N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥的制备及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2294-2302.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.002

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N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥的制备及表征

姜磊，皮斌，冯焘，李斌，陆英杰，杨惠林，朱雪松

苏州大学附属第一医院骨外科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2016-03-07 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 朱雪松，硕士，苏州大学附属第一医院骨外科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006 杨惠林，博士，教授，苏州大学附属第一医院骨外科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:姜磊，男，1989年生，江苏省泰州市人，汉族，苏州大学在读硕士。并列第一作者：皮斌，博士，主治医师。
基金资助:
国家863计划(2015AA020316)；国家自然科学基金资助项目(81171689，81301559)；江苏省自然科学基金资助项目(SBK201341421)；江苏省普通高校研究生科研创新计划(CXZZ11-0123)

Calcium phosphate cement incorporated with N-acetylcysteine-loaded silk fibroin microspheres: preparation and characterization

Jiang Lei, Pi Bin, Feng Tao, Li Bin, Lu Ying-jie, Yang Hui-lin, Zhu Xue-song

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Orthopedic Institute of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2016-03-07 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: hu Xue-song, Master, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Orthopedic Institute of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Yang Hui-lin, M.D., Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Orthopedic Institute of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Jiang Lei, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Orthopedic Institute of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Pi Bin, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Orthopedic Institute of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Jiang Lei and Pi Bin contributed equally to this work.
Supported by:
the National High-Technology Development and Research Project of China (863 Project), No. 2015AA020316; the National Natural Science Foundation of China, No. 81171689, 81301559; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. SBK201341421; the Graduate Scientific Innovation Plan of Universities in Jiangsu Province, No. CXZZ11-0123

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

N-乙酰半胱氨酸：为谷胱甘肽前体，是一种含有巯基的化合物，具有抗氧化性，在临床上被广泛运用于呼吸道感染的祛痰药物，最新的研究表明，N-乙酰半胱氨酸在成骨诱导方面也有显著的成效。

丝素蛋白：结构与骨骼胶原相似，无明显抗原性，植入骨骼中不发生排异反应，具有良好的生物相容性，且有利于钙盐沉积。以往实验已经证实用丝素蛋白溶液作为磷酸钙骨水泥的固化液能够有效改善骨水泥的力学性能。用丝素蛋白制得的微球经过表面改性处理后载入药物，可具有控制药物释放、延长药物疗效的作用。

