骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料修复周围神经缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：随着医学模式的不断发展进步，人们对于外周神经缺损的治疗以及后期康复水平提出更高的要求，这就使得以干细胞培养为基础的神经组织工程技术为神经缺损治疗提供了新策略。
目的：探讨骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料修复周围神经缺损的可行性。
方法：选取清洁级纯种新西兰大白兔50只，采用随机数字表法分为实验组与对照组，每组25只，于兔前肢桡骨中段约15 mm处造成外周神经损伤，造模后1周，实验组外周神经损伤处移植骨髓间充质干细胞联合新型神经导管复合材料，对照组外周神经损伤处移植骨髓间充质干细胞。移植后4周，取神经损伤处的神经纤维长约5 mm，进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察，对比两组再生神经组织内神经纤维的密度和直径。
结果与结论：实验组神经纤维密度明显高于对照组，神经纤维直径明显低于对照组，组间相比差异有显著性意义(P < 0.05)；实验组再生神经组织表面细胞数较多，细胞生长状态良好，体积较大，胞体发出多个突起，并且细胞之间相互连接交织成网状，其轴突较长和较粗，呈典型的神经元样细胞表现，且生长密度和状态优于对照组，可见骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料可以用于修复周围神经缺损，且效果确切。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 外周神经缺损, 骨髓间充质干细胞, 神经纤维

Abstract:

BACKGROUND: With the continuous development and progress of medical model, the treatment and rehabilitation recovery from peripheral nerve defects needs higher requirements; therefore, stem cell culture-based nerve tissue engineering technology provides a new strategy for nerve defect repair.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of combining bone marrow mesenchymal stem cells and new nerve conduits to repair peripheral nerve defects.
METHODS: Fifty New Zealand white rabbits, clean grade, were randomly divided into experimental group and control group, with 25 rabbits in each group. Animal models of peripheral nerve defects were made about 15 mm distant to the middle segment of the radius of the rabbit foreleg. At 1 week after modeling, bone marrow mesenchymal stem cells/new nerve conduit composite material was implanted into the defect in the experimental group; and in the control group, only bone marrow mesenchymal stem cells were transplantation. At 4 weeks after transplantation, a 5-mm nerve fiber was taken from the defect site, stained with hematoxylin-eosin and observed under scanning electron microscope. Density and diameter of regenerated nerve fibers were compared between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the density of nerve fibers was significantly higher in the experimental group, but the diameter of nerve fibers was significantly lower (P < 0.05). There were more cells with good growth, large size and many processes on the surface of regenerated nerve tissues in the experimental group than the control group. Moreover, in the experimental group, interconnected cells were woven into a mesh and the axons were longer and thicker, both of which were the performance of typical neuron-like cells. Taken together, the bone marrow mesenchymal stem cells/new nerve conduit composite material can be used for peripheral nerve repair and present exact achievements.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Peripheral Nerves, Wounds and Injuries, Tissue Engineering

朱德志，王伯珉. 骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料修复周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7320-7324.

Zhu De-zhi, Wang Bo-min. Combining bone marrow mesenchymal stem cells with new nerve conduits for repair of peripheral nerve defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7320-7324.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] Lee GS, Park JH, Shin US, et al. Direct deposited porous scaffolds of calcium phosphate cement with alginate for drug delivery and bone tissue engineering. Acta Biomater. 2011; 7(8):3178-3186.

[2] Zandi M, Mirzadeh H, Mayer C, et al. Biocompatibility evaluation of nano-rod hydroxyapatite/gelatin coated with nano-HAp as a novel scaffold using mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 2010;92(4):1244-1255.

[3] 胡辉.新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞用于周围神经缺损的基础研究[D].广州:南方医科大学,2013.

[4] Stagg J, Galipeau J. Mechanisms of immune modulation by mesenchymal stromal cells and clinical translation. Curr Mol Med. 2013;13(5):856-867.

[5] Han J, Koh YJ, Moon HR, et al. Adipose tissue is an extramedullary reservoir for functional hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 2010;115(5):957-964.

[6] Strong AL, Strong TA, Rhodes LV, et al. Obesity associated alterations in the biology of adipose stem cells mediate enhanced tumorigenesis by estrogen dependent pathways. Breast Cancer Res. 2013;15(5):R102.

