经骨形态发生蛋白7成骨预处理聚乳酸三维支架的体外培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

骨形态发生蛋白7：骨形态发生蛋白是目前已知最有效的促骨生长因子，有学者认为骨形态发生蛋白7是促进和诱导成骨分化的重要的细胞外信号分子，在通路中发挥着启动和调节的作用。骨形态发生蛋白7存在浓度-效应钟型曲线，适当浓度范围才能最有效发挥作用，骨形态发生蛋白7的优势局限于较低的浓度范围5-100 µg/L。

聚乳酸：是一种新型的生物降解材料，使用可再生的植物资源(如玉米)所提出的淀粉原料制成，具有良好的组织相容性和优异的机械性能。聚乳酸已被广泛应用于生物医药领域，作为手术缝合线、骨固定植入物、药物控释载体和组织工程支架应用于临床。

背景：为改善聚乳酸的细胞亲和性，前期实验在其表面加入骨形态发生蛋白7功能基团，制备了经骨形态发生蛋白成骨预处理的聚乳酸三维支架。

目的：验证经骨形态发生蛋白成骨预处理聚乳酸三维支架与骨膜来源细胞的相容性。

方法：取传至3代后成骨诱导分化的人骨膜来源细胞，实验组以1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种于含聚乳酸支架的培养板内，聚乳酸支架预先经含骨形态发生蛋白7的成骨诱导培养液浸泡24 h；对照组直接以1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种于培养板内。培养后1，3，5，7，9，11 d，采用CCK-8法检测细胞增殖能力；培养后3，6，9，12 d，电镜下观察细胞-支架复合体。

结果与结论：①细胞增殖结果：两组细胞生长曲线均呈“S”型，实验组对数生长期细胞增殖较快，平稳期细胞数目明显下降，对照组平稳期细胞数目继续上升。②透射电镜观察结果：复合培养3-6 d时，支架表面细胞黏附数量逐渐增多，细胞生物状态良好，细胞器旺盛，至第9天，开始出现细胞老化及凋亡。③扫描电镜观察结果：复合培养3-9 d时，支架表面细胞黏附数量逐渐增多，增殖旺盛，至12 d时见凋亡细胞。④结果表明，经骨形态发生蛋白成骨预处理聚乳酸三维支架具有良好的细胞相容性，其与细胞复合培养1周为较佳的体外复合培养时间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-2511-2255(贝抗胜)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚乳酸, 骨形态发生蛋白7, 骨膜来源细胞, 细胞培养, 组织支架, 超微结构

Abstract:

BACKGROUND: To improve the cell affinity of polylactic acid, the three-dimensional polylactic acid scaffold is made after pretreatment with bone morphogenetic protein 7 (BMP7).
OBJECTIVE: To evaluate the compatibility of BMP7-pretreated three-dimensional polylactic acid scaffold with
periosteum-derived cells.
METHODS: Passage 3 human periosteum-derived cells undergoing osteogenic induction at a density of 1×109/L were seeded into culture media containing the three-dimensional polylactic acid scaffold (experimental group) or seeded into simple culture media (control group). In the experimental group, the scaffold was pretreated with BMP7 for 24 hours. At 1, 3, 5, 7, 9, 11 days after culture, cell counting kit-8 method was used to measure cellular proliferation; at 3, 6, 9, 12 days, the cell-scaffold complex was observed under an electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: In the two groups, the cells had an S-shaped growth curve. Compared with the control group, the cell proliferation in the experimental group was faster at the logarithmic phase, but slower at the stationary phase (P < 0.05). Under the transmission electron microscope, in the experimental group, the number of adherent cells was increased gradually, and the cells grew well with exuberant organelles at 3-6 days of co-culture, but cell aging and apoptosis were found at 9 days of co-culture. Under the scanning electron microscope, in the experimental group, the number of adherent cells on the scaffold surface gradually increased at 3-9 days of co-culture, and then cell apoptosis was notable at 12 days. These findings indicate that BMP7-pretreated three-dimensional polylactic acid scaffold has good cytocompatibility, and the optimal in vitro co-culture duration is 1 week.