背景：磷酸钙骨水泥因其良好的生物相容性及骨传导性已被用于临床，但因其力学性能较差以及骨诱导性的欠缺限制了其广泛应用。
目的：制备复合N-乙酰半胱氨酸丝素微球的注射性磷酸钙骨水泥，构建一种具有药物缓释功能的新型注射性植骨材料，并评价其理化性能及细胞相容性。
方法：采用乳化溶剂蒸发法制备空丝素微球，用丝素微球吸附不同浓度N-乙酰半胱氨酸溶液，确定最大理论载药率时N-乙酰半胱氨酸浓度，再将载有N-乙酰半胱氨酸的丝素微球载入磷酸钙骨水泥中，检测负载N-乙酰半胱氨酸丝素微球的磷酸钙骨水泥的体外释药性能；体外将小鼠MC3T3-E1成骨细胞与N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥共培养，扫描电镜观察细胞在材料表面的贴附及生长。将单纯磷酸钙、丝素微球磷酸钙、N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥共3种骨水泥浸提液，以及含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基，与MC3T3-E1细胞共培养，对照组仅用上述培养基培养，采用MTS法评估各组细胞增殖情况。
结果与结论：①复合骨水泥中的微球表面光滑平整，大小基本均一，散在分布，球体未见明显破坏，可
见在制备复合骨水泥的过程中微球能保持稳定，不被破坏；②采用丝素微球、磷酸钙骨水泥作为药物双重缓释体系在前24 h累计释药百分比较对照组明显减少(P < 0.05)，后续28 d中N-乙酰半胱氨酸丝素微球磷酸钙骨水泥组释药速度也较单纯磷酸钙骨水泥显著降低(P < 0.05)；③实验中各组材料浸提液对MC3T3-E1细胞的生长均无明显影响，无明显细胞毒性；④结果说明：N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥材料具备良好的细胞相容性，有望为骨修复生物材料的研究提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID:0000-0003-4964-5574(朱雪松)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 丝素, 微球, N-乙酰半胱氨酸, 磷酸钙, 骨水泥, 药物缓释, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Calcium phosphate bone cement has been applied to clinical surgery because of its good biocompatibility and osteoconduction. However poor mechanical properties and lack of osteoinductivity limit its wide application.
OBJECTIVE: To develop calcium phosphate cement incorporated with N-acetylcysteine (NAC) loaded silk fibroin microspheres (SFM), which is a kind of new injectable bone graft material with slow-release function, and evaluate its physical and chemical properties and cell compatibility.
METHODS: Empty SFMs were prepared with emulsion solvent evaporation to absorb NAC solution of different concentrations by NAC-SFM and the concentration of NAC at the maximum drug loading ratio was determined. Then, NAC-SFM was loaded into calcium phosphate bone cement to test the drug release properties in vitro. MC3T3-E1 osteoblasts were cultured on the surface of NAC-SFM calcium phosphate bone cement and cell attachment and growth were observed by scanning electron microscope. Additionally, MC3T3-E1 cells were cultured with three kinds of bone cement extracts (calcium phosphate cement, SFM-calcium phosphate cement, NAC-SFM-calcium phosphate cement, as well as cultured in the α-minimum essential medium containing a volume fraction of 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin double antibody as the control. MTS assay was used to evaluate cell proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Microspheres in the composite bone cement presented with smooth surface, same size, diffused distribution and no obvious destroy. Thus, the SFM could remain stable in the reaction process of the composite bone cement. The double slow release system which contained silk fibroin microspheres and calcium phosphate bone cement showed a significant decrease in the cumulative release percentage of NAC within the first 24 hours compared with the control group (P < 0.05). In the next 28 days, the release speed of NAC was significantly lower in the NAC-SFM-calcium phosphate cement group than the calcium phosphate cement group (P < 0.05). In addition, different extracts had no significant cytotoxicity to the growth of MC3TC-E1 cells. Thus, the NAC-SFM-calcium phosphate cement has good cytocompatibility, which provide a new insight into the development of bone repair biomaterials.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Biocompatible Materials, Calcium Phosphates

姜磊，皮斌，冯焘，李斌，陆英杰，杨惠林，朱雪松. N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2294-2302.

Jiang Lei, Pi Bin, Feng Tao, Li Bin, Lu Ying-jie, Yang Hui-lin, Zhu Xue-song. Calcium phosphate cement incorporated with N-acetylcysteine-loaded silk fibroin microspheres: preparation and characterization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2294-2302.

图/表（结果） 9

2.1 丝素微球的粒径及形态电镜下观察丝素微球的形态及分布，6 000倍下见丝素微球大小较均一，分散均匀(图1A)，13 000倍下见球表面光滑平整无皱褶，无粘连(图1B)。粒径分布测试显示丝素微球的平均粒径集中在1-10 μm，平均粒径约3.2 μm，呈正态分布，较均匀(图1C)。

2.2 不同骨水泥XRD结果图2显示了NAC丝素微球磷酸钙骨水泥及单纯磷酸钙骨水泥的X线衍射图谱。曲线a在2θ=30.8°，32.75°，34.22°，46.78°等处均出现了羟基磷灰石的特征衍射峰，曲线b在2θ=30.67°，31.01°，34.28°，46.75°处出现了羟基磷灰石的特征衍射峰，这表明两组骨水泥固态组分在水化反应后的终产物大致相同，在加入丝素微球后，未产生其他晶体物。

2.3 丝素微球在复合骨水泥中稳定性扫描电镜显示水化反应后丝素微球在磷酸钙骨水泥中仍能保持原来的形貌，完整不受破坏，性状稳定(图3)。药物的缓释作用一方面是由于丝素微球吸水后体积明显增大，溶胀率达(145.6±2.41)%，小分子药物NAC可通过吸附作用包裹到微球内部及表面，当丝素微球与NAC质量比为1∶4时，理论载药率达(397.17±0.03)%，包封率达(99.29± 0.01)%，因此丝素微球可作为药物缓释的载体。

