晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (3): 324-329.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.004

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晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损

周朝玺¹，崔旭²，敖国昆²，许韬韬³，翁杰³，肖占文⁴，张兴栋⁴，张聪²

¹河北北方学院，河北省张家口市 075000；²解放军第309医院，北京市 100091；³西南交通大学材料学院，材料先进技术教育部重点实验室，四川省成都市 610000；⁴四川大学生物材料工程研究中心，四川省成都市 610000

收稿日期:2015-11-24 出版日期:2016-01-15 发布日期:2016-01-15
通讯作者: 张聪，主任医师，解放军第309医院，北京市 100091
作者简介:周朝玺，男，1990年生，河南省平顶山市人，汉族，河北北方学院在读硕士，主要从事生物活性人工骨材料的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81190131)；国家科技支撑计划课题(2012BAI17B01)

Wisker-covered porous calcium phosphate ceramics in repair of canine femoral condyle defects

Zhou Chao-xi¹, Cui Xu², Ao Guo-kun², Xu Tao-tao³, Weng Jie³, Xiao Zhan-wen⁴, Zhang Xing-dong⁴, Zhang Cong²

¹Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China;²the 309^thHospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China; ³the Key Laboratory of Advanced Technology for Materials of Ministry of Education, School of Materials, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; ⁴Engineering Research Center in Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2015-11-24 Online:2016-01-15 Published:2016-01-15
Contact: Zhang Cong, Chief physician, the 309th Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China
About author:Zhou Chao-xi, Studying for master’s degree, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81190131; the National Key Technology Support Program, No.2012BAI17B01

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

陶瓷晶须：是以特种陶瓷原料为原料制造的晶须有单晶体纤维和多晶纤维。有氧化铝、碳化硅、碳化硼、二氧化锆、氮化铝和氮化硅晶须等。具有高强度、高弹性模量、低密度、高耐热等性能。按纤维的长度分为长纤维、定长纤维和短纤维等。按制造工艺方法不同，分为晶体生长法、气相沉积法、前驱体法、化学转化法、熔融法等。用作增韧补强材料。

磷酸钙人工骨：具有良好的骨诱导性、骨传导性及血管化能力。目前比较常见的磷酸钙人工骨成分有羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙陶瓷等。磷酸钙生物活性陶瓷支架置入动物背部肌肉或腹腔大网膜等位置后有一定的诱导成骨能力，在支架置入动物骨缺损或者背部肌肉一段时间后，进行病理组织学、X射线、CT、DSA等影像学检查，可以观察到材料周围有一定的新骨形成，同时周围有大量的新生血管长入材料内部。该材料已通过FDA认证，并且有许多相应的产品如人工骨条、髋关节生物活性涂层、人工义眼等产品应用于临床。

背景：前期研究证实，经晶须化处理的磷酸钙多孔生物活性陶瓷内部微观结构得到一定改变，具有良好的力学性能。

目的：进一步观察晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损的效果。

方法：采用占位法制备贯通性良好的磷酸钙多孔生物活性陶瓷，经水热处理法完成材料的晶须化。取15只健康成年比格犬，在双侧股骨外侧髁用电钻制造一直径10 mm、深度10 mm的圆柱状包容性骨缺损，右侧置入晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷，作为实验组；左侧置入未经过晶须化处理的磷酸钙多孔生物活性陶瓷，作为对照组。置入后第2，4，8，12周分别进行骨缺损区X射线及双能X射线检查。