[7] Fukushima W, Fujioka M, Kubo T, et al. Nationwide epidemiologic survey of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. Clin Orthop Relat Res. 2010;468(10): 2715-2724.

[8] Nakao N, Nakayama T, Yahata T, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells facilitate hematopoiesis in vitro and in vivo: advantages over bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Am J Pathol. 2010; 177(2):547-554.

[9] 李强,陶常波,张爱君,等.EGF刺激对脂肪间充质干细胞促血管生成作用的影响[J].中华医学美学杂志,2012,18(6):440-442.

[10] Palpant NJ, Metzger JM. Aesthetic cardiology: adipose- derived stem cells for myocardial repair. Curr Stem Cell Res Ther. 2010;5(2):145-152.

[11] 姬文晨,杨佩,张越林,等.脂肪干细胞及血管束植入法联合应用对组织工程支架体内血管化的影响[J].中国修复重建外科杂志, 2012,26( 2):129-134.

[12] Nectow AR, Marra KG, Kaplan DL. Biomaterials for the development of peripheral nerve guidance conduits. Tissue Eng Part B Rev. 2012;18(1):40-50.

[13] 胡辉,黄继锋,张伟才,等.神经营养因子体外诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞[J].华南国防医学杂志,2012,26(6): 532-535.

[14] 张伟,杨宗德,易红蕾,等.聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管和骨髓间充质干细胞构建组织工程神经[J].中国矫形外科杂志, 2011, 19(11):939-942.

[15] Takagi T, Kimura Y, Shibata S, et al. Sustained bFGF-release tubes for peripheral nerve regeneration: comparison with autograft. Plast Reconstr Surg. 2012;130(4):866-876.

[16] 程峰,郝怀勇,田和平,等.体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及凋亡的研究[J].南京医科大学学报:自然科学版,2010, 30(1): 54-58.

[17] 向杰,黄继锋,李德忠,等.新型仿生人工神经导管诱导犬周围神经损伤再生过程的组织学观察[J].中国组织工程研究, 2012, 16(21):3801-3805.

[18] 向杰,黄继锋.人工神经导管基础与临床研究进展[J].中国临床解剖学杂志,2012,30(5):587-589.

1[9] Kehoe S, Zhang XF, Boyd D. FDA approved guidance conduits and wraps for peripheral nerve injury: a review of materials and efficacy. Injury. 2012;43(5):553-572.

[20] 万志涛,殷义霞,王永红,等.PNGF复合材料的神经生长因子缓释性能[J].武汉理工大学学报,2010,32(12):19-21.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年4月至2015年4月在菏泽市牡丹人民医院实验室进行。

1.3 材料标准单笼单独饲养的新西兰大白兔52只(2只用于细胞培养，50只用于造模)，清洁级，雌雄不限，4-6个月龄，体质量2.5-3.0 kg，由山东省立医院动物中心提供，采用随机数字表法将50只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组，每组25只。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离与培养 2只实验兔肌注速眠新Ⅱ号联合氯胺酮(速眠新Ⅱ号与氯胺酮配比度为3︰2)复合麻醉，给药量为0.25 mL/kg。麻醉生效后，穿刺部位碘伏消毒，双膝关节屈曲，18号腰穿针接5 mL注射器内含 0.2 mL肝素钠(100 U/mL)于胫骨平台穿刺入胫骨髓腔后，分别于两侧抽取骨髓血各约5 mL。采用全骨髓贴壁培养筛选法分离培养骨髓间充质干细胞。骨髓血用PBS洗涤2遍，弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液重悬，吹打均匀后行细胞计数。以2×10⁵/cm²密度接种于培养瓶中，添加适量完全培养基，置 37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度孵箱中培养。48 h后首次换液，以后间隔 2 d换液，待细胞90%融合时传代。PBS清洗2遍后，倒尽，使用0.25%胰酶消化2 min后离心(1 000 r/min×3 min)，去上清液，向离心管内加完全培养基，吹打均匀后分装，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3传代后继续培养，倒置相差显微镜观察细胞形态。消化传代扩增纯化至第3代，细胞数达到10⁷数量级备用。

1.4.2 新型神经导管复合材料的制备^[3] 首先以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础，设计并合成了RGD多肽接枝的高分子聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)(PRGD)，以乙酸乙酯为溶剂，分别加入浓度为85%、相对分子质量为10×10³-25×10³的聚乳酸(PDLLA)，浓度为10%的PRGD，浓度为5%、平均粒径小于500 nm的β-磷酸三钙(β-TCP)以及微量神经生长因子(NGF)，经超声波分散，磁力搅拌，采用溶剂挥发法制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合膜。新型神经导管复合材料见图1。