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图/表（结果） 5

2.1 骨膜来源细胞培养与诱导结果经定向诱导培养后，相差显微镜观察下可见骨膜来源细胞增殖早期较快，细胞形态初始仍为长梭形，随时间延长逐渐变成多边形和三角形，与成骨细胞形态相似，并能增殖形成细胞集落^[5]。

成骨标志检测：随培养时间延长，两组碱性磷酸酶染色阳性率、茜素红钙结节染色阳性率逐渐增高，见图1。诱导组培养5，10，15 d细胞的碱性磷酸酶染色阳性率、茜素红钙结节染色阳性率显著高于未诱导组(P < 0.05)，见表1。

2.2 细胞增殖能力检测结果两组细胞生长曲线均呈“S”形，均在3 d进入对数生长期，实验组增殖较快；至7 d，实验组进入平稳期后出现细胞数目明显下降，而对照组细胞增殖则仍有上升，实验组培养3，5，7 d的增殖快于对照组(P < 0.05)，见图2。

2.3 透射电镜观察结果

实验组：培养3 d时，细胞突起黏附于聚乳酸支架壁，细胞核规则，类圆形，核仁少，胞质可见散在的线粒体、内质网、高尔基复合体，溶酶体相对较多；6 d时，细胞数目增多，排列紧密，细胞核呈分叶状，核仁多见，胞浆内细胞器丰富，大量线粒体，嵴少，电子密度高，Golgi复合体可见明显的扁平囊结构，周围多见小囊泡，粗面内质网末端膨大成池，少量溶酶体；9 d时，支架内细胞聚集成细胞簇团，细胞器丰富，功能状态良好，聚集区外周可见少量衰老和凋亡的细胞，胞体内出现空泡结构，线粒体肿胀变性，嵴消失，细胞核溶解；12 d时，衰老、凋亡的细胞数量增多，胞体内出现了大量空泡结构，可见到浓缩的细胞器，有些细胞完全崩解，见图3。

对照组：胞体呈棱形，膜面有很少量微绒毛状突起，棱呈梭状或杆状，偶见有分叶形，粗面内质网丰富、扩张、增粗，有大量异噬体等次级溶酶体，部分为类髓鞘样小体，线粒体体积较小，基质致密有少量嵴，高尔基氏体可见小囊泡，小脂滴偶见，细胞间基质致密，见图4。

2.4 扫描电镜观察结果复合培养初期所见细胞数量较少，贴附、伸展于聚乳酸生物支架，细胞形状多为梭形或三角形，略光滑，细胞突起较少；培养至第6天，细胞数量明显增多，形状多样，大量纤维样伪足黏附于支架并与其他细胞伪足交织成三维网状；9 d时，可见细胞聚集，周围有基质分泌；继续培养至12 d，可见凋亡的细胞，胞体变小，可见残余的伪足，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2012年11月至2013年10月在上海复旦大学生命学院遗传系公共实验室完成。

1.3 材料聚乳酸支架由济南岱钢公司生产，棒状，孔径200 μm，孔隙率90%，直径1 cm和0.5 cm。获取因外伤导致小腿截肢的人胫骨骨膜，实验已征得患者知情同意，仔细分离胫骨表面的肌肉及脂肪等软组织，用手术刀切取大约1 cm×1 cm的全层骨膜。

1.4 实验方法

骨膜来源细胞的体外培养：冲洗后，将骨膜组织剪成1 mm×1 mm小碎块，置入培养瓶内后，加入含1%青链霉素(上海复蒙基因生物科技有限公司)、体积分数10%胎牛血清(上海复蒙基因生物科技有限公司)的DMEM/F12完全培养基(Gibco公司)，在37 ℃、含体积分数5%CO₂的恒温培养箱(德国Heraeus，CELL24D型)中培养，两三天更换一次培养基，除去未贴壁的细胞。倒置相差显微镜(厦门Motic公司，AE-31型)下观察骨膜来源细胞融合至90%时，用0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)消化3-5 min后离心，弃上清，吹悬，按1∶3比例传代培养，传至3代用于实验。

骨膜来源细胞的定向诱导：将传至第3代的骨膜来源细胞制成浓度为1.0×10⁹ L^-1的细胞悬液，按2×10⁶/孔接种在有圆形盖玻片的24孔板中培养24 h，待细胞贴壁后，加入含地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸盐、β-甘油磷酸钠的成骨诱导培养剂(美国Cyagen公司)和40 µg/L骨形态发生蛋白7(美国Cyagen公司)，置入含体积分数5%CO₂的培养箱中37 ℃培养，每两三天换液1次，配成细胞浓度为1.0×10⁹ L^-1备用。

