Caspase抑制剂联合Cocktail蛋白酶抑制剂对胰岛细胞凋亡的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关于联合应用Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂在胰岛细胞分离纯化过程中对胰岛细胞的影响的研究还较少有报道。
目的：比较Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂对胰岛细胞在分离纯化及培养过程中的保护作用。
方法：取新生猪，体外分离、纯化和培养猪胰岛，培养24 h后分为3组：①空白对照组。②消化时加抑制剂组仅在消化过程中加入Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂。③消化及培养时加抑制剂组在消化及培养的过程中均加入Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂。AO-EB染色定性观察细胞形态及凋亡情况，流式细胞术定量检测细胞活力及凋亡。
结果与结论：空白对照组β细胞所占百分比为66.91%，消化时加抑制剂组为84.58%，消化及培养时加抑制剂组为87.15%；空白对照组活细胞、凋亡细胞及死亡细胞的比例分别为56.52%、16.15%、21.25%，消化时加抑制剂组分别为62.27%、14.66%、14.47%，消化及培养时加抑制剂组分比为73.09%、6.83%、10.28%。结果表明，在消化以及体外培养的过程中均加入Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂可明显减少细胞的损失，并且可以增加胰岛β细胞的百分比。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 胰岛细胞, Caspase抑制剂, Cocktail蛋白酶抑制剂, 胰岛

Abstract:

BACKGROUND: Currently, there are few reports on the effects of Caspase inhibitors combined with Cocktail protease inhibitors on isolation and purification of islet cells.
OBJECTIVE: To explore the effects of Caspase inhibitors and Cocktail protease as protectors on islet cells during isolation and purification process.
METHODS: New-born pigs were selected to separate, purify and culture the islet cells, and after 24 hours of culture, the specimens were divided into three groups: blank control group, experimental group A (Caspase inhibitors and Cocktail protease were added only during digestion process), and experimental group B (Caspase inhibitors and Cocktail protease were added both during digestion and culture processes). AO-EB staining was used to qualitatively observe cell morphology and apoptosis. Flow cytometry was employed to quantitatively detect cell viability and apoptosis.
RESULTS AND CONCLUSION: Percentages of β cells were 66.91% in blank control group, 84.58% in the experimental group A, and 87.15% in the experimental group B. The proportions of living cells, apoptotic cells and
dead cells were 56.52%, 16.15%, 21.25% in the blank control group, 62.27%, 14.66%, 14.47% in the experimental group A, and 73.09%, 6.83%, 10.28% in the experimental group B, respectively. These findings indicate that in the process of digestion and culture in vitro, Caspase inhibitors and Cocktail protease inhibitors can both obviously decrease the loss of cells, and increase the percentage of islet beta cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Caspases, Islets of Langerhans, Apoptosis

中图分类号:

R318

田婷婷，赵珊珊，王群，叶斌. Caspase抑制剂联合Cocktail蛋白酶抑制剂对胰岛细胞凋亡的保护[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5966-5971.

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图/表（结果） 1

2.1 胰岛细胞的数目胰岛细胞培养至第6天时，收集细胞进行计数，空白对照组、消化时加抑制剂组、消化及培养时加抑制剂组3组细胞胰岛其数量平均约分别为(6720±967.3)，(8 640±1 109.67I)，(10 532±1 265.7)IEQ，各组细胞数目差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.2 细胞形态学观察实验分组同上，AO-EB染色后在荧光显微镜下观察，发现空白对照组细胞团体积较小，且其内桔红色荧光较另外2组细胞强，消化及培养时加抑制剂组细胞团体积较大，其内桔红色荧光较另外两组均弱(图1)，综上，可定性推断出消化及培养时加抑制剂组活细胞数目较其他两组多。
2.3 流式细胞术检测胰岛β细胞百分比根据流式细胞术的结果显示空白对照组β细胞所占百分比为(60.21± 7.87)%，消化时加抑制剂组为(79.56±6.23)%，消化及培养时加抑制剂组为(85.91±9.07)%，空白对照组与消化时加抑制剂组及消化和培养时加抑制剂组的差异均有显著性意义(P < 0.05)；消化时加抑制剂组、消化及培养时加抑制剂组2组之间未见明显差异(图2)。
2.4 流式细胞数检测细胞的凋亡状况空白对照组活细胞及凋亡细胞的比例分别为(50.78±6.52)%，(12.56 ±3.15)%，消化时加抑制剂组分别为(63.56±7.45)%，(10.25 ±0.66)%，消化及培养时加抑制剂组分比为(69.56±8.24)%，(6.76± 1.12)%，空白对照组活细胞的比例最少，与2组加抑制剂组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，消化及培养时加抑制剂组细胞凋亡细胞比例最少，与空白对照组细胞比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。
2.5 胰岛细胞的功能变化空白对照组、消化时加抑制剂组、消化及培养时加抑制剂组3组的新生猪胰岛细胞在 2.5 mmol/L低糖和25 mmol/L高糖的刺激条件下葡萄糖刺激指数为1.95±0.19(SI>1.8)、2.99±0.28(SI>1.8)、3.01±0.08 (SI>1.8)，说明胰岛细胞的活性及功能良好，对葡萄糖的刺激具有较为敏感的应答能力，空白对照组与其他两组胰岛细胞的SI比较差异具有差异性意义(P < 0.05)，但加抑制剂2组的SI之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

