骨形态发生蛋白复合物结合CAD/CAM技术原位修复喉甲状软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床修复喉甲状软骨缺损时使用一定的支架材料。骨形态发生蛋白具有成骨诱导活性，与其他形式的载体联合起来进行复合应用可以更好的发挥出其诱导成骨作用。联合使用计算机辅助设计/计算机辅助制造技术能提高修复效果。
目的：进一步验证骨形态发生蛋白复合物结合计算机辅助设计/计算机辅助制造技术在原位修复喉甲状软骨缺损中的应用效果。
方法：纳入18只新西兰大白兔，对动物喉部进行三维扫描，建立兔甲状软骨三维数字模型。利用泡沫凝胶注模法制备羟基磷灰石支架，再制备骨形态发生蛋白复合物。18只动物随机分为观察组和对照组。两组兔行一侧甲状软骨切除后，观察组植入珊瑚羟基磷灰石支架；对照组填充明胶海绵。处理后 4，8，12周，进行大体观察和评分；处理后12周，对动物行喉镜检查，喉组织常规切片后进行苏木精-伊红染色，进行组织学观察。
结果与结论：处理后12周，对照组兔的喉腔出现明显的变窄现象，且存在轻微充血；观察组喉腔黏膜光滑，且通畅、宽敞，未出现肉芽生长情况。处理后4，8，12周，两组喉甲状软骨评分均呈现出不断下降的情况，且不同时间点，观察组评分均显著低于对照组(均P < 0.05)。处理后12周，对照组未出现成熟骨细胞和软骨细胞的生成；观察组则可见植入材料完全降解，存在大量多核样组织细胞增生和吞噬，手术区域软骨母细胞出现增生现象，并伴有成软骨区域形成情况，另外还以观察到软骨骨质形成以及软骨细胞增生现象。结果表明，利用骨形态发生蛋白复合物结合计算机辅助设计/计算机辅助制造技术进行原位喉甲状软骨缺损修复可以获得良好的效果，实验过程中所使用的复合物具有良好的骨诱导作用以及组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 喉部, 软骨缺损, 软骨修复, 甲状软骨缺损, 骨形态发生蛋白, 计算机辅助设计/计算机辅助制造技术

Abstract:

BACKGROUND: In the process of repairing laryngeal cartilage defects, a certain scaffold material can be used. Bone morphogenetic proteins have the activity of osteogenic induction, which can be used in combination with other materials. In order to improve the repairing effect, the combination of bone morphogenetic protein complex and computer aided design/computer aided manufacturing (CAD/CAM) technology is preferred.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone morphogenetic protein complex combined with CAD/CAM technology for in situ repair of laryngeal cartilage defects.
METHODS: Eighteen New Zealand white rabbits were enrolled and randomly divided into observation and control
groups followed by three-dimensional scanning of the throat. Then, three-dimensional rabbit models of the thyroid cartilage were made. Porous hydroxyapatite scaffold was prepared using gelcasting-foam method and combined with bone morphogenetic proteins. After unilateral removal of the thyroid cartilage, the composite scaffold and gelatin sponge were implanted into the rabbits in the observation and control groups, respectively. At 4, 8, 12 weeks after implantation, the rabbits in the two groups were observed grossly. At 12 weeks, the animals were sacrificed following laryngoscopy to observe the histological and pathological changes.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 weeks after implantation, the laryngeal cavity was narrowed and appeared to have a slight congestion in the control group; while in the observation group, the laryngeal cavity was smooth, unobstructed and spacious, with no granulation growth. At 4, 8, 12 weeks after implantation, the scores on the thyroid cartilage were decreased dramatically in the two groups, especially in the observation group (P < 0.05). At 12 weeks after implantation, there were no mature osteocytes and chondrocytes in the control group; in the observation group, the scaffold degraded completely, there was a large amount of cell proliferation and phagocytosis, and chondroblastic proliferation and cartilage formation were found in the surgical region. These results indicate that the use of bone morphogenetic protein complex combined with CAD/CAM technique can have good achievements in the treatment of in situ laryngeal cartilage defects. Additionally, the composite material used in the experimental procedure has good osteoinductive effect and histocompatibility.