结果与结论：①X射线：随着时间的增加，两组骨缺损与正常骨质周围的界面逐渐模糊、消失，12周时两组骨缺损界面已完全融合，对照组材料部分溶解，实验组材料随着时间增长未见明显溶解，两组不同时间点的X射线评分比较差异无显著性意义。②双能X射线：随着时间的增加，两组骨密度逐渐增加，但两组不同时间点的骨密度比较差异无显著性意义。表明晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷具有良好修复股骨髁缺损的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-4871-9551(周朝玺)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 磷酸钙, 晶须化, 骨缺损, 骨密度, 多孔支架, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that the internal microstructure of porous calcium phosphate ceramics after the whiskering process has some changes, and obtain good mechanical properties.
OBJECTIVE: To further investigate the effect of whisker-covered porous calcium phosphate ceramics in repair of canine femoral condyle defects.
METHODS: Highly interconnected porous calcium phosphate ceramics was prepared by placeholder method. The whiskering of the materials was finished by hydrothermal process. Fifteen healthy adult beagle dogs were selected in this study. A 10 mm×10 mm cylindrical inclusive bone defect was made bilaterally on the lateral femoral condyle with a drill. The porous calcium phosphate ceramics after the whiskering process was implanted onto the right femoral condyle as experiment group. The porous calcium phosphate ceramics without the whiskering process was implanted onto the left femoral condyle as control group. At 2, 4, 8, and 12 weeks after implantation, X-ray and dual-energy X-ray test were conducted in the bone defect area respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) X-ray: With the increase of time, the interface between bone defect and normal bone of two groups gradually blurred, disappeared, and completely fused at 12 weeks. The material in the control group was partially dissolved, while there was no obvious dissolution in the experiment group. No significant difference in the X-ray scores was found between two groups at different time points. (2) Dual-energy X-ray: With the increase of time, the bone mineral density of the two groups both increased gradually, but there was no significant difference in the bone mineral density at different time points between these two groups. These results demonstrate that the porous calcium phosphate ceramics after the whiskering process has good ability to repair the defects of femoral condyle.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

周朝玺，崔旭，敖国昆，许韬韬，翁杰，肖占文，张兴栋，张聪. 晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(3): 324-329.

Zhou Chao-xi, Cui Xu, Ao Guo-kun, Xu Tao-tao, Weng Jie, Xiao Zhan-wen, Zhang Xing-dong, Zhang Cong. Wisker-covered porous calcium phosphate ceramics in repair of canine femoral condyle defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(3): 324-329.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 15只比格犬均进入结果分析。

2.2 X射线衍射结果磷酸钙多孔生物活性陶瓷未晶须化之前X射线衍射峰与标准衍射峰相比同时具备羟基磷灰石与β-磷酸三钙的特征峰，晶须化处理之后的β-磷酸三钙衍射峰消失，见图3，这个结果说明晶须化处理之后磷酸钙多孔生物活性陶瓷中的β-磷酸三钙已转变成为了羟基磷灰石，同时说明整个操作过程中并未引入其他杂质。

2.3 术后动物一般情况 1只动物术后第2天右侧切口周围出现明显肿胀，活动减少，进行穿刺抽液有脓性渗出，遂进行切开引流术，并肌肉注射庆大霉素1周，逐渐好转，恢复正常活动；其余动物术后进食及活动良好，术后第3天可以自行站立活动，10 d左右伤口完全愈合，所有动物术后未发生继发性骨折。

2.4 X射线评估结果

实验组：置入后2周，材料与正常骨骼的接触界面明显，未见明显改变；置入后4周，材料与骨骼的界面稍模糊，轻微的骨膜反应；置入后8周，材料被新生骨组织替代，材料少量溶解，大部分骨与材料界面已消失；置入后12周，骨缺损进一步愈合，形成骨性连接，材料进一步溶解，材料置入区域的密度影与周围正常骨质接近，见图4。对照组：置入后2周，材料与股骨髁接触界面稍模糊；置入后4周，材料与股骨髁接触界面基本消失，少量骨痂形成；置入后8周，骨痂进一步增加，与股骨髁接触界面消失；置入后12周，骨缺损已完全消失，见图4。

两组骨缺损随着时间的增加逐渐修复，对两组组内不同时间点的评分结果行方差分析，两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)；两组间相同时间点的评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，说明磷酸钙多孔生物活性陶瓷晶须化处理前后修复骨缺损的能力没有改变。

