移植骨髓间充质干细胞肝癌大鼠细胞凋亡及炎症因子的动态变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
在损伤肝脏中骨髓间充质干细胞分泌的生物活性物质：移植的骨髓间充质干细胞可分泌多种生物活性因子作用于周围细胞发挥旁分泌作用，参与移植治疗后的免疫调节，调节炎症反应，促进细胞增殖，抑制功能细胞的凋亡，促进前体细胞的分化和增殖，并参与新生血管形成改善肝细胞的病理状态。
炎症因子与肿瘤：在炎症致癌的过程中，炎症因子主要通过改变细胞的生存微环境以及诱导细胞的致癌或抑癌基因的突变来起作用的。在免疫系统中，Kuppper细胞释放的炎症因子，如白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、趋化因子等均参与肿瘤的调节过程，因此检测体内炎症因子水平，可反映肿瘤发生发展情况。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞移植后对肝癌细胞凋亡及炎症因子的影响，尚没有详细的报道。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植后大鼠血清炎症因子水平及肝癌细胞凋亡情况。
方法：选取60只健康SD大鼠随机分为正常组、对照组及移植组，每组20只。对照组及移植组大鼠喂食普通饲料和二乙基亚硝胺溶液，以诱导大鼠肝癌模型，造模后移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞。移植2周后，采用ELISA检测血清CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平，RT-PCR检测肝组织HNF1α mRNA表达，免疫组化法检测肝组织Bcl-2、Bax表达，TUNEL技术检测肝癌细胞凋亡指数。
结果与结论：①对照组血清CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平明显高于正常组(P < 0.05)，移植组CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平较对照组明显下降(P < 0.05)，与正常组接近(P > 0.05)；②对照组肝组织HNF1α表达显著低于正常组(P < 0.05)，移植组HNF1α表达又明显上调，与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；③移植组肝组织Bcl-2表达较对照组明显下调，而Bax表达较对照组明显上调(P < 0.05)；④与对照组比较，移植组肝癌细胞凋亡指数明显上升(P < 0.05)；⑤结果表明，骨髓间充质干细胞移植有助于减少肝癌大鼠血清炎症水平、促进肝癌细胞凋亡，有利于肝细胞分化及再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5964-1791(张清琴)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 肝癌, 细胞, 凋亡指数, 炎症因子

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has not been thoroughly reported on its effects on apoptosis in hepatoma carcinoma cells and inflammatory factor level.
OBJECTIVE: To investigate the effect of rat bone marrow mesenchymal stem cells on dynamic change of inflammatory factors and cell apoptosis during hepatocarcinogenesis.
METHODS: Sixty healthy Sprague-Dawley rats were divided randomly into healthy group (n=30), control group (n=30) and transplantation group (n=30). Healthy group was given ordinary feed and normal water, while other groups were given diethylnitrosamine solution in drinking water to induce liver cancer models. Then, rats in the transplantation group were subjected to bone marrow mesenchymal stem cell transplantation via the tail vein. Two weeks after cell transplantation, CXCL5, interleukin-8 and interleukin-6 levels were tested by ELISA, mRNA level of hepatocyte nuclear factor 1α detected by RT-PCR, expression of Bcl-2 and Bax in liver tissue measured by immunohistochemical method, and liver cancer cell apoptosis index detected by TUNEL technique.
RESULTS AND CONCLUSION: After modeling, the expressions of CXCL5, interleukin-8 and interleukin-6 in the control group were significantly higher than those in the healthy group (P < 0.05), while these indexes were reduced significantly after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation (P < 0.05) and close to the normal levels (P > 0.05). Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation significantly up-regulated the mRNA level of hepatocyte nuclear factor 1α in the liver tissue that was decreased obviously after modeling (P < 0.05). In addition, the expression of Bcl-2 was reduced, while the expression of Bax and the apoptosis index increased significantly in the transplantation group compared with the control group (P < 0.05). These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation contributes to hepatocyte differentiation and regeneration in liver cancer rats by reducing serum inflammatory factor levels and promoting apoptosis in hepatoma carcinoma cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Liver Neoplasms, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张清琴，寇小格，崔艳慧，王荦楠，靳彩玲，陈美玲，李伟伟. 移植骨髓间充质干细胞肝癌大鼠细胞凋亡及炎症因子的动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5358-5363.

