Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物在软骨损伤中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.007

摘要/Abstract

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文题释义：
水凝胶：是以水为分散介质的凝胶，具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物，是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。
Ⅱ型胶原水凝胶：呈现浑浊状，液体，番红O染色后，显微镜下水凝胶支架呈现出多孔网状结构，染色比较均匀，并且胶原蛋白纤维之间相互交联，纤维粗细也相对均匀，纤维中不同的空隙相互贯通，孔隙率较高。

背景：体外实验显示，Ⅱ型胶原能诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化，但有关Ⅱ型胶原水凝胶制备及其在软骨运动损伤中的修复尚缺乏报道。
目的：观察Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物在软骨损伤修复中的作用。
方法：取30只新西兰大白兔，建立软骨损伤模型，造模后随机分为2组，每组15只，实验组于软骨损伤处植入Ⅱ型胶原水凝胶-骨髓间充质干细胞复合物，对照组植入Ⅱ型胶原水凝胶。植入后4，8周，取材软骨损伤部位，进行苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色。
结果与结论：①实验组：植入后4周，苏木精-伊红染色结果可见炎性细胞浸润，以巨噬细胞为主，存在少量中性粒细胞；甲苯胺蓝染色未见阳性。植入后8周，苏木精-伊红染色下可见大量软骨细胞增殖，有成软骨和肌管形成，并且可见血管再生；甲苯胺蓝染色接近正常组织；②对照组：植入后4周，苏木精-伊红染色可见损伤周围间质水肿明显，损伤骨骼肌细胞核消失，存在大量炎性细胞浸润；甲苯胺蓝染色未见阳性。植入后8周，苏木精-伊红染色下可见少许成软骨细胞形成，纤维组织增多；甲苯胺蓝染色未见阳性；③结果表明：Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物修复软骨损伤具有良好的成软骨能力。

ORCID: 0000-0002-4607-5169(施翔)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 软骨损伤, Ⅱ型胶原水凝胶, 细胞复合物, 番红O染色, 骨髓间充质干细胞, 修复效果, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As the main component of articular cartilage, type II collagen can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into the cartilage. However, there is no uniform standard for the preparation of type II collagen hydrogel and its usage in the repair of sports-induced cartilage injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of type II collagen hydrogel-cell complexes in the repair of cartilage injury.
METHODS: After modeling, 30 New Zealand rabbits with cartilage injury were randomized into two groups (n=15 per group): type II collagen hydrogel-bone marrow mesenchymal stem cell complexes were implanted into the injured site of rabbits in experimental group, while only type II collagen hydrogel implanted in control group. Histomorphology observation was performed by hematoxylin-eosin and toluidine blue staining after 4 and 8 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: In the experimental group, there were inflammatory cells infiltrated at the injured site, most of which were macrophages and only a small amount of which were neutrophils under hematoxylin-eosin staining, at 4 weeks after implantation, while toluidine blue staining showed no positive. At 8 weeks after implantation, a large amount of chondrocytes proliferated at the injured site that was repaired by chondroblasts and myotubes as well as new vessels under hematoxylin-eosin staining, and toluidine blue staining showed the injured tissues were similar to normal tissues. In the control group, at 4 weeks after implantation, obvious interstitial edema existed, whereas skeletal muscle cells disappeared around the injured site, and a lot of inflammatory cells infiltrated. Several chondroblasts formed at 8 weeks, accompanied by increased fibrous tissues. Moreover, toluidine blue staining always showed no positive in the control group. To conclude, the type II collagen hydrogel-cell complex has better chondrogenic ability that can be used for cartilage repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen Type II, Hydrogel, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

施翔. Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物在软骨损伤中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5672-5677.

Shi Xiang.

Type II collagen hydrogel-cell complexes for cartilage injury

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5672-5677.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 30只造模新西兰大白兔全部进入结果分析。

2.2 水凝胶大体及组织学观察结果最初获得的Ⅱ型胶原蛋白为固体，白色粉末状；Ⅱ型胶原蛋白水凝胶则呈现浑浊状，液体，番红O染色后，显微镜下水凝胶支架呈现出多孔网状结构，染色比较均匀，并且胶原蛋白纤维之间相互交联，纤维粗细也相对均匀，纤维中不同的空隙相互贯通，孔隙率较高，见图3。

2.3 骨髓间充质干细胞形态观察结果培养24 h后，部分骨髓间充质干细胞贴壁生长，多数细胞呈现为椭圆形、纺锤形或多角形；传代二三代后细胞呈现梭形，体积较原代细胞大，呈现旋涡状且细胞排列具备一定的方向性，见图4。

2.4 Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物组织形态学观察结果苏木精-伊红染色下支架呈现粉红色，染色相对均匀，细胞在支架能稳定生长，甲苯胺蓝染色下可见淡蓝色的网状背景中存在较多紫色团状物，见图5。