2.5 骨密度检测结果随着时间的增加，两组骨缺损区的骨密度也是在不断增加，对两组组内不同时间点的骨密度行方差分析，结果显示两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)；虽然相同时间点实验组骨密度数据较对照组稍高，但差异无显著性意义，见表2。

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引言

临床上由于创伤、感染、肿瘤等引起的骨缺损很常见，修复骨缺损一般采用自体骨或同种异体骨移植。自体骨的生物活性及植骨效果最佳，多采用自体髂骨或者腓骨。自体骨取骨手术可能延长手术时间，引起供区病理性骨折、继发感染或慢性疼痛，在一定程度上限制了其临床应用^[1]。同种异体骨通常源于灭活的尸体骨，植骨融合效果基本等同于自体骨植骨，但可能产生排异反应或者传播艾滋病等疾病，而且来源有限^[2]。

磷酸钙生物活性人工骨是一种良好的骨移植替代材料，具有良好的骨诱导性、骨传导性及血管化能力^[3-4]。目前比较常见的磷酸钙人工骨成分有羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙陶瓷等。磷酸钙生物活性陶瓷支架置入动物背部肌肉或腹腔大网膜等位置后有一定的诱导成骨能力，在支架置入动物骨缺损或者背部肌肉一段时间后，进行病理组织学、X射线、CT、DSA等影像学检查，可以观察到材料周围有一定的新骨形成，同时周围有大量的新生血管长入材料内部^[5-7]。该材料已逐步应用于临床，并取得了很好的骨修复效果。但目前的磷酸钙支架材料强度不是很满意，难以应用于负重部位的骨缺损。目前各种增加材料强度的方法需要在制作过程中加入金属离子、高分子等杂质^[8-10]，各种掺杂方法虽然可改善材料的力学强度，但同时使材料的生物学活性受到一定影响，尤其是一些重金属离子长时间置入体内可能对机体有损害。本课题组对磷酸钙支架材料进行晶须化处理之后^[11]，在没有添加任何杂质的前提下使得材料的抗压强度有所提高，但是材料晶须化处理之后的骨修复能力尚有待于进一步研究。

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材料方法

1.1 设计自身对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至7月在解放军309医院动物实验室及放射科完成。

1.3 材料

实验动物：一两岁龄健康成年比格犬15只，雌雄不拘，体质量8-10 kg，由解放军309医院动物实验室提供，许可证号：SYXK(军)2012-0016。实验方案及动物的处死方法符合动物伦理学标准。

双相磷酸钙陶瓷粉末由四川大学生物材料中心提供，其中羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为20/80。

晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损所需试剂及仪器：氯化锂、氮氮二甲基乙酰胺、甲壳素(成都苌征化玻有限公司)；扫描电镜(日本HITACH公司)；DXEA双能X射线骨密度检测仪(美国HOLOGIC公司)。

1.4 方法

晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷的制备及表征：采用乳液法制备直径在900-1 200 µm的糖球。将5 g无水氯化锂加入到100 mL氮氮二甲基乙酰胺中，待其完全溶解后加入0.7 g甲壳素，磁力搅拌24 h至甲壳素完全溶解，再加入25 g双相磷酸钙陶瓷粉末，连续搅拌24 h，使其成为均匀的羟基磷灰石/甲壳素溶胶。将糖球紧密堆积在圆形塑料注射器模具内，并在60 ℃电烘箱中热处理7 min，然后将羟基磷灰石/甲壳素溶胶加入到模具内，待模压成型后将支架取出，置于无水乙醇中浸泡，使其进一步固化；取出固形体，置于40 ℃去离子水中反复洗涤以除去糖球，并滴定氯离子以完全清除锂离子，将支架切成圆柱形，最后在常温下干燥后获得多孔双相磷酸钙陶瓷支架初坯；初坯在1 050 ℃下烧结2 h，获得多孔双相磷酸钙陶瓷支架，尺寸为φ10 mm×10 mm的圆柱状支架，孔隙率78%^[12]。将材料放入pH=4的盐酸中，180 ℃环境下水热处理12 h后^[11]，电镜扫描观察发现材料的表面已完全晶须化，且孔与孔之间的贯通良好(图1)。高压蒸汽灭菌处理后备用。