1.4.3 骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料的结合新型神经导管复合材料使用PBS漂洗数次，去除表面粉末后使用体积分数为75%乙醇浸泡30 min，用含体积分数为20%胎牛血清的培养基预湿24 h，增加细胞间黏附。取第3代或者第4代细胞，用胰酶消化，在旋转瓶中用120 mL完全培养基重悬，以5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于5 mm×5 mm× 12 mm的新型神经导管复合材料中浸润培养7 d。

1.4.4 扫描电镜下观察新型神经导管复合材料表面细胞生长状况将无菌的新型神经导管复合材料剪成12孔培养板孔洞大小，将其与骨髓间充质干细胞共同置于12孔培养板中，于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养。将培养7 d后的材料取出，PBS冲洗3次，体积分数2.5%戊二醛4 ℃固定1 h^[4-5]，体积分数30%，50%，75%，80%，90%，100%叔丁醇脱水，前4级脱水各1次，每次10 min，后2级脱水各2次，每次10 min。保留样本内叔丁醇-20 ℃冰冻冷藏4 h，干燥2 h，喷金，在扫描电镜下观察材料表面细胞生长状况^[6]。

1.4.5 周围神经缺损造模新西兰大白兔于实验室适应性喂养2周后，采用复合麻醉，麻醉成功后将家兔固定、处理皮毛，手术部位取右前肢尺桡骨中段神经，常规消毒、铺单，于右前肢尺桡骨中段前内侧做纵行切口，约2 cm，向外侧翻开，依次切开皮肤、筋膜，钝性分离肌肉，显露桡骨中段神经，拨离骨膜，确定神经截点，长约1 cm，微型电动摆锯进行神经截断，无菌生理盐水冲洗创面，止血后，逐层缝合。

1.4.6 细胞与材料复合物移植造模完成后1周，进行材料移植，实验兔肌注速眠新Ⅱ号联合氯胺酮复合麻醉，生效后，常规固定、脱毛、备皮、消毒、铺单。术野碘伏消毒，于右前肢尺桡骨中段造模切口再次做纵行切口，约 2 cm，依次切开皮肤、筋膜，钝性分离肌肉，向外侧翻开，显露神经损伤处，去除肉芽组织，对照组将胶原纤维与第3代骨髓间充质干细胞复合物植入到神经损伤处，实验组将胶原纤维和骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料植入到神经损伤处，肌肉包裹覆盖，缝合筋膜、皮肤。植入的干细胞量约0.3 mL，数量约1×10⁷。实验兔术后给予头孢唑啉钠肌注，50 mg/kg，1次/d，连续3 d。术后实验兔单笼喂养，不限制活动。

1.5 主要观察指标移植后4周，再次取材，方法同前，取神经损伤处的神经纤维长约5 mm，进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察，对比两组再生神经组织内神经纤维的密度和直径。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0版统计软件对取得的数据进行分析，计量资料采取t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

