巢蛋白在阿霉素肾病模型大鼠肾组织中表达及霉酚酸酯的干预作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证明，足细胞损伤是产生肾小球性蛋白尿的重要机制。而关于足细胞内众多骨架蛋白如何互相调节维持足细胞特有的形态目前尚未完全了解，足细胞骨架的构建和重塑也成为蛋白尿发生机制的研究热点。
目的：构建阿霉素微小病变肾病大鼠模型，以霉酚酸酯进行干预，检测大鼠肾组织中巢蛋白(nestin)的表达。
方法：纳入雄性Wistar大鼠36只，随机均分为肾病模型组、霉酚酸酯组、正常组(n=12)。肾病模型组、霉酚酸酯组大鼠一次性尾静脉注射阿霉素进行造模，正常组尾静脉注射等量生理盐水。霉酚酸酯组大鼠于造模次日给予霉酚酸酯灌胃，20 mg/(kg•d)，1次/d；其他两组大鼠每日给予等量生理盐水。各组分别于造模后14，21，28 d各处死4只大鼠，取肾皮质进行苏木精-伊红染色和免疫组化染色，观察大鼠肾组织病理学改变以及nestin表达情况。
结果与结论：正常组大鼠肾小球滤过膜结构完整，上皮细胞足突清晰；肾病模型组大鼠肾小球上皮细胞足突广泛融合，基底膜正常；霉酚酸酯组大鼠肾小球上皮细胞足突部分融合，但病变较轻。免疫组化结果提示从造模第14天开始，肾病模型组和霉酚酸酯组大鼠nestin表达明显增加，与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；霉酚酸酯组大鼠nestin表达低于肾病模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示肾小球足细胞损伤时，足细胞内nestin表达增多，随病情加重而表达增高。霉酚酸酯可以减轻足细胞损伤，下调nestin的表达，维持足细胞的正常结构，达到延缓肾脏损害的目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 泌尿系统损伤动物模型, 肾病模型, 微小病变, 阿霉素, 霉酚酸酯, 巢蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that podocyte injury is an important mechanism to generate glomerular proteinuria. However, it is not yet fully understood regarding the modulation method by which cytoskeletal proteins in the podocyte can maintain the unique morphology of podocytes. The construction and remodeling of podocyte cytoskeleton has become an increasing area of interest in the research field of proteinuria mechanism.
OBJECTIVE: To establish rat models of minimal change adriamycin nephropathy, and detect the expression of nestin in rat renal tissue under the intervention of mycophenolate mofetil.
METHODS: Thirty-six male Wistar rats were included and randomly divided into nephropathy model, mycophenolate mofetil and normal groups (n=12). Rats in nephropathy model and mycophenolate mofetil groups were intravenously injected with adriamycin via the tail vein at one time to establish models. Rats in normal group were intravenously injected with the same amount of normal saline via the tail vein. On the next morning, rats in mycophenolate mofetil group were intragastrically administered 20 mg/kg mycophenolate mofetil, once per day. Rats in nephropathy model group and normal group were given the same amount of normal saline daily. Four rats from each group were sacrificed at 14, 21 and 28 days after modeling. The renal cortex was harvested and subjected to hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining. The pathological changes of renal tissue were observed and nestin expression in renal tissue was detected.

RESULTS AND CONCLUSION: In the normal group, rat glomerular filtration membrane structure was complete and epithelial cell foot process was clear. In the nephropathy model group, glomerular epithelial cell foot processes were fused to a large extent, and basement membrane was normal. In the mycophenolate mofetil group, glomerular epithelial cell foot processes were partly fused, but the pathological changes were milder. Immunohistochemistry results showed that beginning from the 14th day of modeling, rat nestin expression in the nephropathy model and mycophenolate mofetil groups was significantly increased compared with the normal group (P < 0.05). Rat nestin expression in the mycophenolate mofetil group was significantly lower than that in the nephropathy model group (P < 0.05). These results suggest that after glomerular podocyte injury, nestin expression in podocyte increased, while the expression increased with the aggravation of the disease. Mycophenolate mofetil can alleviate podocyte injury, downregulate nestin expression, maintain the normal structure of podocytes, and thereby achieve the purpose of delaying kidney damage.

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中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