成骨指标检测：采用碱性磷酸酶染色及钙结节茜素红染色法检测诱导后细胞的成骨能力。将经过诱导的骨膜来源细胞(诱导组)和原代培养的第3代骨膜来源细胞(非诱导组)分别以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于6 孔细胞培养板中，培养至5，10，15 d分别行成骨细胞标志物碱性磷酸酶(碱性磷酸酶试剂盒法)及钙结节染色(茜素红染色法)检测。①碱性磷酸酶染色：取细胞爬片滴加固定液，室温固定3 min，水洗；滴加作用液数滴，玻片置湿盒内，加盖疏水膜，避光于37 ℃孵育15 min，水洗；趁湿滴加苏木精复染液数滴，复染3 min，水洗封固，镜检。阳性细胞核呈紫色，胞浆中出现蓝紫色颗粒。②茜素红染色：抽去培养液，加1 mL GENMED清理液清洗细胞表面；加2 mL GENMED固定液在室温下孵育10 min；加2 mL GENMED染色液室温孵育2 min，或自至可见桔红色后空气中晾干；加上2 mL GENMED脱水；加2 mL GENMED澄清液→2 mL GENMED透亮液(Reagent F)，覆盖整个生长表面；抽去GENMED透亮液后在光镜下观察。两组每张盖玻片分别随机取3个视野，采用网格计数法计算碱性磷酸酶和钙结节染色阳性率。

聚乳酸三维支架的准备及预处理：将直径聚乳酸支架切割成0.2 cm的圆柱体，紫外线下照射支架支架上下两面各2 h，乙醇浸泡2 h，蒸馏水反复冲洗后晾干；放置在含40 µg/L骨形态发生蛋白7的成骨诱导培养液内浸泡24 h；取出置于37 ℃培养箱过夜晾干，置入24孔培养板，放置无菌环境备用。

骨膜来源细胞与聚乳酸支架复合培养：实验组将经预处理的聚乳酸支架放置在24孔培养板的5孔内，用移液枪将细胞浓度为1.0×10⁹ L^-1的25 μL骨膜来源细胞悬液缓慢滴加于材料上，不使其溢出，静置10 min后翻转支架，再次滴入25 μL细胞悬液，放置培养箱中2-4 h，待细胞充分黏附于材料后，缓慢加入培养液约2 mL，置在于37 ℃、含体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱中，2 d换液1次。对照组直接将相同浓度、相同数量的骨膜来源细胞接种于普通培养板，在与实验组相同条件下培养。

1.5 主要观察指标

细胞增殖能力检测：在两组细胞培养的第1，3，5，7，9，11天，使用CCK-8试剂盒于各孔滴加20 μL CCK-8液(上海酶联生物公司)，并设置只有培养液没有细胞的空白对照组。在细胞培养箱孵育3 h后，将每组细胞上清液用移液枪转移至另一96孔板分成3等份，用酶标仪测定在450 nm处的吸光值，每组取其平均值，实验设平行实验组重复3次。

透射电镜观察：在培养的第3，6，9，12天，分别取出实验组支架复合体，切割组织块小于1 mm³。对照组按对数生长期取普通二维板内培养的细胞，消化收集后低速离心，令细胞沉于锥形离心管底部，吸除上清液。两组分别用戊二醛、锇酸固定，再用梯度乙醇(体积分数50%、70%、90%、95%、100%)脱水后行包埋、固化、超薄切片机切、3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色、透射电镜透射电镜(美国FEI公司，Tecnai G²20 ST)观察、拍片。

扫描电镜观察：复合培养至第3，6，9，12天后，取出实验组支架复合体，切割组织块小于1 cm³，固定后用梯度乙醇(体积分数50%、70%、90%、95%、100%)脱水，再真空干燥、喷金、扫描电镜(中科科技设备有限公司，KYKY-EM3900)下观察、拍片。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件包进行处理，所有计量资料采用x(_)±s表示，组间整体比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

