1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在河北医科大学唐山临床医学院实验室完成。
1.3 材料 20只清洁级小型猪,雌雄各半,健康状况良好,体质量约30 kg,北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供,动物许可证号SCXK(京)2015-0002,小型猪饲养于河北医科大学唐山临床医学院实验室标准环境中。此次研究相关实验方案均提交河北医科大学唐山临床医学院医学伦理部门审核批准,符合相关伦理学要求。
聚左旋乳酸支架以及新型生物全降解支架均购自美国Vasotech Inc.公司。其中,聚左旋乳酸支架支架主要由可自然分解的材料为聚左旋乳酸制成,6-8个月开始降解,2年内完全消失。新型生物全降解支架的本体材料为支架采用高分子量左旋多聚乳糖和纳米无定型磷酸钙,具有良好的生物相容性,产品外观见图1。
新型纳米材料无定形磷酸钙药物支架体内研究使用的主要试剂与仪器:
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试剂与仪器
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来源
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氯吡格雷
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杭州赛诺菲圣德堡民生制药有限公司
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阿司匹林
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北京华禧联合科技发展有限公司
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肝素
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上海迈柏医药科技有限公司
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青霉素
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北京乐博生物科技有限公司
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C-反应蛋白免疫吸附试验试剂盒
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上海弘顺生物科技有限公司
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苏木精-伊红染色液
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上海美轩生物科技有限公司
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光学显微镜
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上海威奥生物科技有限公司
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计算机图像分析系统
(Image Pro Plus 6.0)
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美国Media Cybernetics公司
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1.4 方法
1.4.1 实验动物分组 将20只动物随机分为观察组和对照组,每组10只。
1.4.2 支架置入[7-8] 置入前2组动物均予以常规喂养,置入前5 d,给予口服氯吡格雷和阿司匹林。禁食12 h后,常规麻醉后对动物右侧股动脉予以逐层分离,参考文献置入6 F动脉鞘,并给予肝素6 000 U。行冠状动脉造影后,观察组和对照组小型猪分别在冠状动脉置入聚左旋乳酸支架以及新型生物全降解支架,置入后再次进行冠状动脉造影。
1.4.3 术后处理 置入后逐层缝合切口,给予氯吡格雷与阿司匹林,每日予以肌肉注射青霉素以抗感染。
1.4.4 血液学检测 置入前和置入后4周,分别收集两组动物的股动脉血,3 500 r/min离心10 min,利用免疫吸附法对血清中的C-反应蛋白水平进行检测[9]。
1.4.5 组织学检测 置入后4周麻醉后处死实验动物,即刻获得完整心脏组织,甲醛溶液固定。对支架置入部位血管予以分离,常规石蜡包埋后制备切片,二甲苯脱蜡,无水乙醇洗去二甲苯,梯度乙醇脱水后,苏木精染色5 min后,自来水洗涤,伊红染色,中性树胶封固,光学显微镜下观察[10]。
1.4.6 淋巴细胞数计数与炎症积分评分[11-12] 置入后4周,获得心脏组织标本进行淋巴细胞数计数与炎症积分评分,常规石蜡包埋切片,于400倍显微镜下进行淋巴细胞计数。
炎症积分评分标准:未出现内膜炎症计0分,存在散在炎性细胞计1分,25%-50%血管周径内支架存在炎症细胞包绕现象计2分,50%以上血管周径内支架存在炎症细胞全部包绕现象计3分。
1.4.7 内膜增生情况检测 利用Image Pro Plus 6.0对苏木精-伊红染色切片(×40)的内膜增生情况进行检测,包括新生内膜面积、管腔面积及面积狭窄百分比。
新生内膜面积=外弹力板围绕面积-残余管腔面积;
面积狭窄百分比=新生内膜面秽外弹力板围绕面 积×100% [13-14]。
1.5 结局观察指标 ①动物大体情况。②冠状动脉造影结果。③血液学检测结果。④组织学检测结果。⑤淋巴细胞数量、炎症及内膜增生情况。
1.6 统计学分析 利用SPSS 18.0软件进行统计学分析。数据以
x±
s表示,组间比较采用单因素方差分析,
P < 0.05为差异有显著性意义。