骨缺损模型的制作及修复：采用速眠新0.1 mL/kg肌肉注射麻醉15只比格犬后，常规备皮，碘伏消毒，在双侧股骨外侧髁侧方纵行切开，切口长度约3 cm，逐层显露皮下组织、肌肉、肌腱，高频电刀止血，骨膜下剥离肌腱及骨膜，显示股骨外侧髁，用直径1 cm电钻在外侧髁制造出深度约1 cm、直径1 cm的骨缺损，设自身对照，左侧股骨外侧髁缺损置入未经过任何处理的磷酸钙多孔生物活性陶瓷，作为对照组；右侧股骨外侧髁缺损置入晶须化处理的磷酸钙多孔生物活性陶瓷，作为实验组。生理盐水清洗伤口后，依次缝合肌肉、筋膜、皮肤。

1.5 主要观察指标

X射线衍射：检测磷酸钙多孔生物活性陶瓷晶须化处理之后的成分变化，有无杂质引入。

影像学检查：置入后2，4，8，12周分别进行DR成像，将动物麻醉后俯卧位趴在检查床，两条后腿尽量平行伸直，行双侧膝关节侧位片检查，并进行Lane-sandhu X射线评分：①骨形成：无骨形成，0分；骨形成占缺损25%，1分；骨形成占缺损50%，2分；骨形成占缺损75%，3分；骨形成占缺损100%，4分。②骨连接：骨折线清楚，0分；骨折线部分存在，2分；骨折线消失，4分。③骨塑形：未见塑形，0分；骨髓腔形成，2分；骨皮质形成，4分。

骨密度检查：应用双能X射线骨密度测试仪进行扫描，置入后2，4，8，12周时间各进行1次。将动物麻醉处理之后俯卧位趴于检测床上，设定扫描起始位置为膝关节上2 cm处，扫描距离设定为15 cm；扫面完毕等到整个扫面图像显示之后，在测量软件上圈出17×17大小ROI感兴趣区域(图2)，分析出骨密度值。每个位置重复测量3次，取平均值。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，进行 t 检验。

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讨论

通常认为理想的骨替代材料应具有以下特性：良好的生物相容性，不会引起细菌感染或不利的炎症反应；理化性质稳定，可耐受临床常用的消毒方案；可以降解且降解过程中不会发生塌陷；具有良好的骨诱导性及骨传导性；置入体内后，可通过临床上常用的影像学等观察方法看到骨愈合变化情况^[13]。磷酸钙多孔生物活性陶瓷具有良好的骨诱导、骨传导特性，置入体内后不会带来任何毒性作用。目前已有通过FDA认证采用该材料制备的人工椎板、填充骨条、人工义眼、髋关节涂层等临床产品^[14-16]。羟基磷灰石主要有钙磷等元素成分，钙磷比例为1.67，人类骨骼在高温煅烧之后的主要成分也是羟基磷灰石。磷酸钙陶瓷内部为大孔微孔相互连通的多孔蜂窝状结构，微孔直径小于10 µm，主要由焙烧过程中磷灰石晶体之间出现的间隔形成，微孔有助于体液循环和细胞迁移；大孔直径在100-500 µm之间，由焙烧过程中人为加入造孔剂而形成，它将为细胞的黏附和增殖提供孔道和支架；这种多孔结构与松质骨内部结构类似，而且孔与孔之间的贯通性越好越有利于血管的长入及成骨性能。