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中图分类号:

R318

刘艺昌，周敬. 骨形态发生蛋白复合物结合CAD/CAM技术原位修复喉甲状软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.006.

Liu Yi-chang, Zhou Jing. Bone morphogenetic protein complex combined with CAD/CAM technique in the in situ repair of laryngeal cartilage defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.51.006.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2015年3至7月在南阳市中心医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新西兰大白兔18只，均为雄性，一般情况良好。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。
1.3.2 生物材料实验过程中使用的羟基磷灰石由四川大学生物材料工程研究中心提供，产品为白色粉末，难溶于水，易溶于酸。材料无细胞毒性和热原反应等，具有良好的生物相容性。明胶海绵由南昌市祥恩堂医疗器械有限公司提供，经打泡、固化、干燥、灭菌等工艺制成。材料无细胞毒性和热原反应等，具有良好的生物相容性。
1.3.3 主要试剂与仪器

1.4 实验方法
1.4.1 兔甲状软骨三维重建对兔喉部使用CT扫描5 cm视野(100 mAs，120 kV，0.67 mm薄层)，获得二维扫描数据。将数据导出，并利用医学图像处理软件进行处理，按照灰度值分割外轮廓，分割之后将动物甲状软骨部分数据导出，获得三维点云示意图(见图1A)。并将相应的空间点导入专业逆向工程软件进行处理，获得动物甲状软骨三维数字模型(见图1B)。

1.4.2 制备羟基磷灰石支架利用泡沫凝胶注模法制备羟基磷灰石多孔标准样件，在常温常压环境下，利用生物力学测试系统对标准样件的抗压强度进行检测。将去离子水、单体、交联剂、分散剂进行混合，获得预混液，与粉末一起搅拌，制备浆料。添加起泡剂，见快速的搅拌至，体积为搅拌前两三倍之后停止，依次添加催化剂以及引发剂。充分搅拌之后，注入甲状软骨板样件模具中(见图2)，凝固之后开模烘干并进行烧结，之后取出，冷却后备用。

1.4.3 制备骨形态发生蛋白复合物按照1∶2的质量比对水溶性Ⅰ型胶原冻干粉和羟基磷灰石支架进行混合，利用冷冻吸附法使Ⅰ型胶原沉淀在支架上，获得珊瑚羟基磷灰石支架，常规环氧乙烷消毒后保存备用。
1.4.4 动物分组和处理 18只动物随机分为2组，每组9只，分别设为观察组和对照组，均接受手术处理。手术过程中，经常规麻醉和消毒之后，确定手术切口部位(见图3A)，暴露甲状软骨(见图3B)，切除一侧甲状软骨(见图3C)。然后观察组植入珊瑚羟基磷灰石支架(见图3D)，对照组填充明胶海绵。

1.4.5 术后处理术后对动物进行单笼关养和常规饲喂，并予以常规抗感染处理。
1.4.6 喉镜检查术后12周，对动物进行喉镜检查。观察喉腔黏膜有无炎症、有无肉芽生长，声带闭合情况，喉腔是否通畅、有无塌陷现象的发生。
1.4.7 组织学观察术后 4，8，12周，分批处死动物，每组每批3只，获得标本进行大体观察和评分，染色后置于光学显微镜下进行组织学观察。

1.4.8 病理学观察术后12周，处死动物后，即可获得动物的完整喉部及其周围组织，常规甲醛固定后进行硝酸脱钙处理，并利用无水乙醇进行梯度脱水等，常规切片后进行苏木精-伊红染色，并置于光镜下进行观察。
1.5 主要观察指标 ①动物大体情况和术后12周喉镜检查结果。②两组术后不同喉甲状软骨评分情况分析。③术后12周病理学观察结果。
1.6 统计学分析对于在此次研究过程中收集到的相关数据，均利用统计学软件SPSS 19.0进行处理分析。其中，对于计量资料，符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。并对P 值进行检测，并将不同数据经统计学比较差异存在统计学意义的标准设定为 P < 0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