理想的支架材料应具备以下特点^[8-10]：①良好的骨传导性和骨诱导性。骨诱导是指支架材料能诱导周围细胞或组织分化成骨，骨传导性则是细胞支架可以顺利的长入新生骨组织，完成爬行和替代。这两种性能是骨组织工程成骨的原理。②一定的孔径和孔隙率。不同的孔径及孔隙率对种子细胞的增殖、分化及远期构骨具有很大影响，目前认为孔径的大小要与细胞体积相似，成骨细胞迁移的最小孔径为100 μm；孔隙率应达到80%以上，较大的内表面积不但有利于细胞的种植黏附，还有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出，目前常用的支架孔径在100-300 μm范围内。③良好的生物可降解。理想的支架材料的降解速度应与成骨细胞构骨的速度同步，在骨组织形成过程中逐渐分解，不但可继续起到局部支撑作用，还不影响新形成的骨组织结构和功能。④良好的组织相容性和表面活性。不仅促进细胞的黏附，而且为细胞的生长、增殖和分泌基质提供了一个良好的环境。⑤一定的机械强度和可塑性：可根据骨缺损的位置及形状进行加工，而且在置入体内后的一定时间内仍可保持其形状，使新形成的组织具有原有或特定的外形。

目前常用的生物支架材料主要有^[11]：①无机高分子支架材料：生物活性陶瓷类，如轻基磷灰石、磷酸三钙。②天然衍生材料：包括胶原蛋白、纤维蛋白、生物衍生骨材料、脱钙骨基质、透明质酸及其衍生物等，甲壳素及其衍生物。③人工合成有机高分子材料：聚乳酸、聚经基乙酸及其共聚物。④复合支架：将两种或多种类型的材料组合，性能上取长补短，以得到更佳性能。聚乳酸具有良好的生物相容性和优异的机械性能，已被FDA批准在临床广泛使用^[12]。但聚乳酸的缺点是生物活性较差，接种种子细胞时与材料的黏附力较低，接种率不高。为弥补其缺陷，发挥优点，作者采用生物活性物质对其进行预处理。

骨形态发生蛋白是一种促骨生长因子，在体外对骨膜来源细胞增殖分化有促进作用。聚乳酸支架经含骨形态发生蛋白7的成骨诱导培养液浸泡，其原理是在材料表面通过蛋白质、多肽及生长因子等物质对支架进行简单的生物修饰，从而可以调节细胞黏附、分化和增殖能力^[13]。在材料表面改性和加入某些功能团，不仅使材料具有本身的物理机械性能，又增强了材料表面的组织和细胞相容性，更为关键的是可以诱导细胞更好的增殖和分化。本项目证实骨膜来源细胞与聚乳酸材料复合良好，其中材料表面改性及细胞因子的应用对于实验的成功起着不可或缺的作用。

除了支架材料表面的生物相容性，支架材料内部的孔隙、孔径等都可能影响成骨细胞的黏附、增殖甚至构骨。有研究表明，骨替代材料相互连通的孔隙是新骨形成的先决条件，而据文献[14]报道支架孔径在100-300 μm时比较有利于成骨细胞的长入，此孔径下作用于细胞机械刺激感受器的压力和张力比较适宜，过小的孔径支架内成分交换容易发生障碍，也不利于接种细胞的黏附及伸展、繁殖，而过大的孔径不利于细胞的三维伸展。支架的孔隙率相对于组织工程支架材料也十分关键，相关研究表明性能良好支架的孔隙率值大部分高于80%，适当的孔径和孔隙率对于细胞在支架材料内的生长发育至关重要^[15-16]。考虑细胞迁移的最小孔径为100 μm，实验的选择是200 μm，孔隙率90%，实验证实骨膜来源细胞在聚乳酸支架黏附增殖较为理想。

与骨源性细胞相比，骨膜来源细胞取材较简单，本身含有的成骨细胞更丰富，培养成活率更高，有较强的增殖传代能力和良好的多分化潜能。骨膜内含有多种细胞，包括骨祖细胞、成骨前体细胞、软骨前体细胞等，在一定条件下可定向分化为成骨细胞和软骨细胞，这种分化潜能随着年龄的增加并不会丧失，因此具有其自身应有的解剖特征和生物特性^[17]。应用骨膜细胞作为骨组织工程的种子细胞具有以下原因：①取材方便、来源广泛且对机体无损伤作用。②可在体外大量培养扩增。③在适当因子诱导下可向成骨方向分化。④比骨髓干细胞更容易取材。⑤细胞增殖比软骨细胞或成骨细胞更活跃，不受传代影响。⑥自体培养后移植可避免免疫排斥反应。