2.4 复合骨水泥力学抗压性能在单纯a-TCP中加入不同体积分数(0%，1%，2%，3%)的丝素微球(SFM)，体积分数0%作为对照组，观察随着加入微球含量的增加，复合骨水泥力学强度的变化。如图4所示，当微球含量为体积分数1%时，复合骨水泥的力学抗压强度达最大，各组间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 不同骨水泥抗溃散性各组骨水泥投入PBS中 10 min后基本完好，未出现明显溃散，24 h后见单纯磷酸钙与去离子水混合的骨水泥片出现明显溃散，其他3组固化液为丝素蛋白溶液的骨水泥片保持原来的形状，48 h后单纯磷酸钙与去离子水混合的骨水泥片溃散更加明显，周围出现散落的碎片，其他3组仍保持原型(图5)。实验证明了丝素蛋白溶液可以增强磷酸钙骨水泥的抗溃散性，同时丝素蛋白微球的加入对抗溃散性能未见明显影响。

2.6 不同骨水泥的凝固时间变化实验结果如图6所示，当去离子水作为固化液时，单纯磷酸钙骨水泥的初凝时间达(53.0±2.0) min，终凝时间达(63.0±1.0) min；当丝素蛋白溶液作为固化液时，单纯磷酸钙骨水泥的初凝与终凝时间明显缩短，初凝时间为(25.3±3.1) min，终凝时间为(37.7±2.5) min；加入丝素微球后凝固时间进一步缩短，初凝时间(20.7±1.5) min，终凝时间(29.3±1.5) min；加入NAC丝素微球后凝固时间较前无明显变化。

2.7 复合骨水泥NAC缓释性能 NAC丝素微球磷酸钙骨水泥对药物的缓释效果明显优于参照组(图7)，采用丝素微球、磷酸钙骨水泥作为药物双重缓释体系在前24 h累计释药(5.35±2.19)%，较对照组(13.45±1.04)%明显减少，在后来的28 d中实验组释药速度也较单纯磷酸钙骨水泥显著降低28 d时参照组累计释药(37.64± 1.73)%，实验组累计释药(18.99±0.92)%。实验表明丝素微球对NAC药物释放的调控作用显著，实验组在前24 h时并未出现明显突释，在后续4周的药物释放中，释药量平稳持续。

2.8 MTS检测细胞增殖情况 MTS结果显示，各组 A_{490 nm}值随培养天数的增加而增加，各组之间A_{490 nm}值差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。

2.9 材料表面MC3T3-E1细胞形态扫描电镜观察显示：磷酸钙骨水泥水化反应终产物羟基磷灰石为片层状排列(图9)，MC3T3-E1细胞在NAC丝素微球磷酸钙骨水泥表面贴附良好，细胞在材料表面伸出伪足，伸展充分，生长状态较好。

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引言

磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是一类新型的骨修复材料，其生物相容性和易塑形好，目前主要应用于人工骨、齿科修复及颌面重建材料等^[1]。磷酸钙骨水泥在植入时可随意塑形，固化后的终产物为羟基磷灰石，接近人体骨质的无机成分，材料表面与宿主组织发生化学键合，并逐渐被组织吸收和取代，因此这类材料具有良好的生物相容性^[2]；以磷酸钙骨水泥为载体的药物缓释体系能够达到修复骨缺损，并维持局部药物浓度的双重作用，从而达到综合治疗的效果^[3-5]。

丝素蛋白(silk fibroin，SF)的结构与骨骼胶原相似，无明显的抗原性，植入骨骼中不发生排异反应，具有良好的生物相容性，且有利于钙盐沉积^[6-7]。以往的实验已经证实用丝素蛋白溶液作为磷酸钙骨水泥的固化液能够有效改善骨水泥的力学性能^[8]。用丝素蛋白制得的微球经过表面改性处理后载入药物，可具有控制药物释放、延长药物疗效的作用^[9-10]。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)为谷胱甘肽的前体，是一种含有巯基的化合物，具有抗氧化性，在临床上被运用于呼吸道感染的祛痰药物，最新研究表明，NAC可调控成骨基因表达及激活成骨细胞，一定浓度的NAC可促进局部骨愈合^[11-12]。

此次实验借助丝素微球良好的载药特性^[13-14]，设想将丝素微球引入磷酸钙骨水泥复合体系，通过丝素微球和磷酸钙骨水泥的双重缓释作用^[15]，从而进一步使植入部位的药物NAC能够高效、持续释放，降低药物的不良反应，并达到修复骨缺损及局部药物治疗的目的。与此同时，实验对该复合骨水泥的理化性质及生物相容性进行了相对应的研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察实验。

