胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中及血管形成中的作用和机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞：首次在血液系统疾病中得到分离和鉴定，结果显示：多数实体肿瘤中均存在一类特殊的细胞，它们具备自我更新及自我分化能力，容易进一步促进肿瘤的发展。肿瘤干细胞在实体肿瘤，如：结肠癌、肝癌、胰腺癌中具备自我分化及更新能力，并且还具有高效DNA修复能力和多分化潜能。
血管生成：是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。

背景：肿瘤干细胞及其分化的血管细胞对于化疗、分子靶向治疗并不敏感，虽然能够减少肿瘤总体的血供，却助长了肿瘤的浸入及转移，成为治疗失败的主要机制。
目的：分析胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制及其在血管形成中的作用。
方法：取20株胃癌肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞，普通癌细胞培养条件为10%的PBS；肿瘤干细胞CSC-G培养条件为：DMEM/F12(1∶1)、B27(2%)、表皮生长因子(20 μg/L)。对2种细胞进行球形克隆形成试验、平板克隆试验以及Transwell 侵袭性实验，观察胃癌肿瘤干细胞的侵袭性；测定CD44、E-cadherin中mRNA水平及蛋白表达水平，观察细胞的转移能力；利用细胞划痕试验、Transwell 迁移实验和成环实验观察细胞的血管形成能力。
结果与结论：①普通癌细胞均贴壁生长，肿瘤干细胞CSC-G为悬浮生长，生长后显微镜下显示为梭形间质形态；②球形克隆形成试验结果：普通癌细胞瘤球数量显著少于肿瘤干细胞CSC-G(P < 0.05)；③平克隆试验结果：胃癌肿瘤干细胞瘤球数量显著多余普通胃癌细胞(P < 0.05)；④转移性试验结果：胃癌肿瘤干细胞穿过基底膜细胞数显著多于普通胃癌(P < 0.05)；⑤划痕试验结果：肿瘤干细胞CSC-G迁移距离、成环试验中成环数量显著多于普通胃癌细胞(P < 0.05)。⑥结果提示：胃癌肿瘤干细胞侵袭能力高于普通胃癌细胞，且胃癌干细胞迁移能力以及血管成形能力较强，它可以通过形成血管等途径来进一步促进胃癌的发生与发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0441-5887(黄辉)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌干细胞, 侵袭, 转移, 血管形成, 侵袭性实验, 球形克隆形成试验, 平板克隆试验, 转移能力

Abstract:

BACKGROUND: Although tumor stem cells and their differentiated vascular cells, which are not sensitive to chemotherapy and molecular targeted therapy, reduce overall blood supply of the tumor, these cells facilitate the invasion and metastasis of the tumor, eventually resulting in treatment failure.

OBJECTIVE: To investigate the effect of gastric cancer stem cells in stomach cancer invasion and metastasis as well as its mechanism in angiogenesis.

METHODS: A total of 20 gastric cancer stem cells and 20 normal gastric cancer cells SGC7901 were cultured in the medium with DMEM/F12 (1:1), 2% B27 and 20 μg/L epidermal growth factors or cultured in 10% PBS, respectively. Invasion of gastric cancer stem cells was detected by sphere formation assay, colony formation assay and Transwell invasion assay. Levels of mRNA and protein expression of CD44 and E-cadherin were measured to observe tumor metastasis. Besides, angiogenesis was observed by cell scratch test, Transwell migration assay and ring test.

RESULTS AND CONCLUSION: Gastric cancer cells adhered to the medium wall, and gastric cancer stem cells suspended in the medium, which appeared to be spindle interstitial form. Number of gastric cancer tumor spheres was significantly lower than that of gastric cancer stem cell spheres in the sphere formation assay and colony formation assay (P < 0.05). Number of gastric cancer stem cells through the basement membrane was significantly higher than that of gastric cancer cells (P < 0.05). And the cell migration distance and ring number were significantly increased in the gastric cancer stem cells as compared with the gastric cancer cells (P < 0.05). In conclusion, the invasion, migration and angiogenesis abilities of gastric cancer stem cells are stronger than those of gastric cancer cells, which can further promote the occurrence and progression of gastric cancer.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Stomach Neoplasms, Molecular Targeted Therapy, Neoplasm Metastasis, Tissue Engineering

黄辉，潘志坚. 胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中及血管形成中的作用和机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2021-2026.

Huang Hui, Pan Zhi-jian. Role and mechanism of gastric cancer stem cells in gastric cancer invasion, metastasis and angiogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2021-2026.

