膝关节炎软骨基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达与MRI表现的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
MRI：是磁共振成像，英文全称是：Magnetic Resonance Imaging。经常为人们所利用的原子核有： 1H、11B、13C、17O、19F、31P。在这项技术诞生之初曾被称为核磁共振成像，到了20世纪80年代初，作为医学新技术的NMR成像(NMR Imaging)一词越来越为公众所熟悉。随着大磁体的安装，有人开始担心字母“N”可能会对磁共振成像的发展产生负面影响。另外，“nuclear”一词还容易使医院工作人员对磁共振室产生另一个核医学科的联想。因此，为了突出这一检查技术不产生电离辐射的优点，同时与使用放射性元素的核医学相区别，放射学家和设备制造商均同意把“核磁共振成像术”简称为“磁共振成像(MRI)”。
基质金属蛋白酶：是一个大家族，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成，各种基质金属蛋白酶间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种基质金属蛋白酶可降解多种细胞外基质成分，而某一种细胞外基质成分又可被多种基质金属蛋白酶降解，但不同酶的降解效率可不同。

摘要
背景：研究表明，基质金属蛋白酶可降解关节骨与软骨中的胶原、明胶、弹性蛋白、蛋白多糖等细胞外基质大分子，破坏了细胞外基质产生与降解的平衡，是风湿性关节骨及软骨的破坏的重要原因。
目的：检测了兔膝关节炎软骨基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的表达，分析了两者与MRI表现的相关性。
方法：选取健康无骨关节炎表现的日本大耳白兔50 只，随机分为正常对照组10只和模型组40只。模型组采用前后交叉韧带切断术建立骨关节炎模型，分别在造模后第1，3，5与7周(各10只)，进行MRI检查和软骨基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达水平测定。
结果与结论：①MRI检查结果显示，骨关节炎模型兔的软骨破坏日趋明显，MRI分级差异显著(P < 0.05)；②模型组软骨基质金属蛋白酶2 与基质金属蛋白酶9 mRNA表达明显高于对照组(P < 0.05)，基质金属蛋白酶2表达水平在造模后第3周最高(P < 0.01)，随后2周略有下降，但仍显著高于对照组(P < 0.05)；基质金属蛋白酶9在第5周达到最高表达水平(P < 0.01)，第7周模型组基质金属蛋白酶9表达水平下降，但与对照组相比仍有显著性意义(P < 0.05)；③各组软骨损伤的MRI分级与基质金属蛋白酶2(R2=0.119，P=0.012)、基质金属蛋白酶9表达皆存在相关性(R2=0.466，P=0.037)。④结果说明，血清基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9水平与骨关节炎患者的病情活动及早期关节软骨破坏显著相关，可以作为早期骨关节炎患者的预测指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9732-4068(李光)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 膝关节炎, 基质金属蛋白酶2, 基质金属蛋白酶9, MRI, 相关性

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinases (MMPs) have been shown to break the balance between the production and degradation of extracellular matrix by degrading collagen, gelatin, elastin and other macromolecules, which is the leading cause of bone and cartilage damage in rheumatic arthritis.
OBJECTIVE: To determine the expression levels of MMP-2 and MM-9 in the rabbit knee osteoarthritis cartilage, and to analyze whether they are related to the early MRI performance.
METHODS: Fifty healthy Japanese white rabbits free from osteoarthritis were enrolled and randomly divided into control group (n=10) and model group (n=40). The anterior and posterior cruciate ligament amputation was adopted to establish the model of osteoarthritis. Subsequently, MRI examination and the expression levels of MMP-2 and MMP-9 were detected at 1, 3, 5 and 7 weeks (n=10 at each time point), respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: MRI examination showed that more damaged cartilage appeared with time in the rabbit model of osteoarthritis, and significantly different from MRI classification (P < 0.05). The expression levels of MMP-2 and MMP-9 mRNA in the model group were always significantly higher than those in the control group (P < 0.05); MMP-2 level reached the highest at 3 weeks after modeling (P < 0.01), and then presented a slight decline; MMP-9 level peaked at 5 weeks after modeling (P < 0.01) and slightly decreased at 7 weeks. MRI classification of cartage injury and expressions of MMP-2 (R2=0.119, P=0.119) and MMP-9 (R2= 0.466, P=0.466) were shown to have the correlation. These results illustrate that the serum levels of MMP-2 and MMP-9 are related to the early destruction of articular cartilage in patients with osteoarthritis, and can be used as predictors for early osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Matrix Metalloproteinase 2, Matrix Metalloproteinase 9, Magnetic Resonance Imaging, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李光，郭启发，黄宁庆，李凌伟. 膝关节炎软骨基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达与MRI表现的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(37): 5518-5523.