1.2 时间及地点于2014年2至11月在苏州大学附属第一医院和苏州大学骨科研究所完成。

1.3 材料

丝素蛋白溶液：称取5 g生蚕丝(江苏南通如皋新丝路茧丝绸有限公司)放入2 L，100 ℃，0.02 mol/L的碳酸钠溶液中，每隔5 min用玻璃棒翻转使蚕丝均匀布开，30 min后取出，先用温水搓洗3遍，再用去离子水搓洗3遍以充分脱胶，后置入恒温烘箱中烘干，得到脱胶的丝素纤维。将丝素纤维放入9.3 mol/L的LiBr溶液(200 g/L)中，60 ℃恒温油浴中磁力搅拌4 h，得到棕黄色SF-LiBr混合溶液。将混合溶液置入透析袋中，两头扎紧，放在去离子水中透析3 d，定期换水，最后过滤得到丝素蛋白溶液。再将透析袋置入聚乙二醇粉末中浓缩12 h，将浓缩后的丝素溶液在4 ℃，离心半径13.5 cm，转速4 950 r/min离心1 h，取上清液保存于4 ℃冰箱中以备用^[16-17]。

丝素微球：采取乳化溶剂蒸发法制备丝素微球^[18]，在四口烧瓶中分别加入20 mL石蜡，200 μL Span80，用机械搅拌器以950 r/min的转速搅拌混匀，再逐滴加入400 μL体积分数8%的丝素蛋白溶液，毛玻璃塞塞上5 min，打开瓶塞继续搅拌1 h，所得悬浊液加入到50 mL离心管中，4 ℃，1 350 r/min离心5 min，取出后往里滴加2 mL无水乙醇，然后用石油醚、无水乙醇洗3遍，每洗完1次即刻离心，最后加入乙醇过夜，倒去乙醇，挥发剩余乙醇后室温下干燥后产物研磨成均匀的粉末，即得到丝素蛋白微球。

1.4 实验方法

1.4.1 丝素微球的粒径及形态观察将丝素微球粉末分散于蒸馏水中呈悬浮状态，用粒度分析仪(HELOS/ CUVETTE湿法粒度仪，德国新帕泰克有限公司)测定微球粒径大小。将微球粉末涂抹于样品台上的导电胶上，固定好后喷金，电压加到10 kV，用扫描电镜(SEM，FEI-Quanta 250)观察微球表面形态以及微球分散情况。

1.4.2 微球溶胀率测定采用微球的吸水能力RS表示微球的溶胀性能^[19]。将质量为m_D的微球置于PBS中室温4 h后取出，置于与水平面成60°的玻璃平板上，2 min后用吸水纸吸干多余水分，称量m_W，按下式计算R_S：R_S=[(m_W-m_D)/m_D]×100%。

1.4.3 载有NAC丝素微球的制备将丝素微球与NAC粉末(上海阿拉丁试剂有限公司)按照质量比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4混匀，加入到5 mL 的PBS中，24 h后吸取上清液样本，用酶标仪读取上清液样本中NAC含量，并计算测得丝素微球的理论载药率及包封率。

1.4.4 NAC丝素微球磷酸钙骨水泥的制备分别制备含有丝素微球体积分数为1%，2%，3%的磷酸钙(微米级α-磷酸三钙粉末，α-TCP，北京恩赛公司)混合粉末，加入无水乙醇搅拌均匀后室温挥发干燥，用玛瑙研钵研磨后备用。体积分数6%丝素溶液与混合骨水泥粉末按照固液比1∶0.4调制均匀后，填注于柱形模具内(高9.2 mm、直径4.6 mm)，将制得的样品放置于37 ℃，相对湿度100%的烘箱中，72 h后取出。

1.4.5 复合骨水泥的力学性能测定将每个骨水泥试件用砂纸打磨，使其表面尽可能平整光滑，每个数据按5个平行实验取平均值，以确定复合骨水泥获得最大抗压强度时各组分的最佳比例。将试件置于万能材料试验机(HY-1080，上海衡翼精密仪器有限公司)上进行最大抗压强度测定，载荷速度为0.5 mm/min，记录各样本的最大抗压强度。