糖尿病是因胰岛素绝对或相对缺乏引起的以糖代谢紊乱为主要表现的代谢病，引起的各种急、慢性并发症是人类致死致残的重要原因之一，已成为继心血疾病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病。其中1型糖尿病(T1DM)是一种由T细胞介导的自身免疫性疾病，引起胰岛素分泌障碍、体内胰岛素绝对缺乏而导致血糖持续升高出现的糖尿病，以胰岛β细胞被破坏为特征，缺乏有效的治愈方法，但可通过胰腺或胰岛细胞的移植来进行治疗^[1-4]。胰岛移植是一种将胰岛细胞输注到肝门静脉中的微创手术，1973年Kemp等首次在实验性糖尿病模型中成功实施^[5]。从1型糖尿病的初步临床试验结果发现仅有10%的患者在胰岛移植后1年可以不依赖胰岛素^[6]。自Edmonton方案成功后，胰岛移植受到了世界的瞩目，在总结了全球胰岛移植研究成果的基础上改进了移植的方法和免疫抑制方案，为1型糖尿病患者带来了治愈的希望^[7]。然而，胰岛移植的成功仍面临诸多挑战，主要是在胰岛分离和早期移植后的细胞损伤。高纯度、高产量及高活率的胰岛是进行深入研究的前提，直接影响胰岛移植物的存活以及临床移植手术的成败^[8-9]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)家族是细胞凋亡信号转导激活级联反应中的中心执行者，其中最为重要的是作用于上游的启动Caspase-8和作用于下游的效应酶Caspase-3。它激发了以蛋白酶组成的级联反应，平时以无活性的酶原形式存在^[10]。其中Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路^[11]。Caspase-3酶原有两个酶切位点：Asp28-Ser29，Aspl75-Serl76，有活性的Caspase-3由P17和P12两个亚基组成，是β细胞凋亡途径的关键性信号酶^[12]。给予hFas/bTC1细胞抗Caspase-3物质阻断其活性，能抑制Fas激发的细胞凋亡。Caspase-3被上游的蛋白酶如Caspase-6、8、CTL来源的颗粒酶B所激活后，可裂解多种底物，发挥效应酶的作用。在白细胞介素1β与干扰素γ诱发非肥胖糖尿病鼠β细胞凋亡的实验发现，Caspase-3激活与Fas/FasL相互作用增强有关^[13]。Caspase-3是Caspase家族中的一个主要效应因子，它的激活与过度表达都可引起细胞凋亡^[14]。 Cocktail 蛋白酶抑制剂能够保护蛋白质免受内源性蛋白酶的消化，它可抑制丝氨酸蛋白酶、胱氨酸酶、天冬氨酸蛋白酶、钙蛋白酶，当有EDTA时还可以抑制基质金属蛋白酶；胰蛋白酶是一种能够将胰岛离散成细胞碎片和单个细胞的一种丝氨酸蛋白酶^[15]，研究证实，在胰岛分离的过程中加入蛋白酶抑制剂，如Pefabloc，Trasylol，Ulinastatin (UTI)，可以增加胰岛产量^[16-23]。基质金属蛋白酶组织抑制剂1对过氧化氢诱导的胰岛β细胞株RINm5F的凋亡有一定的保护作用^[24]。周立娜等^[25]的研究发现基质金属蛋白酶组织抑制剂1干预组Caspase-3活性较细胞因子刺激组下降了38%，说明基质金属蛋白酶组织抑制剂1干预能降低Caspase-3活性，可在一定程度上保护胰岛β细胞抵抗细胞因子诱导的凋亡。有研究证明链霉素诱导的糖尿病模型中钙蛋白酶的活性会增加^[26]。然而，问题是以上蛋白酶抑制剂没有削弱消化酶的活性或者没有提高分离胰岛的质量。本研究拟在供体胰腺消化过程中加入广谱caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂，研究通过早期抑制半胱天冬氨酸蛋白酶原、丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶、胱氨酸蛋白酶以及基质金属蛋白酶的活化，是否能减少胰岛在分离、纯化过程中的损伤、丢失，最终提高胰岛的产量及质量。继而建立更完善的移植胰岛分离、纯化程序，获得好的胰岛移植疗效，并为实现“一对一胰岛移植”治疗糖尿病奠定基础；这也能够一定程度上缓解供体匮乏的问题。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2014年11月在中南大学湘雅三医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：3-5 d的新生猪9只，体质量0.9-2.0 kg，由湖南赛诺生物科技有限责任公司提供，该动物实验得到了湘雅三医院伦理委员会的批准。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶与Cocktail蛋白酶抑制剂联合对胰岛细胞凋亡的保护实验用主要试剂：
试剂	来源
完全培养基(HAM^，S/F-10)、D-Hank^，s液	Hyclone公司，美国
V型胶原酶(Collagenase V)	Sigma公司，美国
猪血清	北京鼎国昌盛生物技术有限公司
谷氨酰胺	Gibco公司，美国
青霉素、链霉素	华北制药
Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂	上海生工生物工程有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 胰岛的分离、纯化、收集将出生3-5 d的新生猪麻醉后，洗净体表、固定、碘伏消毒后无菌状态下剖腹胰腺组织，将胰腺组织用V型胶原酶适度消化后终止，洗涤；将细胞悬液加入至完全培养基(FAM’S/F-10，含体积分数10%的猪血清、0.1%谷氨酞氨、青霉素80 U/mL，链霉素100 U/mL)的培养皿后置于37 ℃、体积分数5% CO₂及95%空气培养箱内进行培养。培养基及培养皿于胰岛细胞分离纯化后第1天更换，之后每隔1 d换1次。获得的胰岛细胞于分离纯化后培养至第6天时收集细胞并计数做相关检测。

