杜仲醇提取物对兔下颌牵张成骨的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (42): 6725-6729.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.001

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杜仲醇提取物对兔下颌牵张成骨的影响

蒋校文，张翼，范晓升，邓轩

郴州市第一人民医院口腔科＆南华大学转化医学研究所，湖南省郴州市 423000

收稿日期:2015-07-14 出版日期:2015-10-08 发布日期:2015-10-08
作者简介:蒋校文，男，1981年生，湖南省东安县人，汉族，2010年华西口腔医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事牵张成骨的机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81301651)课题名称：硫化氢气体信号体系通过缺氧诱导因子促进牵张成骨的实验研究；郴州市科技局项目(CZ2013067)课题名称：杜仲联合bFGF促进牵张成骨及其机制研究

Effects of eucommia alcohol extract on a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis

Jiang Xiao-wen, Zhang Yi, Fan Xiao-sheng, Deng Xuan

Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Chenzhou & Institute of Translation Medicine on University of South China, Chenzhou 423000, Hunan Province, China

Received:2015-07-14 Online:2015-10-08 Published:2015-10-08
About author:Jiang Xiao-wen, M.D., Associate chief physician, Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Chenzhou & Institute of Translation Medicine on University of South China, Chenzhou 423000, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301651; the Project of Chenzhou Municipal Department of Science and Technology, No. CZ2013067

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前牵张成骨由于治疗周期长、并发症较多成为临床广泛运用的瓶颈，不能满足临床推广需要。
目的：以兔下颌骨牵张动物模型为实验平台，观察全身运用杜仲醇提取物对牵张新骨再生的影响。
方法：24只新西兰大白兔随机均分为对照组及实验组，建立兔下颌单侧牵张模型，牵张速率为每12 h 1 mm。在牵张期2次/d，实验组及对照组分别予以灌胃杜仲醇提取物及等量生理盐水，牵张结束后6周处死动物收集标本行成骨检测。
结果与结论：两组动物牵张间隙内均可观察到新骨生成。牵张成骨结束后6周下颌骨CT图像显示实验组兔牵张间隙舌侧骨皮质生成良好，颊侧骨皮质连续，牵张间隙可见均匀骨质生成桥接；下颌骨核素扫描显示实验组兔下颌骨牵张间隙表现为核浓集，强度明显强于对照组；X射线显示实验组牵张间隙完全桥接，新生成骨质密度均匀，可见上下侧骨皮质形成良好；Micro-CT图像显示实验组骨皮质部分形成较好，骨小梁分布较为均匀，骨小梁明显较对照组粗壮，对照组部分区域仍有囊性变；Micro-CT微结构参数检测显示实验组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和连接密度均显著高于对照组；组织学观察显示与对照组比较，实验组牵张间隙中有较为成熟的束状骨，骨小梁方向较为规律。实验结果显示全身运用杜仲醇提取物可有效促进兔下颌快速骨牵张的新骨再生。

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 杜仲, 兔, 下颌骨, 牵张成骨, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Long course of treatment and complications limit the extensive application of distraction osteogenesis, which cannot meet the clinical requirements.
OBJECTIVE: To investigate the effect of general administration of eucommia alcohol extract on new bone regeneration based on the rabbit model of mandibular distraction osteogenesis.
METHODS: Twenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental group and control group. Unilateral mandibular distraction osteogenesis model was established by 1 mm/12 h distraction protocol. During the distraction period, the rabbits in the experimental group were intragastrically administered with eucommia alcohol extract and the control animals received the same amount of physiological saline, respectively. Six weeks later, the animals were sacrificed for osteogenic testing.
RESULTS AND CONCLUSION: New bone formation was observed in the distracted gap in both groups. However, the amount, mineralization and biomechanical strength of new regenerated bone in the experimental group were obviously greater than those in the control group by histological observation, dual energy X-ray
absorptiometry, micro-CT and biomechanical test. General administration of eucommia alcohol extract can markedly promote distraction osteogensis in rabbit mandibular osteodistraction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Rabbits, Mandible, Eucommiaceae, Tissue Engineering

蒋校文，张翼，范晓升，邓轩. 杜仲醇提取物对兔下颌牵张成骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(42): 6725-6729.