1.4.6 X射线衍射分析(XRD) 根据骨水泥的抗压强度检测结果，检测丝素溶液体积分数为6%，微球为0.5%复合骨水泥及单纯磷酸钙骨水泥的晶体结构。骨水泥在烘干72 h后研磨成粉末，使用X射线多晶衍射仪(荷兰飞利浦公司)，在管电压40 kV，管电流40 mA，扫描速度为5 (°)/min，用超能探测器记录2θ=5°-60°时材料的X射线衍射强度曲线。

1.4.7 骨水泥的抗溃散性将单纯磷酸钙，丝素微球磷酸钙，NAC丝素微球磷酸钙分别与6%的丝素蛋白溶液混合(液固比0.4 mL/1 g)，单纯磷酸钙与去离子水混合(液固比0.4 mL/1 g)，将上述4组成分制成直径4.6 mm，厚3.0 mm的骨水泥片，然后迅速投入到PBS中，37 ℃恒温箱中静置，分别在10 min，24，48 h时从恒温箱中取出，观察表面溃散情况。

1.4.8 骨水泥的凝固时间将单纯磷酸钙，丝素微球磷酸钙，NAC丝素微球磷酸钙分别与6%的丝素蛋白溶液混合(液固比0.4 mL/1 g)；单纯磷酸钙与去离子水混合(液固比0.4 mL/1 g)调制均匀后填充于直径12.5 mm，高度5 mm的塑料模具中，于37 ℃，相对湿度100%的环境下测试4组成分骨水泥的凝固时间。每隔一段时间将各样品放置于维卡仪测试台上，分别用初凝试针和终凝试针垂直降落到样品表面，当试针插入试样距底板1.5 mm时，记为初凝时间。换用终凝试针，当试针在样品表面不能留下压痕时，记为终凝时间，每种样品平行试验3次。

1.4.9 NAC丝素微球磷酸钙骨水泥药物缓释性能将载有NAC的丝素微球按照质量比3%的比例混入磷酸钙骨水泥中，作为实验组；秤取相等质量的NAC，将其直接混入磷酸钙骨水泥中，作为对照组。将两组骨水泥样品分别置入5 mL PBS中，放置于37 ℃的恒温振荡箱中，在各个时间点吸取全部上清液，用酶标仪(美国BioTek公司)读取紫外波长(A_{405 nm})的吸光度值，补足5 mL PBS待下次取样，计算累积释放百分比。

1.4.10 MTS法检测细胞增殖培养MC3T3-E1细胞(中科院上海细胞库)所用培养液成分如下：

培养液成分：
组别	固体成分	液体成分	培养液
单纯磷酸钙骨水泥	α-TCP	丝素溶液	材料浸提液
丝素微球磷酸钙骨水泥	α-TCP/SF微球	丝素溶液	材料浸提液
NAC丝素微球磷酸钙骨水泥	α-TCP/NAC-SF微球	丝素溶液	材料浸提液
对照组	体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的 α-MEM培养基

按照ISO10993标准，材料表面积/液体体积= 3 cm²/mL的比例制备浸提液，将已消毒好的3组材料(单纯磷酸钙、丝素微球磷酸钙、NAC丝素微球磷酸钙骨水泥)置于6孔板内，按照3 cm²/mL的比例加入α-MEM培养基，在37 ℃条件下浸提72 h后取出即得到100%浸提液，将上述材料浸提液无菌封装后置于4 ℃冰箱中保存备用。将 MC3T3-E1细胞系用体积分数0.25%Trypsin- EDTA消化、计数，制成细胞浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种100 μL，培养24 h，待细胞贴壁后，按照实验分组换入相应材料浸提液(单纯磷酸钙、丝素微球磷酸钙、NAC丝素微球磷酸钙骨水泥的浸提液)及含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基，定期换液，并在1，3，5，7 d时用MTS法测得上清液的吸光度^[20-21]。

1.4.11 扫描电镜观察将NAC丝素微球磷酸钙骨水泥打磨成厚约1 mm的薄片并固定于样品台上喷金后，用扫描电镜(FEI-Quanta 250，美国FEI公司)在放大6 000及12 000倍时观察样品结构特征。将消毒后的材料放置于48孔板内，将MC3T3-E1细胞系用体积分数0.25% Trypsin-EDTA消化、制成细胞悬液，按照细胞数10 000/孔将细胞接种于材料表面，定时换液，培养72 h后用 40 g/L多聚甲醛溶液对细胞进行固定，乙醇梯度脱水，采用扫描电镜对材料表面的细胞超微形态进行观察。