临床对各种喉部疾病进行治疗的过程中，经常会实施喉切除术，容易导致喉甲状腺软骨缺损的出现。临床进行骨缺损修复的时候，自体软骨是理想的支架材料，但在实际应用方面受到较大的限制^[7-11]。
骨形态发生蛋白可以在骨形成以及骨折愈合中发挥出十分重要的作用，并可以在骨缺损修复之中发挥出重要的作用^[12-16]。但是，单纯予以骨形态发生蛋白植入容易出现扩散和降解，无法对新骨形成予以持续性的影响，导致对最终的效果产生一定的影响^[17-21]。因此，需要利用一定的载体来维持重组人骨形态发生蛋白的作用浓度和维持时间，以保证其良好的成骨能力^[22-26]。胡鹏^[27]通过构建犬甲状软骨缺损模型并进行实验研究发现，利用骨形态发生蛋白-纤维蛋白复合物、骨基质明胶、羟基磷灰石复合物对动物进行甲状软骨缺损移植修复治疗可以获得理想的修复效果，相应的复合物是一种良好的喉软骨修复材料。对兔陈旧性关节软骨缺损进行治疗的过程中，尝试使用人重组骨形态发生蛋白2+碱性成纤维细胞因子纤维蛋白复合物，并在术后10，14，18周进行组织学观察发现，人重组骨形态发生蛋白2+纤维蛋白复合物可以对兔陈旧性关节软骨缺损予以有效的修复，获得优于碱性成纤维细胞生长因子纤维蛋白复合物的短期效果。为了提高修复效果，还可以积极的使用各种计算机辅助技术^[28-29]。
本次研究过程中，即制备骨形态发生蛋白复合物，并将其应用于对喉甲状腺软骨缺损动物的修复治疗之中。治疗过程中，还积极的使用各种计算机辅助技术。通过对动物喉部进行三维扫描，获得二维扫描数据，获得三维点云示意图以及动物甲状软骨三维模型图。本次实验结果显示，在术后12周对动物进行喉镜检查可以发现，对照组的喉腔出现明显的变窄现象，且存在轻微充血；观察组喉腔黏膜光滑，且通畅、宽敞，未出现肉芽生长情况。且在术后4，8，12周进行喉甲状软骨评分可以发现，随着时间的推移，两组评分均呈现出不断下降的情况，且不同时间点，观察组评分均显著低于对照组(均P < 0.05)。即表明，经骨形态发生蛋白复合物结合CAD/CAM技术修复治疗之后，获得了理想的喉甲状软骨缺损修复效果。另外，通过本次实验还发现，术后12周的病理学观察显示，对照组未出现成熟骨细胞和软骨细胞的生成；观察组则可见植入材料完全降解，存在大量多核样组织细胞增生和吞噬，手术区域软骨母细胞出现增生现象，并伴有成软骨区域形成情况，另外还以观察到软骨骨质形成以及软骨细胞增生现象。羟基磷灰石材料支架具有多孔性网状结构，孔隙及孔隙率为新生骨样组织的长入提供了场所，保证了各种营养物质的输入，还可以为诱导软骨生成的物质提供所需空间^[30]。联合胶原进行使用，可以在为骨形态发生蛋白提供良好载体的同时，发挥出良好的骨诱导性能^[31-32]。即提示，骨形态发生蛋白复合物具有良好的骨诱导活性，可以发挥出理想的骨诱导作用，达到良好的修复效果。
综上所述，利用骨形态发生蛋白复合物结合CAD/CAM技术进行原位喉甲状软骨缺损修复可以获得良好的效果，实验过程中所使用的复合物具有良好的骨诱导作用以及组织相容性，是一种十分理想的治疗方案，关于其临床甲状软骨缺损修复治疗效果，值得予以进一步分析。但是，本次研究过程中，受到研究时间以及实际条件等因素的影响，所纳入研究的实验动物数量有限，相应的观察指标等也较少，所获得的相关的结果以及结论等均有可能存在一定的不足之处。为此，进一步结果，还有待在今后的研究中通过增加观察指标、不断扩大样本容量、延长观察时间等方式予以探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程