Jiang Xiao-wen, Zhang Yi, Fan Xiao-sheng, Deng Xuan. Effects of eucommia alcohol extract on a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(42): 6725-6729.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 24只实验兔能够耐受整个实验过程，正常进食，健康存活。牵张结束后表现出明显的右侧反牙合及下颌中线明显左侧偏斜等特征，全部进入结果分析。
2.2 CT扫描观察通过下颌CT数据重建处理发现，右侧下颌骨牵张伸长成功，牵张间隙可见新骨生成。对照组牵张间隙有新骨生成，舌侧骨皮质生成良好，颊侧骨皮质不连续，牵张间隙中线骨质未见桥接。实验组牵张间隙舌侧骨皮质生成良好，颊侧骨皮质连续，牵张间隙可见均匀骨质生成桥接(图1)。

2.3 核素扫描观察在牵张侧下颌骨的核素扫描发现实验组大多数下颌骨牵张间隙表现为核浓集，而且强度明显强于对照组(图2)。

2.4 X射线观察 X射线片结果显示，牵张6周后两组动物下颌骨标本牵张间隙内均可观察到不同程度的新骨生成。在对照组可见牵张间隙有大量与牵张方向平行的新生骨小梁，但在牵张间隙中间并为完全桥接，可见线性低密度影。实验组牵张间隙完全桥接，新生成骨质密度均匀，而且可见上下侧骨皮质形成良好(图3)。

2.5 三点弯曲力学测试结果实验组下颌牵张新生骨力学强度值(312.40±18.93)明显强于对照组(205.05±33.51)，差异有显著性意义(F=46.462，P=0.000)。

2.6 骨密度测试双能X射线骨密度测量发现，对照组牵张间隙骨密度为(0.12±0.01) g/cm²，骨矿含量为(0.09±0.02) g。实验组牵张间隙骨密度为对照组的1.5倍(P < 0.001)，骨矿含量为对照组的1.56倍(P < 0.001)。

2.7 Micro-CT观察通过重建牵张间隙骨质横断面图片发现实验组骨皮质部分形成较好，而骨小梁分布较为均匀，骨小梁明显较对照组粗壮，而对照组中骨小梁较为纤细，切部分区域仍有囊性变(图4)。对照组的骨小梁微结构参数(图5)分别为骨体积分数(BV/TV)(33.53±4.68)%、骨小梁厚度(Tb.Th)(0.14±0.03) mm、骨小梁数量(Tb.N)(1.95± 0.59) mm^-1、骨小梁间隔(Tb.Sp)(0.28±0.05) mm和连接密度(Conn. D)(8.74±1.47) mm^-3。而实验组中参数骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和连接密度分别是对照组的1.37倍(P=0.002)、1.78倍(P < 0.001)、1.48倍(P=0.019)和1.35倍(P=0.024)。

2.8 组织学观察牵张间隙中线区高倍镜视野苏木精-伊红染色观察发现对照组牵张间隙组织中仍有大量不规则纤维结缔组织混杂，实验组牵张间隙中有较为成熟的束状骨，骨小梁方向较为规律(图6)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2013年9月至2014年11月在南华大学转化研究所完成。

1.3 材料

杜仲醇提取物对兔下颌牵张成骨的影响实验所用药品、仪器设备：
药品、仪器设备	来源
盐杜仲	北京同仁堂
纯钛牵张器	四川大学生物工程实验室制备
核素扫描仪(Skylight)	荷兰Phlips
Gendex X射线机	美国Gendex公司
双能X射线骨密度测量仪	美国GE公司
万能材料测试仪	美国Instron
micro-CT	瑞士Bassersdorf