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年11月在河南医科大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 60只健康SD大鼠，体质量200 g左右，由河南医科大学第一医院动物实验室提供，随机分为正常组、对照组和移植组，每组20只，让其自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。实验过程中对动物处置符合《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 主要试剂、仪器 骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞冷冻液购自赛默飞公司；L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素(青霉素、链霉素)购自GIBCO公司；二乙基亚硝胺购自上海沪震实业有限公司；非生物素检测试剂盒和原位细胞凋亡检测均购于贝克曼库尔特公司；细胞培养皿、细胞培养瓶购于上海百研生物科技有限公司；二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司；紫外分光光度计购于上海奥析原。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养 小心取出已冻存的骨髓间充质干细胞(防止冷冻管爆裂)，放入37 ℃水浴，不间歇、轻轻摇动冷冻管，迫使其充分融化时间1 min，融解后，放置于无菌操作台，吸取解冻完成的细胞悬浮液，加至预先配置好的1︰10倍稀释的含胎牛血清与青霉素、链霉素混合抗生素的L-DMEM培养基，放置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱中^[21]，每2 d更换培养液，除去未贴壁细胞，至细胞融合85%时，去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基终止消化，用吸管吹打成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清非贴壁细胞，在新配置的无菌培养基中调节细胞浓度至5×10⁷ L^-¹，接种至培养瓶，培养于37 ℃、体积分数为5%CO₂的饱和湿度培养箱。第3代细胞供于以下实验^[22]。

1.4.2 肝癌建立及其分组 正常组大鼠喂食颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，对照组和移植组大鼠均喂食颗粒型普通大鼠饲料及体积分数为0.01%的二乙基亚硝胺(DEN)溶液1 mL/(10 g•d)，每周随机喂食二乙基亚硝胺溶液6 d，剩余1 d喂食消毒无菌水。依照此法喂养24周，前12周肝脏发生炎症反应，13-16周肝脏出现增生并纤维化，17-20周大鼠逐步形成肝硬化，21-24周肝脏癌变，肝癌模型建立^[23]。肝癌模型建立成功后，在24 h内向移植组大鼠尾静脉注射第3代骨髓间充质干细胞悬液10 μL，正常组和对照组大鼠尾静脉注射DMEM培养液10 μL。

1.4.3 ELISA检测血清CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平 骨髓间充质干细胞移植2周后，分别从3组大鼠中随机选取5只大鼠，腹腔麻醉，室温断头取血，1 000 r/min离心20 min，用移液枪吸取上清液，放置于酶标包被板上，10︰1的比例进行稀释，加于酶标板孔底部，不间歇摇晃均匀。用封板膜覆盖后，37 ℃恒温箱放置30 min。此时，稀释洗涤液30倍。去掉封板膜后，甩干，每孔加入洗涤液，静止1 min，甩干，多次重复洗涤。每孔加50 μL酶标试剂，37 ℃恒温箱放置30 min，多次洗涤，每孔分别加入显色剂A和B 50 μL，混匀，37 ℃暗室放置15 min，加入终止液50 μL。快速在分光光度计下测定450 nm波长下的吸光度值，并分别与CXCL5、白细胞介素8及白细胞介素6标准曲线进行比对。

1.4.4 RT-PCR检测HNF1α mRNA的表达 骨髓间充质干细胞移植2周后，分别从3组大鼠中随机选取5只大鼠，摘取已癌变的肝组织，加入含1 g/L亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。按Gbeo公司Trizol Total Isolation Reagent 说明书提取癌变的肝组织中总RNA，以mRNA为模板，参照说明书的反转录酶法反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。

HNF1α的引物序列分别为上游：5’-CAC AGT CTG CTG AGC ACA GA-3’，下游5’-TTG GTG GTG TCG GTG ATG AG-3’，产物298 bp；内参物GAPDH引物序列分别为上游：5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GTC-3’^[24]，下游为5’-AGC AGA GGG GGC AGA GAT GAT-3’，产物375 bp。

PCR反应条件为：95 ℃变性5 min，94 ℃ 45 s， 58 ℃退火45 s，72 ℃ 45 s，33个循环，72 ℃延伸10 min。

将PCR产物10 μL于2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带吸光度值，计算HNF1α吸光度与GAPDH吸光度的比值。