1.5 主要观察指标 ①丝素微球的形态、粒径以及溶胀性能。②复合骨水泥的成分与结构、生物力学强度、抗溃散性及凝固时间。③NAC丝素微球磷酸钙骨水泥的药物缓释性能。④细胞增殖实验及电镜下观察细胞在材料表面的贴附情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间均数的差异比较采用单因素方差分析和LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 骨缺损的治疗过程中，延长药物治疗时间至关重要从临床角度看，骨质疏松性椎体压缩性骨折、骨缺损的治疗可在缺损部位填充一定的生物材料，填充材料需要具备一定的力学强度，较好的生物相容性，并具备一定成骨性能等特点^[22]，人工生物材料可携带促成骨因子，但这类材料往往因成骨因子在手术部位短时间内大量释放，使局部药物浓度升高，造成相关不良反应，亦可能抑制成骨^[23-24]。因此，如何使材料缓慢释药，与骨缺损的修复效果密切相关。

实验以传统磷酸钙骨水泥为基础，通过加入的丝素微球及磷酸钙骨水泥本身作为药物NAC的双重缓释系统，以丝素蛋白溶液作为固化液，克服磷酸钙骨水泥抗溃散性能差、凝固时间长等弱点，并可有效避免药物的突释，在局部维持一定药物浓度，有望改善现有骨缺损生物替代材料的不足，具有一定的研究意义。

3.2 丝素蛋白溶液及微球对复合骨水泥有加速水化反应进程、缓释药物的改性作用丝素蛋白是家蚕天然合成的结构蛋白，具有良好的生物相容性及相对稳定的理化性质，并且具有抗原性低，不会对周围组织产生炎症等特点^[25]，近年来大量研究表明，丝素蛋白可应用于皮肤、口腔黏膜等部位的修复^[26]。

实验将丝素蛋白分别作为磷酸钙骨水泥的固化液及具备高携药能力的载体，通过丝素蛋白分子链互相缠结，形成三维网络，羟基磷灰石在网络骨架上沉积，从而提高了磷酸钙骨水泥的抗溃散性能。此外，丝素蛋白高分子链网络，提供羟基磷灰石沉积的模板，也是加速水化反应进程，提高凝固效率，有效缩短磷酸钙骨水泥凝固时间的原因^[27]。另一方面，丝素蛋白微球作为药物的载体，自身具有良好的降解性和生物相容性。丝素蛋白结构中氨基酸的氨基可与NAC中的羧基发生作用，从而通过物理包裹及化学键结合控制药物释放^[28-29]，根据实验结果，进一步验证了丝素微球、磷酸钙骨水泥的双重缓释系统在药物缓释方面的优势。

3.3 复合骨水泥材料具有良好的生物相容性植骨材料在植入体内后，成骨细胞与材料表面接触，因此材料的生物相容性为生物材料的应用奠定了前提，实验利用小鼠成骨细胞系MC3T3-E1作为复合磷酸钙骨水泥生物相容性的检测细胞，在1，3，5，7 d通过MTS法检测细胞在材料表面的增殖状态来反应材料对骨细胞的生物相容性^[30]，结果表明4组材料表面细胞增殖数量均随时间推移而递增，且与对照组相比差异无显著性意义，这证实了细胞生长状态良好，反映了该复合骨水泥具有良好的生物相容性。

3.4 复合磷酸钙骨水泥具有广阔应用前景相比传统磷酸钙骨水泥，丝素蛋白的加入使得骨水泥的抗溃散性能及凝固时间有所改善^[31-39]。丝素蛋白微球作为药物NAC的载体，通过化学键结合及包裹的方式控制药物释放，有效控制了常见的药物突释效应，从而在骨组织修复治疗中起到维持治疗剂量的局部药物浓度，延长生物材料的药效，有利于骨组织的再生等作用^[40-41]。同时，该复合骨水泥材料具备良好的生物相容性，有望为植骨生物材料的研究提供新的参考。实验旨在研究具有双重缓释作用的磷酸钙骨水泥体系，对该复合骨水泥的体内外成骨性能仍需进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

N-乙酰半胱氨酸丝素微球复合磷酸钙骨水泥的制备及表征

Calcium phosphate cement incorporated with N-acetylcysteine-loaded silk fibroin microspheres: preparation and characterization

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