Li Guang, Guo Qi-fa, Huang Ning-qing, Li Ling-wei. Correlation of matrix metalloproteinase 2 and 9 with the early performance of knee osteoarthritis cartilage under MRI[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(37): 5518-5523.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析日本大耳白兔56只，分为5组，实验过程中6只造模失败，进入结果分析共50只。

2.2 MRI表现 MRI上的3D Wastsc序列观察结果显示，对照组兔膝关节软骨组织结构良好信号高且均匀。术后1周兔膝关节软骨表现为表面光滑，变薄，信号均匀。3周兔膝关节软骨表现为表面不光整，部分缺损，局部信号不均匀。5周兔膝关节软骨表现为明显变薄，软骨下骨质改变，内部信号不均匀。7周兔膝关节软骨表现为软骨变薄，软骨下骨质裸露，滑膜增厚，关节面模糊硬化，明显低信号。各组MRI分级见表1。

2.3 基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达变化荧光定量PCR结果显示，模型组兔软骨基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达显著高于对照组(P < 0.05)。第1周模型组兔软骨基质金属蛋白酶2表达水平即显著升高(P < 0.05)，在造模后第3周达到最高水平(P < 0.01)，随后2周略有下降，但仍显著高于对照组(P < 0.05)。第1，3周模型组兔软骨基质金属蛋白酶9 mRNA表达升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶9在第5周达到最高表达水平(P < 0.01)，第7周模型组基质金属蛋白酶9表达水平下降，但与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，图1。

2.4 MRI分级与基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9表达的相关性对MRI分级与基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达的相关性的分析显示，各组软骨损伤的MRI分级与基质金属蛋白酶2(R²=0.119，P=0.012)、基质金属蛋白酶9表达皆存在相关性(R²=0.466，P=0.037)。随软骨MRI分级的增加，基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达迅速升高，但随MRI分级的增加，软骨内基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达又有减少趋势(表3，图2)。

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引言

骨性关节炎也称为退行性骨关节病，是中国最常见的四大老年病之一，给老年人的生活带来了居多困扰。骨性关节炎的主要病理学变化为关节软骨不同程度变性或消失，并由此产生关节畸形、疼痛和功能障碍等临床症状^[1-2]。引发骨性关节炎的病因很多，如年龄、遗传、骨密度、激素水平、营养和关节损伤等因素都与其密切相关^[3-5]。近年来，有关骨性关节炎软骨变性机制成为了该领域研究的热点。有研究证实，细胞外基质参与组织的生长、细胞的增殖、分化、迁移与凋亡等，细胞外基质的生成与降解紊乱是造成骨性关节炎软骨变性的基本原因^[6-7]。

基质金属蛋白酶因富含金属离子锌与钙而得名，是一个在结构上具有高度同源性的内肽酶家族。目前，基质金属蛋白酶家族包括26个成员。根据同源性及其作用底物，将基质金属蛋白酶分为胶原酶(基质金属蛋白酶1，8，13)、明胶酶(基质金属蛋白酶2，9)、间质溶解素 (基质金属蛋白酶3，7，11)以及膜型基质金属蛋白酶4类^[8]。研究表明，基质金属蛋白酶1，2，3，9，13与骨性关节炎的形成有关^[9-10]。在细胞因子刺激下，滑膜细胞和血管内皮细胞等产生基质金属蛋白酶。这些基质金属蛋白酶可降解关节骨与软骨中的胶原、明胶、弹性蛋白、蛋白多糖等细胞外基质大分子，破坏了细胞外基质产生与降解的平衡，是风湿性关节骨及软骨的破坏的重要原因^[11-12]。Uchibori等^[13]对关节炎模型小鼠研究证明，基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9两者作用底物相似，在关节炎的发病中起一定作用。

MRI可用于测量软骨体积和厚度、滑膜炎、滑膜液渗出、骨髓病变和半月板损伤，可替代造影方法评价膝骨关节炎和结构变化，是早期诊断和评价骨性关节炎软骨损害的最佳方法^[3]。

实验采用前后交叉韧带切断术，建立骨性关节炎兔模型，观察软骨基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达并分析其与MRI表现的相关性，以阐明其在骨性关节炎发病中的作用，为临床治疗提供理论依据。

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材料方法

设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年9月在青海大学医学院分子生物学实验室完成。

1.3 材料

主要试剂与药物：RNA 提取试剂盒(Gibco 公司)；乌拉坦(上海浩然生物技术有限公司)；美洛西林钠(瑞阳制药有限公司)。

实验动物：健康日本大耳白兔56 只，雌雄不限，体质量(2.0±0.2) kg，由青海大学医学院提供。分笼饲养。饲养条件：温度20-25 ℃、相对湿度40%-50%，日光照12 h，自由采食。