实验动物：健康成年新西兰白兔24只，体质量2.5-3.5 kg，雌雄不限，由南华大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(湘)2010-0006，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
1.4 实验方法

1.4.1 杜仲醇提取物制备参考郭延伟等^[11]方法。盐杜仲 2 g (北京同仁堂)，加甲醇至15 mL，室温振荡1 h，静置过夜后，15 000 r/min离心10 min，弃沉淀，真空浓缩，再加水至15 mL溶解剩余物后，经0.22 μm膜过滤，-20 ℃保存。

1.4.2 动物分组和建模参考Jiang等^[5-6]方法。24只成年新西兰白兔单笼适应性圈养1周后随机摸球法均分为对照组和实验组。所有兔在戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉注射麻醉成功后，沿兔右侧下颌下缘行约2 cm横行切口，暴露右侧下颌骨体，于第1前磨牙与颏孔间行垂直骨切开术(术中拔出远心切牙牙髓和近心短牙根组织)并安置自制内置纯钛牵张器，建立兔下颌单侧牵张模型。分层缝合创面，术后使用青霉素(4×10⁴U/d)预防感染3 d。延迟期5 d，牵张速率1 mm/次，频率1次/12 h，共5 d后进入固定期。

1.4.3 实施干预在牵张开始每天予以实验组杜仲醇提取液(10 mL/kg)灌胃2次，对照组动物则予以等量的生理盐水灌胃，牵张结束后1周后停止灌胃干预。

1.4.4 标本获取及分析方法在固定期第4周处死动物前 3 h通过耳缘静脉注射锝[⁹⁹Tc^m]亚甲基二膦酸盐 (7.4 MBq/kg)。

麻醉成功后将兔仰卧位置于仪器上完成颌面部CT平扫以观察下颌骨牵张间隙新骨生成情况。过量麻醉处死动物，迅速解剖双侧下颌骨，剥离附着在下颌骨的肌肉等软组织后将下颌骨平放于核素扫描仪上以获取牵张间隙的核素信号强度。取牵张侧下颌骨，至于中性甲醛室温下固定24 h后用Gendex X射线机行X射线片观察牵张间隙新骨生成(电压46 kV，电流7 mA，曝光时间0.06 ms)，随后进行双能X射线骨密度测量(小动物模式)。最后每组随机6个标本拆除牵张器后利用万能材料测试仪行牵张间隙新骨3点弯曲力学测试。剩余标本沿牵张间隙外侧5 mm处骨质切开，行micro-CT扫描后(电压70 kV，电流114 mA，500 ms整合时间)，用14.5%EDTA溶液室温下脱钙20-30 d，经石蜡包埋后按4 μm厚切取组织学切片行苏木精-伊红染色。

1.5 主要观察指标两组兔下颌牵张间隙影像学、骨密度、核素和生物力学指标观察结果。

1.6 统计学分析用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析处理，结果用x(_)±s表示。对照组与实验组间行单因素方差分析，当P < 0.05时组间差异有显著性意义。

讨论

杜仲在祖国中医药史上占有重要地位，其内含有的多种有效成分使其在降血压、补肝肾、强筋骨等方面具有显著疗效^[12-14]。国内学者在防治骨质疏松和调节成骨细胞等方面做过实验尝试^[15-16]。郭延伟等^[11]发现杜仲醇提取物能够促进兔脂肪干细胞增殖，并能够刺激其碱性磷酸酶升高活性升高及促进钙化结节形成。张贤等^[17]发现杜仲提取物能通过经典Wnt信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化^[1-2]，而Wnt通路被证明在牵张成骨过程中发挥着重要作用。Zhang等^[18-19]利用骨质疏松大鼠模型研究发现，杜仲提取物能够通过雌激素受体β刺激成骨细胞活性、促进前成骨细胞的增殖和定向分化、抑制破骨细胞功能、促进护骨蛋白的表达等抑制骨质疏松。崔永峰等^[20]学者通过兔胫骨骨缺损模型的观察发现杜仲浓缩液能够促进骨折愈合，他们认为杜仲中有效成分能够促进局部血管扩张，有利于间充质细胞成骨分化；同时杜仲能够促进成骨细胞的分化和增殖；杜仲中亦含有15种微量元素，为骨质新生提供必要元素。牵张成骨是一种同时具有骨折修复及胚胎骨发育特点的成骨方式，其具体的成骨机制尚未完全阐明，目前尚未见到使用杜仲在牵张成骨方面的细胞或活体实验研究报道。