足细胞是位于肾小球基底膜外具有大量突起的特殊上皮细胞，是肾小球滤过膜的重要组成成分，足细胞依靠其指状足突附着在毛细血管基底膜表面，足突之间形成曲折的滤过裂隙是肾小球滤过膜的最后一道屏障，足细胞异常是产生蛋白尿的重要机制^[1-2]。足细胞的胞体和主突的细胞骨架是由微管及中间丝构成。巢蛋白(nestin)是属于第Ⅵ类中间丝的细胞骨架蛋白。
小儿微小病变肾病综合征是一组由足突细胞病变引起的肾小球通透性增加，导致血浆内大量蛋白质从尿中丢失的临床综合征，是儿童单纯型肾病综合征中最常见的类型，也是儿童原发性肾病综合征最主要的病理类型，要表现为明显水肿、大量蛋白尿、低蛋白血症和高胆固醇血症^[1]，其发病机制尚不明了。目前认为细胞免疫反应为微小病变肾病综合征发病的中心环节，特别是足突细胞，故在此探讨微小病变肾病综合征免疫发病机制。霉酚酸酯是一种抗代谢免疫抑制剂，其防治各类实体器官移植急性排斥的疗效得到广泛认可。肾炎前瞻对照及临床观察性研究均证实霉酚酸酯联合糖皮质激素适用于狼疮肾炎有肾脏活动性病变者，如弥漫增殖型狼疮肾炎(WHO分型Ⅳ型)和其他类型(Ⅲ型和Ⅴ型)中有活动性病变者，其中合并血管病变如血管炎者效果更好。虽然霉酚酸酯已经临床应用于治疗肾病综合征^[3-5]，但其减轻蛋白尿的机制尚未完全了解。
小儿肾病综合征最常见病理类型是微小病变型。该病理类型通常对糖皮质激素治疗反应敏感，但易复发，数次复发后可转变为激素依赖或激素耐药，治疗棘手。其形态学特点是光镜下肾小球基本正常，或无明显改变；免疫荧光检查通常为阴性；超微结构特点显示肾小球足细胞足突融合^[6-7]。阿霉素肾病动物模型是经典的微小病变病理模型，慢性肾脏病的发病机制，寻找能有效地治疗慢性肾脏病的药物，实验在阿霉素肾病的基础上造模，该模型的优点是简便，成功率高，药源充足，具有较广阔的实用前景，为探索儿童微小病变型肾病综合征的发病机制和药物防治提供了良好的实验基础。
实验以阿霉素肾病大鼠建立微小病变肾病模型，以霉酚酸酯进行干预，免疫组化方法检测肾组织中nestin的表达。探讨足细胞骨架蛋白损伤产生蛋白尿的机制，以及霉酚酸酯的治疗作用。

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材料方法

1.1 实验材料随机对照动物实验，于2008年9月至2009年9月在中国医科大学医院实验动物中心完成。

1.2 造模动物雄性Wistar大鼠36只，6-8周，体质量(190±20) g，SPF清洁级，购于中国医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(辽)2008-0005。按照随机数字表法分为3组，每组12只。肾病模型组制备阿霉素肾病模型；霉酚酸酯组造模后给予霉酚酸酯治疗；正常组为空白对照组。
1.3 造模方法
模型制备：以尾静脉注射阿霉素的方法复制大鼠阿霉素肾病模型。动物购入后适应性饲养1周后进行造模，肾病模型组和霉酚酸酯组尾静脉注射2%的盐酸阿霉素， 6.5 mg/kg；正常组尾静脉注射同等量生理盐水。标准饲料喂养，自由摄食、饮水，观察28 d。造模后第1天开始灌胃给药，霉酚酸酯组给予20 mg/kg的霉酚酸酯，溶于生理盐水，浓度1%，1次/d。正常组和肾病模型组给予生理盐水，每只0.4 mL，1次/d[8]。
造模成功的检测标准：大鼠出现明显低白蛋白血症、高胆固醉血症等肾病综合征表现，光镜下病变轻微电镜下肾小球上皮细胞足突肿胀融合[8]。本实验过程中，注射阿霉素后14 d至观察结束，肾病模型组和霉酚酸酯组大鼠尿蛋白明显升高，说明模型制作成功。
1.4 指标测定造模后14，21，28 d，每组同一时间点各随机处死4只大鼠。
苏木精-伊红染色：取新鲜肾脏组织取材后，40 g/L多聚甲醛固定，4 ℃冰箱保存。肾组织修整成厚度为2.0-3.0 mm的组织片，清水冲洗，体积分数95%乙醇浸泡过夜。二甲苯透明连续3次浸泡，每次5 min。浸蜡1 h，再浸蜡1 h，包埋成蜡块。切片机切成3.0-4.0 μm厚的切片，封固，室温过夜，备用于形态学和免疫组化实验。
免疫组化[9]：取常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，体积分数100%-70%乙醇梯度脱水，PBS洗3次。中档微波后，抗原修复3次，1 min/次，间隔10 min，室温自然冷却，PBS洗3次。加入nestin一抗，1∶300，过夜，后PBS洗3次。加入抗鼠二抗，37 ℃，30 min，PBS洗3次。DAB显色5 s，清水洗涤，苏木精-伊红复染。脱水后中性树脂封固。显微镜下棕黄色为阳性着色，用PBS代替一抗作阴性对照。
免疫组化图像分析：肾小球免疫组化采用Meta Morph offline显微图像分析系统进行半定量分析，计算肾小球nestin蛋白染色强弱。每只大鼠样本在高倍镜下(×400)随机取15个完整不重复肾小球，计算积分吸光度值(IA)，再计算其平均值即为nestin蛋白阳性表达的相对含量。
1.5 主要观察指标各组分别于造模后14，21，28 d各处死4只大鼠，取肾皮质进行苏木精-伊红染色和免疫组化染色，观察大鼠肾组织病理学改变以及nestin表达情况。
1.6 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料用x(_)±s表示；多组资料间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)，各组资料间具备方差性，采用最小显著差法(LSD法)；对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