1.4.2 实验分组将供体猪分为3组(空白对照组、消化时加抑制剂组、消化及培养时加抑制剂组)，每组3只，再取得供体猪的胰腺后分别用以下不同方法进行处理。细胞培养至第6天时观察细胞状态。

分组处理方法：
组别	处理
空白对照组	培养及消化过程中不加入Caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂
消化时加抑制剂组	仅在消化时中加入Caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂
消化及培养时加抑制剂组	消化以及体外培养时均入Caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂

1.5 主要观察指标

1.5.1 胰岛细胞计数每次于细胞悬液中取出50 μL的样本，镜下计数细胞团并重复取样3次，按照下列公式计数胰岛：胰岛产量=(3次胰岛数值之和/3)×[样本总量(mL)/50 μL]。

荧光显微镜下观察细胞胰岛细胞团染色情况：采用吖啶橙(AO)、溴乙锭(EB)双染法染色，细胞染色后活细胞(VN)为核染色质着绿色并呈正常细胞结构；早期凋亡的细胞(VA)核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状；非凋亡的死亡细胞(NVN)核染色质着桔红色，呈正常细胞结构。

1.5.2 流式细胞术检测胰岛β细胞的活力及凋亡情况分离后用Accutase 酶消化，10 min后加入FBS终止消化。37 ℃条件下培养基孵育60 min使单细胞状态恢复，PBS洗涤细胞后将单细胞悬浮液放于3 mmol/L Newport Green以及0.2 nmol/L Tetramethylrhodamine ethyl ester(TMRE) 37 ℃条件下孵育45 min，洗涤之后加入1 g/L PI 4 ℃孵育15 min。将细胞悬浮液用流式细胞仪(Beckerman FC500)分析。

