜等损伤生物体^[38-39]。王晓娜等^[40]将1.07 g/L，0.535 g/L和 0.267 5 g/L的三氧化二铁纳米颗粒悬液染毒细胞， 24 h后处理组细胞膜Na⁺、K⁺-ATP酶、Ca²⁺、Mg²⁺-ATP酶活性以及细胞膜流动性随着染毒剂量升高而逐渐降低，可能与氧化损伤有关。陆敏玉等^[41]用0.694 g/L 的三氧化二铁纳米颗粒处理HepG2细胞后，细胞线粒体电位下降并具有时间依赖性。

综上所述，将磁性四氧化三铁纳米颗粒作为骨组织工程缺损修复支架材料时，由于材料存在可降解性，游离出的磁性四氧化三铁纳米可造成一定程度的细胞毒性损伤，其对机体危害的机制还需深入研究，以期为磁性纳米修复材料的安全运用提供基础研究支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性

Biocompatibility of magnetic ferrosoferric oxide nanoparticles in preosteoblasts

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