阿霉素肾病的发病机制与氧自由基的作用和脂质过氧化对肾脏的损害有关，阿霉素在体内产生的自由基诱发了肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，破坏了肾小球滤过膜的结构和功能，造成肾小球基底膜缺损，同时对肾小管上皮产生一定毒性，最终导致滤过屏障的选择性变化而致病^[11]。该模型已得到广泛认可，用于防治肾病的药物筛选。经过大量实验研究，通过比较不同品系的大鼠制备阿霉素模型发现，SD大鼠、Wistar大鼠和DALDN小鼠具有较高的阿霉素敏感性，模型特征出现迅速、持续、稳定^[12-13]。因此目前阿霉素肾病模型采用较多，且可复制性强。
儿童肾病综合征最常见病理类型是微小病变型，其发生机制仍未完全明了。其形态学特点是光镜下肾小球基本正常，或无明显改变；免疫荧光检查通常为阴性；超微结构特点显示肾小球足细胞足突融合^[14-15]。近年来，随着肾脏病分子生物学的发展，足细胞骨架损伤与蛋白尿的关系受到研究者的重视。nestin是新近发现的足细胞骨架蛋白之一，属于第Ⅵ类中间丝。以往的研究中发现，从nestin的蛋白结构来看，nestin与其他中间丝蛋白不同，其N-端很短，但有一很长的C-末端。早期发育的肾小球上及毛细血管袢、鲍曼氏囊发现有nestin的表达，发育中的足细胞和S形结构的内皮细胞也有nestin的表达。有研究观察中间丝蛋白类的nestin在足突广泛融合的肾小球中的表达及其与足突病变动态过程和蛋白尿产生的关系，认为在以足突广泛融合为特征的肾脏病变中，肾小球中间丝蛋白nestin表达显著减少，并与蛋白尿程度呈负相关，提示nestin可能参与了足细胞形态和功能的维持。成熟的足细胞在细胞体和主突中表达nestin，同时也表达vimentin和desmin(结蛋白，第Ⅲ类中间丝)^[16]。Vimentin和desmin在微小病变肾病动物模型的足细胞中表达增高^[17-18]。在本研究中也观察到nestin在微小病变肾病动物模型的足细胞中表达增高。提示nestin与足细胞内的其他中间丝蛋白相互作用，凋节中间丝的组装，从而参与肾小球足细胞形态与功能的维持。
从实验中可以看到，随着时间的推移，肾病模型组大鼠尿蛋白逐渐增加，nestin的表达也逐渐上升。Pearson相关分析结果二者呈正相关。提示随着足细胞损伤加重， nestin表达量上升。霉酚酸酯组大鼠经过霉酚酸酯干预后，尿蛋白排泄减少，足细胞损伤减轻，nestin表达量也相对减少。足细胞受到损伤后，细胞骨架被破坏，出现足突融合等表现，足细胞的屏障功能也随之下降，出现蛋白尿。足细胞损伤与nestin增加的具体机制尚不明确。可以推测，受损的足细胞可能启动自身代偿性修复过程，重塑细胞骨架，维持细胞形态和功能^[19]。nestin作为中间丝蛋白，是细胞骨架中微丝和微管结构的联结物质，在足细胞受损后代偿性大量表达。由于损伤因素的影响，足细胞骨架正常有序的组装调控过程受阻，导致nestin堆积。
在临床治疗方面，1978年国际儿童肾脏病研究会(ISKDC)报告微小病变型虽然绝大多数对激素敏感，但仍有7%-30%为激素依赖或耐药。因此，新型免疫抑制剂的应用越来越受到临床医生的重视^[20-21]。1998年Briggs等首次将霉酚酸酯用于成人激素抵抗型和/或复发性肾病综合征的治疗，取得了良好的效果^[9]。国内2001年付元凤等报道了霉酚酸酯治疗儿童难治性肾病综合征11例，也取得了满意的疗效^[10]。霉酚酸酯(又称吗替麦考酚酯)，商品名为骁悉(Cellcept)。霉酚酸酯在体内脱酯化后形成具有免疫抑制活性的代谢物霉酚酸。霉酚酸选择性、可逆性抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶，阻断鸟嘌呤核苷酸的从头合成途径^[22]。霉酚酸酯选择性作用于增殖性T、B淋巴细胞^[23]，因而霉酚酸酯显著的优点之一是肝脏、肾脏、骨髓毒性均低，适合儿科应用。虽然霉酚酸酯已经临床应用于治疗肾病综合征，但其减轻蛋白尿的机制尚未完全了解^[24]。本实验中可以观察到，肾病模型组大鼠在14 d尿蛋白增加，28 d达高峰。而霉酚酸酯组大鼠尿蛋白低于肾病模型组，28 d尿蛋白低于21 d。提示霉酚酸酯能够保护大鼠足细胞，减轻足细胞损伤，减少蛋白尿的产生，对微小病变肾病有治疗作用。

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