牵张成骨的主要缺点是治疗周期过长，需要长期牵张器固定维持牵张间隙的力学强度，由于长期的牵张器滞留容易带来钉道感染、意外骨折及成骨不良等并发症，同时对于一些如肿瘤放疗后、老年患者等成骨不良条件下的患者具有狭窄的适应证^[3]。近年来牵张成骨的手术方式及器械的改进并没有带来实质性的进步，学者们仍热衷于使用生长因子来促进牵张成骨^[1-2^，^7]，主要目的就是为加速牵张间隙新骨的生成、加快骨痂的矿化，进而缩短治疗周期，提高该项技术的临床使用范围。

作者通过随机动物实验设计单侧下颌骨牵张模型为平台，使用2 mm/d(1 mm/12 h)的快速牵张速率，是为了模拟成骨不良条件的牵张成骨模型，在作者前期的试验中使用该牵张频率成功构建了成骨不良的牵张动物模型^[5-6]。在本实验中通过灌胃杜仲醇提取物作为干预手段，通过多种检测手段发现，实验组牵张间隙生成新骨明显优于对照组。前期学者们通过细胞体外实验发现杜仲醇提取物中杂质含量较少，成骨促进作用明显优于水提取物^[11]，故本实验采用醇提取物。从影像学表现发现实验组骨小梁完全桥接整个牵张间隙，骨密度测量及核素扫描说明提示治疗组牵张间隙血运丰富及矿化代谢活跃、新骨生成矿化含量明显高于对照组。组织学及三维CT发现骨小梁较对照组成熟规律。骨小梁微结构参数中骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和连接密度分别代表骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目及连接密度，说明治疗组骨小梁粗壮，分布更为紧密，三维空间构型能够承受优于对照组的机械力，并通过力学测试证实牵张间隙的骨质能够承担高于对照组的弯曲力量。说明实验组动物在杜仲提取物的作用下新骨生成的质和量明显优于对照组，能够承担一定的临床咬合力，能够达到缩短牵张成骨的治疗周期的目的。作者结合本实验的初步实验结果及以往学者对杜仲醇提取物的研究推测：杜仲促进成骨的机制是多方面的，其促进局部血运的改善，加速局部营养供给，促进成骨细胞活性及间充质干细胞的增殖分化及提供必要的微量元素可能是其促进成骨的机制之一，但这仍需要进一步的实验验证。

本实验仍有一些不足。鉴于杜仲醇提取物中有效成分较多，而不仅杜仲不同部位的成分不同，祖国各地生长的杜仲中各种成分的含量亦有地域差别^[12]，目前尚不明确主要成骨有效组分，在制取醇提取物时不能保证每只动物接受完全等量的原药。下一步实验中应该通过细胞实验，筛选出有效成骨主要成分，予以提纯量化，达到实验条件的一致性，并通过分子生物手段在基因和蛋白层面探讨杜仲有效成分在促进牵张成骨的具体机制，最终在活体动物模型中验证。

通过本动物实验结果，全身应用杜仲醇提取物可促进牵张成骨新骨再生，为临床探索使用杜仲等中药组分来提高成骨功效，缩短治疗周期提供了一定的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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