超微形态学观察显示，骨膜来源成骨细胞与经骨形态发生蛋白7成骨预处理的聚乳酸支架复合培养3 d，可见细胞贴附于支架，细胞呈梭形，较光滑，凸起较少，细胞核规则，核仁少见，细胞器较少，胞质疏松，散在少量的线粒体、内质网、高尔基复合体，可见有较多溶酶体。由于成骨细胞刚接种到聚乳酸支架处于一个相对静止期，此时细胞内细胞器相对较少；溶酶体较多可能是细胞刚到支架，生长方式由二维变为三维，并且支架有一定旳异物性，使细胞内部引起防御性反应。溶酶体的增多一方面可用于吞噬消化细胞外物质，另一方面溶酶体的白身物质消化作用可消化细胞内一些衰老的细胞器，是细胞内分解代谢的一种重要形式，并调整细胞的结构使其成分更新，更容易适应外界环境。第6天时，可见细胞数增多，细胞发出大量突起黏附于支架，并可见有丝状伪足在支架内交织成网状，胞体较大，核不规则，多分叶状，可见分裂的核仁，胞浆内细胞器明显增多，溶酶体数量较前减少。此时考虑细胞逐渐适应聚乳酸支架内部环境，细胞吞噬作用减弱，溶酶体减少，细胞在支架内呈立体生长。同时细胞进入对数生长期，细胞分裂、分泌功能较旺盛，大量粗面内质网、丰富高尔基体是细胞分泌功能旺盛的标志之一，说明细胞处于良好的功能状态^[18]。第9天时，细胞出现聚集，集结成细胞簇团，丝状伪足周围可见有基质分泌，聚集区细胞细胞器丰富，功能状态良好，聚集周围局部细胞出现了衰老和凋亡特征，线粒体肿胀，嵴消失，可见到部分老化甚至坏死的细胞肿胀，细胞核溶解，细胞仅余膜性结构。细胞聚集生长是成骨细胞构骨的特点，聚集区内营养物质相对充分，较适合细胞生长，聚集区外体外复合培养环境单一，缺少一些辅助生物因子，可能造成细胞的过早老化。第12天，透射电镜下可见明显凋亡、崩解的细胞，细胞内出现大量空泡样结构，细胞器浓缩，有些细胞完全崩解。考虑在常规的静态培养体系内由于种子细胞聚集生长，三维支架容易出现交换障碍，局部气体、营养成分和代谢废物扩散不均匀、聚积，局部pH值改变，导致生长迟缓、停滞甚至凋亡坏死的“空化”现象^[19]。

通过CCK-8法检测骨膜来源成骨细胞在聚乳酸支架的增殖能力，发现接种1 d后对照组值高于实验组，考虑与复合物接种中细胞流失有关，因对照组的细胞培养板接种贴附率高，细胞不易丢失，而实验组细胞接种的三维支架为多孔结构，孔隙率较大，孔径大于细胞，细胞容易流失到支架底部附着在培养板上，故支架内的细胞数量低。接种3-7 d后，实验组A值增长率高于对照组，说明实验组增殖能力大于对照组，三维空间相比二维空间更适合细胞的伸展和扩增。培养9 d后，对照组处于平稳期，细胞数目缓慢增加，而实验组细胞数量逐渐降低，此时考虑为支架内细胞聚集，内部环境改变不利于细胞的过度增殖，这与电镜观察结果一致。

上述形态学观察和增殖能力检测表明，骨膜来源细胞与经骨形态发生蛋白7成骨预处理的聚乳酸支架体外复合物培养1-7 d时，细胞生物状态好，细胞器旺盛，至第8天，开始出现细胞老化及凋亡。相关研究同样表明，静态培养过程中构建的组织工程骨中心部位容易出现供应受限，易于发生营养障碍^[20]。因此建议复合培养成功1周后应及时将其植入体内，在完善的成骨环境下进一步体内构骨。

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