外周神经组织缺损是目前神经外科十分常见且棘手的疾病，近年来发病率逐年增加，其治疗困难、并发症多、预后不理想等给医生、患者以及患者家属带来了极大的挑战，同时也给社会和家庭带来沉重的经济负担^[7]。外周神经的病因多样，通常由于严重创伤、感染以及肿瘤因素引起神经组织失去连续性，使得机体生理功能无法得到正常运转，对人体的健康造成了严重危害^[8-9]。对于神经组织缺损的治疗，目前临床上多以自体移植为主，自体腓肠神经是主要的神经来源，自体神经移植虽然可以避免排斥反应，但是可导致诸如供应区疼痛、感染、出血等多种并发症，且自体神经移植仍存在供体来源有限、供区感觉及运动功能受损等弊端，因此探索周围神经损伤修复新方法具有重要意义^[10-11]。国外学者对周围神经修复的组织工程技术研究较多，有学者用神经导管桥接神经的断端，使再生的轴突沿导管生长，修复损伤或缺损的神经，现已取得较好疗效。国外还有研究报道，骨髓间充质干细胞联合新型神经导管复合材料应用于临界大小的神经组织缺损效果较以往传统治疗方法效果较佳，可能是一种代替传统治疗方法的理想治疗方式。骨髓间充质干细胞是一种来源于骨髓组织，分布十分广泛的细胞，具有良好的分化潜力，可以通过诱导分化出多种细胞类型，且骨髓间充质干细胞来源丰富，取材容易，体外培养扩增迅速，连续传代增殖能力无明显减弱，极易达到移植的理想浓度。导管材料作为人工细胞外基质为细胞提供赖以黏附、生长、分化和增殖的场所，有利进行正常新陈代谢。目前神经导管材料分为生物型神经导管、人工合成导管和复合组织导管3种。人工合成导管经历了从非生物降解型到生物降解型的转变，硅胶管是临床上应用最广泛的人工合成非降解材料导管，价格便宜，永久性好，制作时可根据需要调整内径的大小，但硅胶管植入人体后以异物形式在原位存留，需要二次手术取出，否则将造成慢性神经卡压症状，可能导致神经功能的延迟恢复，还有少数病例会对硅胶产生强烈的排斥反应，因此硅胶材料已逐渐淡出视线，而可生物降解聚合材料的开发正慢慢受到关注。人们希望通过组织工程技术找寻合适的神经支架材料替代自体神经，天然高分子材料亲水性、细胞亲和性较好，但降解性能和力学性能较差，而合成高分子材料降解性能、力学性能较好，但亲水性能较差，细胞亲和性差。理想的周围神经再生支架不仅具有良好的力学性能，而且还要有良好的细胞亲和性，植入时最好能诱导神经细胞快速黏附与生长。

许多研究表明，神经再生过程中，断端的神经再生和祌经营养因子、神经生长因子等作用关系密切，当神经缺损超过一定距离后，营养物质供应缺乏，可导致远端和近端不能重新连接。据此，有学者提出重建神经再生微环境的设想，即将有利于祌经再生的胞外基质以各种形式充填于神经导管中，以促进神经再生，新型神经导管复合材料便应运而生。

新型神经导管复合材料是在仿生学原则下指导合成的一种以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽接枝聚制成的仿神经材料，再生能力强的同时排斥反应较轻，是目前新兴的神经损伤治疗材料，其本身或降解产物氨基酸、乳酸等是参与人体正常代谢的物质，动物实验证明没有细胞毒性，不会引起炎症和免疫排斥反应，具有良好的生物相容性^[12-13]。该材料中加入的物理共混粒径细化的β-磷酸三钙既可以增强材料的强度和韧性，又可以中和聚乳酸降解产生的酸性物质，减轻酸性环境引起的无菌性炎症。有文献指出，以神经基底膜的结构与组成分析研究为基础合成RGD多肽接枝的高分子聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)，并在此基础上再行添加聚乳酸、β-磷酸三钙和神经生长因子制成了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子材料，得到的新型导管复合材料及其代谢产物与人体组织相似，其降解速率与组织再生速度相匹配，该导管只起暂时性支撑作用，当产生的细胞外基质足以给细胞提供自然生长环境时，导管就会逐渐降解直至被完全吸收。加入的聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子是神经系统中最重要的活性因子，对神经系统的正常发育及促进再生等方面均有重要的生物学作用，材料中持续释放的聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子可诱导神经纤维定向生长，促进神经再生。新型神经导管复合材料是目前新型的神经仿生学材料，神经母细胞可以在这种材料上可以实现良好的黏附、增殖及迁移，该材料还能为神经母细胞的生长提供良好的机械支撑作用^[14-15]。

本实验采用骨髓间充质干细胞与新型神经导管复合材料移植修复兔神经缺损，并以单纯移植骨髓间充质干细胞作对照，术后4周实验组的神经纤维密度明显高于对照组 (P < 0.05)，实验组的神经纤维直径明显低于对照组(P < 0.05)，差异均有显著性意义，说明实验组神经纤维生成良好，融合效果确切，纤维密度较高^[16-17]，下一步通过更为广泛深入的研究以确切了解此种治疗方式治疗效果^[18-20]。此外，本次实验还发现骨髓间充质干细胞联合新型神经导管复合材料治疗可以显著提高神经再生存活率，较以往治疗方法更好，效果更佳，同时骨髓间充质干细胞联合新型神经导管复合材料的神经密度亦提升明显，对患者生活质量提高有重要帮助。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程