图/表（结果） 5

参考文献

引言

胃癌是临床上发病率较高的消化系统疾病，该疾病早期症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊已经是中晚期，错过了最佳治疗时机^[1]。肿瘤干细胞最早在血液系统疾病中成功分离和鉴定，并且在实体肿瘤，如：结肠癌、肝癌、胰腺癌中具备自我分化及更新能力，并且还具有高效DNA修复能力和多分化潜能^[2-3]。国内外研究显示：与胚胎干细胞一样，胃癌肿瘤干细胞也具有显著的分化潜能^[4-5]，在体外进行诱导、培养等能够形成更加复杂的三维腺体样结构及内皮样。

在肿瘤生成早期，细胞主要利用组织的渗透作用等获得营养物质维持其生长。随着瘤体的不断增大，单一的组织渗透无法给予充足的营养，肿瘤必须通过新生血管等为自身提供营养，促进肿瘤的进一步发展^[6-7]。因此，临床上研究肿瘤干细胞在血管形成中的作用具有重要的意义。普遍认为：胃癌血管在生产过程中主要参照Angiogenesis理论^[8-9]，从已有的毛细血管，根据“出芽”的方式形成新毛细血管网。研究显示：肿瘤血管形成还能够通过肿瘤干细胞分化获得血管内皮细胞^[10-11]。常规治疗药物虽然能够阻止肿瘤细胞获得充足的给养，但是却增加了肿瘤的进入，提高了肿瘤的复发及转移率^[12]。出现这种现象的原因是多方面的，最主要原因是由于肿瘤干细胞在分化过程中能够形成血管内皮细胞，从而能够联合抵抗治疗药物，导致患者治疗失败^[13-14]。因此，通过研究胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制及在血管形成中的作用能够为胃癌的分子靶向治疗提供依据^[15]。

文章选取华中科技大学同济医学院的20株胃癌肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞进行分析，探讨胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制，研究胃癌干细胞在血管形成中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验分析。

1.2 时间及地点于2013年1月至2015年10月华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院实验室完成。

1.3 材料人胃癌 SGC7901细胞株主要有华中科技大学同济医学院提供；胃癌肿瘤干细胞(Gastric cancer stem cells，CSC-G)主要由解放军第四军医大学附属肿瘤生物学国家重点实验室提供，实验经过医院相关伦理委员会批准同意。

胃癌干细胞侵袭转移实验用仪器和试剂：
仪器和试剂	来源
细胞培养箱(RC03000T-5V)，增强化学发光试剂盒(ECL)	美国Thermo公司
荧光定量 PCR 仪(Light cycler 480)	瑞士ROCHE
超声波细胞粉碎仪(UC130PB)	美国SONICS公司
电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9146A 型)	上海精宏实验设备有限公司
普通级胎牛血清	杭州四季青公司
PrimeScript RT-PCR Kit	大连Takara公司

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 ①将胃癌肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞从液氮罐中取出，放入含有体积分数10%FBS的RPM1640培养基中，在温度为 37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，每两三天换液1次，待细胞生长充满90%培养皿时，加入0.25%胰蛋白酶进行传代培养。②胃癌干细胞属于悬浮生长细胞，将其放入培养皿中，在温度为37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，加入无血清培养基[组成如下：DMEM/F12(1∶1)、B27(2%)、表皮细胞生长因子(20 μg/L)]，培养7-10 d进行扩增^[16-17]。
1.4.2 侵袭性实验 ①球形克隆形成试验。将肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞计数1×10³个接种在超低黏附6孔板中，加入无血清培养基[组成如下：DMEM/F12(1∶1)、B27(2%)、表皮细胞生长因子 (20 μg/L)]，在温度为37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，显微镜下观察瘤球形成情况^[18-19]。②平板克隆试验。将肿瘤干细胞CSC-G和普通胃癌细胞SGC7901细胞计数1×10³个接种在超低黏附6孔板中，加入放入含有体积分数10%FBS的RPMI1640培养基中，在温度为37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，每两三天换液1次，观察克隆形成情况^[20-21]。

1.4.3 转移性试验 Transwell迁移实验：让血清饥饿12-24 h，制备细胞悬液，避免血清对实验的影响。取24孔板，加入600 μL体积分数20%血清，将小室浸入孔中浸入湿润，让细胞充分消化，终止消化后计数细胞。选取2×10⁵细胞浓度，取200 μL放入细胞溶液到小室内，将24孔板放入在温度为37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，根据两种细胞迁移性不能计算不同时间段的透膜细胞数，擦拭内室细胞，在甲醛下进行 15 min固定，并放入1 mL结晶紫中进行15 min染色，观察透膜情况^[22-23]。