2.5 术后兔大体情况手术后常规分笼饲养兔，术后第1天伤口出现轻度肿胀，无渗出，术后前3 d活动相对较少，术后伤口基本得到愈合，术后2周伤口痊愈，见图6。

2.6 两组兔组织学观察结果

实验组：注射后4周，苏木精-伊红染色结果可见炎性细胞浸润，以巨噬细胞为主，存在少量中性粒细胞；甲苯胺蓝染色未见阳性。注射后8周，苏木精-伊红染色下可见大量软骨细胞增殖，有软骨形成，并且可见血管再生；甲苯胺蓝染色接近正常组织，见图7。

对照组：注射后4周，苏木精-伊红染色可见损伤周围间质水肿明显，损伤软骨细胞核消失，存在大量炎性细胞浸润；甲苯胺蓝染色未见阳性。注射后8周，苏木精-伊红染色下可见少许软骨细胞及肌管形成，纤维组织增多；甲苯胺蓝染色未见阳性，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计动物对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1月至2016年1月在南京医科大学实验室完成。

1.3 材料 6-8周龄新西兰大白兔32只，体质量2.0- 2.5 kg，平均(2.2±0.1) kg，雌雄随机，由南京医科大学动物中心提供，根据相关标准对新西兰大兔进行饲养，合格证号为许可证号：合格证号为SCXK(苏)2007- 0010。对动物的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则。将其中30只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组，每组15只。

1.4 实验方法

Ⅱ型胶原水凝胶的制备：①原材料获取：利用10号手术刀片从新鲜猪(市售)双膝关节下收集透明软骨(股骨远端及髌骨关节面之间的关节软骨)，采用生理盐水进行冲洗，制成薄片，见图1。②Ⅱ型胶原蛋白制备：向原材料中加入200 mL浓度为4 mmol/L的盐酸胍(pH=7.5，0.05 mol/L Tris-NaCl配置)，制备混悬液，利用匀浆机进行粉碎，80目钢筛，12 000 r/min离心 30 min。将获得的沉淀物材料以0.05 mL缓冲液和 0.5 mol/L乙酸进行洗涤，加入5倍体积胃蛋白酶消化液，搅拌，12 000 r/min离心30 min。利用浓度为2 mol/L NaOH溶液调节上层血清，保证pH=7.3，加入NaCl盐析36 h。利用低温离心机在4 ℃下12 000 r/min30 min。利用超纯水透析袋透析48 h，6 h换液1次，获得Ⅱ型胶原蛋白。③水凝胶的制备：将获得的胶原蛋白溶解在 0.1 mol/L HCl中，获得Ⅱ型胶原水凝胶^[6]。

骨髓间充质干细胞的分离、培养：取2只新西兰大白兔，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，待麻醉成功后，消毒、铺巾，采用16号骨髓穿刺针传入髂嵴松质骨内，抽取10 mL骨髓，放入50 mL 离心管中，加入体积分数10%胎牛血清混合均匀。向混合液中加入1.073 g/mL 的Peercoll细胞，12 000 r/min离心30 min。取第2层白色云雾状有核细胞层，加入10 mL PBS，细胞捶打漂洗，1 500 r/min离心5 min，去除上层清夜，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打，制成细胞悬液。将细胞悬液以2×10⁶/cm²接种于培养瓶，在37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养四五天，以后每3 d换液1次，待细胞融合80%以上时进行传代培养，见图2^[8-9]。

Ⅱ型胶原蛋白水凝胶-细胞复合物制备：在无菌条件下，采用2 mol/L的NaOH调整Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的pH值，保证在7.0-7.4之间。将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶中，吹打、均匀，使得复合物的细胞浓度为10⁹ L^-1骨髓间充质干细胞，放置在4 ℃下备用^[10-11]。将MWCO 3 500的透析袋展开为单层，修剪成5 cm×5 cm大小，将扩散膜在超纯水中煮沸10 min，吸取0.6 mL复合物包裹在扩散膜中，4号手术丝线双重结扎制成囊袋状扩散盒，升高温度到37 ℃复合物成胶。

兔软骨损伤模型的制作及处理方法^[12-13]：将新西兰大兔进行简单的处理后，进行常规消毒铺巾，在膝髌旁内侧做一个长为5 cm纵形切口，逐层切口皮肤，利用眼科剪在缺损范围内做一个标记，采用小刮匙去除软骨，深度达到以不出血为宜，利用生理盐水对关节面进行冲洗，实验组在损伤部位注射1 mLⅡ型胶原蛋白水凝胶-细胞复合物，对照组注射1 mL Ⅱ型胶原水凝胶，保证其表面略低于周围软骨面。手术完毕后材料台灯在距离20 cm高度进行5-10 min照射，保证复合物成胶。手术完毕后逐层缝合，注射抗生素预防感染。

1.5 主要观察指标

水凝胶组织学观察：将获得的水凝胶凝化后放置在体积分数10%甲醛中固定12 h，脱水，常规包埋，苏木精染色3 min，水蒸馏水冲洗，0.1%番红O染色 3 min^[14]。