1.5.3 胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能空白对照组、消化时加抑制剂组、消化及培养时加抑制剂组3组胰岛细胞培养至第6天时，分别提取6 000 IEQ的细胞悬液自然沉淀6 min后吸出细胞，用含2.5 mmol/L低糖培养液(Hyclone培养基)洗涤2次并孵化细胞于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱1 h，取出细胞悬液让其自然沉淀6 min，每组胰岛细胞平均分成2份，每份再分成3个平行孔，分别加入2 mL含2.5 mmol/L低糖培养液(Hyclone培养基)及2 mL含25 mmol/L高糖培养液(Hyclone培养基)于6孔培养皿内，放入37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱内再培养2 h后，离心取上清液，放于-20 ℃冰箱内保存，最后统一送至本院内分泌科实验室通过化学发光法来检测胰岛素含量。葡萄糖刺激指数(Stimulation index，SI)=25 mmol/L葡萄糖培养时的胰岛素释放量÷2.5 mmol/L葡萄糖培养时的胰岛素释放量。SI >1.8代表胰岛细胞的功能良好。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胰岛移植是一种具有发展潜力的有效治疗糖尿病的方法，胰岛移植的效果与移植的正常活力胰岛细胞的数量密切相关。在胰岛的分离纯化时，胰岛很容易受到多种因素的影响造成损伤，如缺血缺氧、分离时所产生的失巢凋亡、蛋白酶等对胰岛的毒性作用等，从而使单位胰腺的胰岛获得量减少。胰岛的分离过程实际上是将其从丰富的外分泌腺泡中分离出来，所以无论使用何种方法都会不可避免地引起胰腺外分泌部的破坏，导致腺泡内酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等，属于丝氨酸蛋白酶家族)的释放，从而造成胰岛细胞的损伤^[27]。Lakey，J.R.研究发现在人胰岛分离的过程中加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，如Pefabloc，Trasylol，Ulinastatin (UTI)，可以增加胰岛产量^[28]；Shimoda及张晓丹等^[29-30]的研究均发现在胰岛消化的过程中加入胰蛋白酶抑制剂可以改善胰岛分离纯化的结果。1998年Yrjanheikki等^[31]发现Caspase抑制剂米诺环素对脑缺血动物模型有神经保护作用，已陆续发现其在多种神经疾病中均有神经保护作用。Cursio等^[32]研究发现小鼠肝脏的缺血再灌注损伤可以导致肝细胞凋亡，而用Caspase抑制剂处理可以明显地提高受损肝细胞的生存率。最近，Park等^[33]的研究发现抑制淀粉样的蛋白酶激活的Caspase-8可以减少胰岛细胞的凋亡。说明Caspase抑制剂在肝移植中的应用亦有着广阔的前景^[33]。另有研究证明，caspase抑制剂IDN6556在大型动物胰岛移植模型中可延长移植胰岛存活时间。虽然其仅限于短时间的研究(1个月)，结果证明IDN6556在胰岛移植的早期临床试验^[34]。本研究初步探讨了在胰岛分离纯化及培养过程中应用Caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂对胰岛细胞凋亡的影响，发现在消化的过程中及体外培养的过程中均使用以上两种抑制剂对细胞凋亡的抑制作用时最明显的，不仅胰岛细胞的数目最多，而且胰岛β细胞的百分比是最大的。通过胰岛细胞功能的检测，还发现在加入Caspase抑制剂以及Cocktail蛋白酶抑制剂后，其葡萄糖刺激指数较空白对照组是增加的。因此有理由相信，Caspase抑制剂及Cocktail蛋白酶抑制剂不仅通过抑制Caspase酶减少细胞凋亡，而且能通过抑制各种蛋白酶对胰岛细胞的损伤。已有实验证实，人α-抗胰蛋白酶对NIT-1细胞具有保护作用，其机制可能是通过与白细胞介素1B和γ干扰素的结合减少炎症反应来抑制对β细胞的损伤^[35-39]，也可能是通过调节其免疫反应来延长移植胰岛的存活时间^[40]，另外还有研究发现α-抗胰蛋白酶可通过对转化生长因子β，核因子κB以及AKT的调节来调节细胞死亡的通路^[41]。但是，Cocktail蛋白酶抑制剂的作用机制尚需要进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程