1.4.4 细胞的血管形成能力

细胞划痕试验：利用Maker笔在器皿中划5条划痕，接入5×10⁵个细胞，过夜后长满皿底。第2天，采用白色小枪头垂直在背后的横线划痕(避免枪头发生倾斜)，采用PBS进行3次冲洗，除去划下的细胞，进行培养，随机选取划痕後、24 h下采用倒置显微镜下记录观察^[24-25]。

成环试验：从-80 ℃冰箱中取出基质胶并放在4 ℃冰箱中过夜，使得基质胶充分融化。待完全融化后在紫外线下进行30 min消毒，并将基质胶和无血清基质根据1∶3比例进行稀释，植入96孔板中，每孔30 μL，混合均匀。将96孔板放入37 ℃温箱内进行半小时，烘干。取对数上长细胞，进行5 min离心，速度为500 r/min，取出培养基，调节细胞密度为2×10⁸ L，放入在温度为37 ℃、含有体积分数5%CO₂饱和湿度下进行培养，观察环数^[26-27]。
1.5 主要观察指标 ①肿瘤干细胞CSC-G细胞形态。②球形克隆形成试验结果。③平克隆试验结果。④转移性试验结果。⑤划痕实验结果。1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较两组数据间差异有显著性意义。

讨论

胃癌的研究经历了一个漫长的时期，并取得了相关研究新进展，但是医学界对于胃癌的发病机制尚不完全知晓。随着医疗技术的飞速发展，相关学者对肿瘤与干细胞间的关系、联系进行了大量的研究，为胃癌的靶向分子治疗等奠定了基础^[28-29]。肿瘤干细胞(Cancer stem cell，CSC)最早在2001年提出，Reya等对血液系统肿瘤及造血干细胞进行有关研究，后经美国癌症协会给予定义：肿瘤干细胞是一类特殊的细胞，具有自我更新及多项分化潜能，且在实体肿瘤中普遍存在^[30-31]。但是，对于肿瘤干细胞与胃癌细胞的侵袭、转移以及在血管形成中的作用尚缺乏报道。

目前，对于胃癌肿瘤干细胞的分离和鉴定缺乏有效的方法，其最重要的是确定细胞表面的标志物。有研究从AGS以及MKN45胃癌细胞中成功分离细胞表面标志物，且该类细胞中CD133水平显著较高^[32-33]。有实验在胃癌肿瘤干细胞中成功分选出CD44，结果显示肿瘤干细胞具备较强的至瘤能力。目前，将CD44、CD133、OCT4等作为胃癌干细胞的主要表面标志物，该类标志物的胃癌干细胞能够进一步提高胃癌复发、转移率^[34-35]。此次研究中，与 SGC7901相比CSC-G细胞中E-cadherin的表达水平下调。E-cadherin属于是相对比较重要的黏附分子，该物质表达水平出现下调或功能发生异常时，将会造成同种细胞失去黏附，对于胃癌肿瘤细胞而言，将会使得肿瘤细胞具备较高的侵袭能力，并且细胞容易发生脱落，向局部淋巴结或远处转移。由此看出：与普通癌细胞相比，胃癌干细胞具备更强的侵袭及转移能力^[36-37]。

研究显示：胃癌肿瘤干细胞与肿瘤血管生成之间存在紧密联系^[38]，该联系是造成常规治疗方法难以达到预期效果的主要原因。肿瘤血管的形成对于维持肿瘤的增殖、生长具有重要的意义，它能够进一步加速肿瘤的发展进程。与普通癌细胞相比，胃癌肿瘤干细胞具备更强的肿瘤发生、形成能力，该细胞能够进一步促进肿瘤血管的形成^[39]。胃癌肿瘤干细胞作用下，能够进一步促进血管生长因子，如：血管内皮生长因子、血管生成素等分泌、合成，通过调动巨噬细胞、淋巴细胞等促进血管生长因子的合成，在多种酶的催化作用下，肿瘤干细胞能够直接参与血管的形成。由此看出：与普通胃癌细胞相比，胃癌肿瘤干细胞迁移能力更强，能够直接参与血管形成，对胃癌的侵袭、转移等中发挥重要的作用^[40]。

综上所述，胃癌肿瘤干细胞侵袭能力高于普通胃癌细胞，且胃癌干细胞迁移能力以及血管成形能力较强，它可以通过形成血管等途径来进一步促进胃癌的发生与发展。研究胃癌干细胞在胃癌侵袭、转移中的机制及在血管形成中的作用能为胃癌治疗提供新思路，具有较高的临床研究价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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