骨髓间充质干细胞的形态观察：利用倒置相差显微镜观察原代及传代二三代骨髓间充质干细胞的形态^[15]。

体内实验组织形态学观察：注射后4，8周，取材软骨损伤部位，每组处死2只动物，将获得的Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物放置在体积分数10%甲醛中固定12 h，脱水，常规包埋，进行苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色^[16]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行处理，计数资料采用n/%表示，行卡方检验，计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

软骨损伤的修复属于是一个相对复杂的过程，涉及的因素相对较多，并且伴有炎性组织愈合过程，该过程中还伴有中性粒细胞、巨噬细胞及肌纤维细胞的共同参与。目前国内外对于其修复方法尚缺乏统一的标准^[17]。

近年来，随着医疗技术的飞速发展，组织工程学、材料学等均得到突破性进展。自体软骨细胞作为最理性的种子细胞，在软骨缺损修复中已有多年历史，但该方法并未能在世界范围内得到实质性的突破。一方面，机体在选择自体软骨细胞时医疗费用相对较高，患者需要进行二次手术，麻醉风险也相对较高，治疗时间较长，多数患者治疗依从性较差；另一方面，自体软骨细胞获得途径相对有限，难以获得充足的细胞^[18-19]。因此，目前临床上对于软骨损伤的修复更多的集中在利用成体细胞——骨髓间充质干细胞作为种子细胞。相关研究显示，骨髓间充质干细胞属于目前最具前途的种子细胞之一^[20]。实验中制备的兔骨髓间充质干细胞，培养24 h后细胞部分贴壁生长，多数细胞呈现为椭圆形、纺锤形或多角形，传代二三代后细胞呈现梭形，体积较原代细胞大，呈现旋涡状且细胞排列具备一定的方向性。相关学者进行了一次实验，实验中报道了修复聚骨软骨病变的“一步技术”，它利用未培养的骨髓源性细胞作为种子细胞，但其配方法上需要进一步研究^[21]。

支架材料能为种子细胞提供生长所需要的营养，并直接参与细胞营养的提取、气体交换机生长代谢等。同时，将种子细胞黏附在支架材料上能不断产生新的细胞外基质，并且能随着机体组织的生长而发生降解，永久替代软组织。随着对支架研究的不断深入，人们对支架材料的认识有了一个更加全面的了解，并提出了更高的要求^[22-23]。实验中获得的Ⅱ型胶原水凝胶呈现浑浊状，液体，番红O染色后，显微镜下水凝胶支架呈现出多孔网状结构，染色比较均匀，并且胶原蛋白纤维之间相互交联，纤维粗细也相对均匀，纤维中不同的空隙相互贯通，孔隙率较高。胶原属于人体中含量最为丰富的蛋白之一，占人体蛋白总量的30%以上，且胶原蛋白主要有5种类型，即Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅺ型。而在人体关节软骨中主要以Ⅱ型胶原为主，占胶原总量的90%-95%。Ⅱ型胶原在维持关节软骨细胞外基质功能、结构完整等方面均发挥了重要作用，能赋予关节软骨独特的力学特性和生理功能。同时，Ⅱ型胶原具有良好的生物相容性，在机体内更容易被酶解，具有良好的降解性^[24-25]。此次研究中，将Ⅱ型胶原水凝胶与骨髓间充质干细胞复合，构建Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物。实验中，将获得的Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物支架进行体外培养，苏木精-伊红染色下支架呈现粉红色，染色相对均匀，细胞在支架能稳定生长，甲苯胺蓝染色下可见淡蓝色的网状背景中存在较多紫色团状物。

将Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物移植到软骨损伤中能取得理想的修复效果。实验中，术后第1天兔伤口出现轻度肿胀，无渗出，术后前3 d活动相对较少，术后2周伤口痊愈。Ⅱ型胶原水凝胶-细胞复合物植入机体后，关节腔的微环境更加有利于细胞的增殖、分化，进一步引起机械应力刺激，导致膝关节囊肿较低的氧分压和关节滑液中含有更多的营养物质，更加有利于损伤部位的恢复^[26]。实验中，对照组注射后4周甲苯胺蓝染色未见阳性；注射后8周纤维组织增多，甲苯胺蓝染色未见阳性。实验组注射后8周复合组与正常软骨高度保持整合，修复效果较好，甲苯胺蓝染色接近正常组织。Ⅱ型胶原水凝胶属于是一个三维支撑及培养系统，它更加有利于细胞-细胞、细胞-基质间的相互转化，该材料的置入能极大简化手术步骤，减轻机体创伤，并且水凝胶的高度水合三维结构更加有利于细胞发生迁移和新组织生长，促进机体早期恢复^[27]。

综上所述，以新鲜猪关节软骨为原料经一系列步骤分离、提纯Ⅱ型胶原蛋白水凝胶，分离培养兔骨髓间充质干细胞，并与Ⅱ型胶原蛋白水凝胶复合制备Ⅱ型胶原蛋白水凝胶-细胞复合物，将其运用于软骨损伤中具有良好的成软骨能力，能为后续临床应用提供依据。

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