磷酸钙生物活性人工骨支架本身已具有一定的生物活性，但不同的制作工艺、孔隙率、烧结温度、微观形态等都有可能对材料的骨修复能力、强度、降解性能等有一定的影响。生物医学工程常见的磷酸钙人工骨支架制作工艺有发泡法、泡沫灌浆法、球堆积法及占位法等。发泡法比较常用的是双氧水发泡法，主要原理是利用双氧水受热之后可以蒸发出许多气泡，制作过程中将制备好的浆料中加入一定的双氧水加热，做成多孔生坯之后，高温烧结而成^[11]。泡沫灌浆法需要使用一些聚氨酯多孔海绵模具，选择不同孔隙率的海绵原料浸泡进入磷酸钙浆料中，反复离心再次浸泡等步骤制成^[17]。球堆积法则是先通过溶胶-凝胶法制备出磷酸钙球粒，将不同的磷酸钙球状颗粒堆积而成^[18]。占位法主要使用一些可以去除的颗粒，例如糖球、蜡球颗粒之类的，放入预置好的容器中，倒入浆料，通过烧结或其他方法去除内部颗粒，形成支架^[19]。

发泡法目前是制作材料比较常用的一个方法，制作工艺相对来说简单，成本比较低，但该制作过程中双氧水的分解是一个难以控制的过程，容易导致多孔材料内部的大孔小孔分布不均匀，影响材料强度，而且孔隙率难以控制。泡沫灌浆法制作出来的材料内部结构相对来说良好，与正常人体的松质骨多孔网状结构最为相似，生物活性较好，但这种方法需要反复多次经历浸泡、烘干等步骤，制作过程中容易浪费大量浆料，且含有聚氨酯海绵支架生坯在后期高温烧结过程中收缩比较严重，容易产生内部孔隙的堵死。球堆积法制作的支架多孔内部结构与正常骨骼结构差别较大，磷酸钙颗粒的堆积过程需要逐步粘接等工艺，相对比较繁琐。本实验采取糖球占位法制作多孔材料，材料的孔隙率可通过控制糖球的大小来控制，而且糖球占位过程中通过去离子水浸泡溶解去除内部糖球，这个过程可保证材料孔与孔之间的良好贯通性，电镜扫描图片也证实了每个大孔之间都有一定数量的贯通孔与其他孔连接，保证材料的生物活性。

通常磷酸三钙在置入体内之后随着时间的增加可逐渐溶解，羟基磷灰石随着时间增长溶解很少，甚至不溶解^[20]。本实验中的磷酸钙生物活性陶瓷经水热处理之后，X射线衍射表明其中的β-磷酸三钙逐渐转变形成了羟基磷灰石；X射线片提示随着时间的增加，对照组材料有所溶解，但骨密度一直处于上升状态，提示这个过程可能是材料溶解的同时成骨细胞形成、正常骨组织逐渐替代的一个过程。骨密度的增高间接反映了材料置入体内之后，可诱导局部钙磷水平有一定的增高，可能与成骨细胞局部形成、引起钙磷沉积等情况有关，与一些相关的细胞学实验数据所吻合^[21-34]。

本实验证明晶须化处理的磷酸钙生物活性陶瓷，置入体内后生物活性及成骨作用并没有受到明显影响。材料修复后骨缺损区的X射线评分数值都是随着时间的增加而不断增加，说明晶须化及未晶须化处理的磷酸钙生物活性陶瓷都具有良好的生活活性，虽然晶须化处理改变了材料表面的微观结构，但依然保留了材料的良好骨修复能力。于术前随机选取8只犬的16个股骨髁测量骨密度，获得的骨密度为(0.569±0.175) g/cm²，在实验材料置入3个月时的骨密度接近于正常股骨密度。磷酸钙生物活性人工骨的研究经历了从宏观到微观的改进，经历了从内部孔隙结构到表面微结构改进的一个进程。材料微观结构方面的改进，往往可以在不引入其他杂质情况下提供骨修复能力，使其更适合于临床上骨缺损的修复。晶须化处理可以在增加材料的强度同时，不影响材料的骨修复能力，本实验结果表明此改性方案符合临床骨缺损修复的发展方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

晶须化磷酸钙多孔生物活性陶瓷修复犬股骨髁缺损

Wisker-covered porous calcium phosphate ceramics in repair of canine femoral condyle defects

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