1.4.5 免疫组化法检测肝组织中Bcl-2、Bax水平变化 骨髓间充质干细胞移植2周后，应用二步免疫组织化学法检测肝脏组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达。分别从3组大鼠中随机选取5只大鼠，摘取已癌变的肝组织，切片，并将切片于室温下放置2 h，浸泡于二甲苯溶液中浸润15 min，更换新鲜二甲苯，继续浸泡 15 min，分别在无水乙醇、体积分数为95%乙醇、体积分数为90%乙醇、体积分数为80%乙醇、体积分数为70%乙醇溶液中放置 5 min，脱蜡水化，将组织切片放入微波中处理15 min，此时抗原得以修复，加入甲醇，灭活内源性过氧化氢酶的活性，加生物素标记二抗工作液，对组织切片进行苏木精染色^[25]，光学显微镜200倍视野下观察肝组织病变^[26]，随机挑选10个区域，要求每个区域有100个细胞计数。若肝脏组织中显现棕黄色颗粒者，则示为Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达细胞。利用组织切片扫描系统计算平均吸光度值。

1.4.6 采用TUNEL技术检测肝癌细胞凋亡指数 骨髓间充质干细胞移植2周后，分别从3组大鼠中随机选取5只大鼠，摘取已癌变的肝组织，切片，并将切片于室温下放置2 h，浸泡于二甲苯溶液中，浸润15 min，更换新鲜二甲苯，继续浸泡15 min，分别在无水乙醇、体积分数为95%乙醇、体积分数为90%乙醇、体积分数为80%乙醇、体积分数为70%乙醇溶液中放置5 min，脱蜡水化，加入高压氧使抗原得以修复，加入甲醛灭活内源性过氧化物酶。每张切片加入5 μL的TUNEL混合液，加入50 μL的POD转化剂，放置于37 ℃湿盒中30 min，PBS冲洗3次，每次5.0-6.0 min。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察，棕黄色为凋亡细胞核，深蓝色为未凋亡细胞核，肝组织的凋亡情况以凋亡指数表示。

1.5 主要观察指标 ①血清CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平；②肝组织HNF1α mRNA表达；③肝组织Bcl-2、Bax表达和肝癌细胞凋亡指数。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数之间采用t 检验方法，多组间的数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，应用SPSS 11.0软件进行数据分析。

讨论

实验成功建立大鼠肝癌模型后，移植骨髓间充质干细胞的肝癌大鼠血清炎症因子CXCL5、白细胞介素8、白细胞介素6水平明显低于未移植细胞的肝癌大鼠，且与正常组很接近。早有研究者已证实，肿瘤免疫主要是细胞免疫，而分泌炎症因子的巨噬细胞起到重要作用^[27-29]。

通过调控Kupffer细胞上的受体衔接蛋白，可以阻碍白细胞介素6的释放，降低血清中白细胞介素6水平，抑制了化学癌变的发生。Korkaya等^[30]研究发现，白细胞介素6可以调节肿瘤干细胞的扩增，阻断白细胞介素6受体可以抑制肿瘤的生长和转移。研究表明，通过调节白细胞介素6的信号通路诱导神经胶质瘤的产生及血管生成。骨髓间充质干细胞同样调节着肝脏的微环境，可以通过改变细胞分泌因子的生成，间接影响肿瘤的形成^[31-32]。此项实验结果与上述研究一致，炎症因子和骨髓间充质干细胞可以调控肿瘤细胞，肿瘤的发展变化与炎症因子和骨髓间充质干细胞移植有密切关系。

HNF1α是一种肝脏中基因的转录活化因子，白蛋白、抗胰蛋白酶等转录都需要HNF1α因子，HNF1α因子在肝脏、肾脏等器官中都有表达^[1]。移植2周后移植组大鼠肝组织HNF1α的表达明显高于对照组，这可能与HNF1α激活肝癌组织中的某些基因有关，而这些基因则调控着肝癌细胞^[1]。

Bcl-2和Bax是细胞凋亡的重要调控因子，在肿瘤细胞中表达增多，已有研究发现，Bcl-2表达增加和Bax表达降低，都可增强细胞的抑制作用，减弱了细胞程序性的坏死，增殖加快，肿瘤恶化。反之，则促进细胞进入停止增殖或者凋亡的周期，减弱了肿瘤增殖。此实验中，移植组的Bcl-2表达降低而Bax表达增加，因此，骨髓间充质干细胞移植可以调节细胞凋亡因子，减弱肝癌细胞的增生^[7]。骨髓间充质干细胞可影响肝癌细胞的增殖，但其具体机制尚不明确，有可能与其免疫抑制、细胞分泌因子有关^[33-34]，下一步将继续研究骨髓间充质干细胞对肝癌细胞的调节机制，希望可以寻求治疗肝癌的新方法。