1.4 方法

1.4.1 骨性关节炎动物模型的建立大耳白兔被随机分为2组，正常对照组10只和模型组46只。模型组，参照王栋栋与熊健斌^[14]的兔膝骨关节炎的造模方法建立骨性关节炎动物模型。20%乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉兔后，取其右侧膝关节脱毛、碘伏消毒后，取内侧髌旁入路，切断内侧副韧带，打开关节腔，剪断前后交叉韧带，同时去除内侧半月板，止血并缝合伤口。为防止伤口感染，使用美洛西林钠500 mg(1次/d)腹腔注射，连续3 d抗炎治疗。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.4.2 MRI检查对照组与模型成功的40只分别于1，3，5与7周进行MRI检查。使用Achieva Noval Dual1.5T双梯度超导型磁共振成像仪对软骨进行MRI检查，MRI图像进行评价按Mast等^[17]参考文献进行。

1.4.3 荧光定量PCR法基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA 表达采用反转录反应采用荧光定量PCR试剂盒(浙大生科公司)进行检测，引物由大连宝生物工程公司合成。

具体操作如下：①处死兔后，切开右膝关节前正中区滑膜组织，取出软骨组织并予以保存，用以检测基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达；②采用Trizol一步法RNA 提取试剂盒提取软骨组织总RNA；③PCR 扩增，5×PCR缓冲液10 μL，上下游引物各 16 pmol，Taq酶3 U，10 mmol/L dNTP 1 μL，cDNA 5 μL，荧光探针10 pmol，加双蒸水后总体积达50 μL，在ABI 7500 PCR仪进行扩增。循环条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，40个循环。

引物序列：
基质金属蛋白酶2：	上游：5’-ATG GCC AAG CCT AGA TCT G-3’ 下游：5’-GTG CAG CTC AGC TCG AGC ACA GCT GAG TTA C-3’
探针序列：	5’-TGT CTG AGG AGG TCG ACA ATG TCA G-3’
基质金属蛋白酶9：	上游：5’-TGA GTC GGG TAG ACA GTCC-3’ 下游：5’-CGA TAT GCT CGC GTA TCA CG-3’；3'
探针序列：	5’-TAA GGT GCG CTT ACT-3’

1.5 主要观察指标 ①各组兔软骨损伤的MRI分级； ②兔关节软骨基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0 软件包处理，数据以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验。采用Spearman方法进行变量间的相关性分析。P < 0.05 认为差异有显著性意义。

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讨论

骨性关节炎是一种以关节软骨丢失及骨质增生为特点的滑膜关节病，是老年人最常见的疾病^[15-16]。由于骨性关节炎病因和发病机制尚不清楚，临床上通常针对其症状进行治疗。目前尚缺乏特异性实验室检查来确诊骨性关节炎，影像学检查对本病的诊断十分重要。MRI是比较准确的诊断方法，可显示关节软骨、软组织、半月板等关节所有结构的病变，有利于骨性关节炎的早期诊断^[17]。研究中采用MRI对软骨进行了动态观测，并根据软骨组织和信号变化分级。研究显示以胶原结缔组织为主的细胞外基质降解及促进血管翳增生，最终导致软骨、韧带、骨的破坏，导致类风湿关节炎畸变。

研究发现，关节软骨基质胶原的损伤和破坏是骨性关节炎的主要病理症状，而基质金属蛋白酶对细胞外基质的降解能够促进血管翳增生，导致软骨、韧带、骨的破坏，在骨性关节炎发生、发展以及病理变化过程中起重要作用^[18-19]。

基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9是基质金属蛋白酶其中一大类，广泛存在于非感染正常结缔组织中，参与了细胞外基质降解、炎性反应与免疫应答等^[20]，对结缔组织的生理代谢具有重要意义^[21]。

2013年Ka?lina等^[22]证实，骨性关节炎患者的滑液及外周血中基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9水平增高，说明基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9在维持正常软骨代谢中有一定作用。另一研究证实，在正常关节软骨表层细胞中可见基质金属蛋白酶2弱阳性表达，胞质内可见少许棕褐色染色阳性颗粒。在中度和高度退变软骨中，基质金属蛋白酶2有阳性表达，提示基质金属蛋白酶2可能与软骨细胞坏死增多有关^[23]。

Uchibori等^[13]对关节炎模型小鼠研究也证明，小鼠脾组织中基质金属蛋白酶2 和基质金属蛋白酶9 的表达明显增加，而应用基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9的抑制剂可以阻止关节的破坏^[24-25]。

上述结果均说明基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 在关节炎的发病中起一定作用。作者此次实验同样证实，与对照组相比，骨性关节炎兔软骨基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达显著升高。第1周模型组兔软骨基质金属蛋白酶2表达水平明显上升，在术后第3周达到最高水平，随后2周略有下降。兔软骨基质金属蛋白酶9 mRNA表达升高，在第5周达到最高，第7周手表达水平下降。此外，研究还发现，基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达与MRI表现密切相关，进一步说明基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 在骨性关节炎发病中起一定作用。

综上所述，骨性关节炎兔软骨基质金属蛋白酶2与基质金属蛋白酶9 mRNA表达升高，且与MRI表现密切相关，说明基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 在骨性关节炎的发生、发展中起一定作用，但其具体机制尚需进一步探讨。

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