重组人CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.011

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (37): 5961-5965.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.37.011

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重组人CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用

孙鸣宇，闫承慧，田孝祥，李洋，韩雅玲

解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所心内科，辽宁省沈阳市 110016

出版日期:2015-09-10 发布日期:2015-09-10
通讯作者: 韩雅玲，博士，院士，教授，博士生导师，解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所，辽宁省沈阳市 110016
作者简介:孙鸣宇，女，1976年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2014年解放军第四军医大学毕业，博士，副主任医师，主要从事心血管病基础及临床的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81130072，81370243)

Interactions between the recombinant human CREG protein and cathepsins and M6P/IGFIIR

Sun Ming-yu, Yan Cheng-hui, Tian Xiao-xiang, Li Yang, Han Ya-ling

Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute of PLA, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Online:2015-09-10 Published:2015-09-10
Contact: Han Ya-ling, M.D., Academician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute of PLA, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Sun Ming-yu, M.D., Associate chief physician, Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute of PLA, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81130072, 81370243

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往研究证实，CREG是一种与M6P/IGFⅡR直接结合的溶酶体蛋白，并依赖于与M6P受体的相互作用有效转运至溶酶体。

目的：分析外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用关系及其对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。

方法：应用细胞免疫荧光双染和免疫共沉淀方法，观察外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用关系，并应用gain-of-function和loss-of-function模型，通过Western blot和细胞免疫荧光双染方法，观察CREG对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。

结果与结论：细胞免疫荧光双染和免疫共沉淀方法证实外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR有直接相互作用关系；应用gain-of-function和loss-of-function模型进一步证实，CREG对M6P/IGFⅡR表达变化无影响，而影响其在细胞内的定位。提示外源性CREG蛋白定位于溶酶体，且与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR有相互作用关系，并影响M6P/IGFⅡR的细胞内定位。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 巨噬细胞, E1A激活基因阻遏子, 溶酶体, 动脉粥样硬化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been found that cellular repressor of E1A-stimulated genes (CREG) is a lysosomal protein binding directly to the mannose-6-phosphate (M6P)/insulin-like growth factor II receptor (IGFIIR) and depends on the interaction with M6P receptors for efficient delivery to lysosomes

OBJECTIVE: To study the interactions between the exogenous CREG protein and cathepsins and M6P/IGFIIR and to confirm the effect of CREG protein on expression and distribution of M6P/IGFIIR.

METHODS: Double-stained immunofluorescence and coimmunoprecipitation were applied to observe the interactions between the exogenous CREG protein and cathepsin B, cathepsin L and M6P/IGFIIR. Using gain-of-function and loss-of-function approaches, the effect of CREG on expression and distribution of
M6P/IGFIIR were studied by western blot assay and immunofluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: Double-stained immunofluorescence and coimmunoprecipitation analyses confirmed the direct interactions between the exogenous CREG protein and cathepsin B, cathepsin L and M6P/IGFIIR. It was verified that CREG plays a critical role not in the expression but in the distribution of M6P/IGFIIR using gain-of-function and loss-of-function approaches. These findings provide evidence that exogenous CREG protein is located in lysosomes and has interactions with cathepsins and M6P/IGFIIR, also CREG plays a critical role in the distribution of M6P/IGFIIR.

Key words: 组织构建, 组织工程, 巨噬细胞, E1A激活基因阻遏子, 溶酶体, 动脉粥样硬化, 国家自然科学基金

中图分类号:

R318

孙鸣宇，闫承慧，田孝祥，李洋，韩雅玲. 重组人CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 5961-5965.

Sun Ming-yu, Yan Cheng-hui, Tian Xiao-xiang, Li Yang, Han Ya-ling. Interactions between the recombinant human CREG protein and cathepsins and M6P/IGFIIR[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(37): 5961-5965.

图/表（结果） 4

2.1 外源性CREG蛋白定位于溶酶体并与M6P/IGFⅡR共定位分别以抗His抗体与抗cathepsin B、抗cathepsin L、抗LAMP1、抗IGFⅡR抗体对添加了带有His标签的外源性CREG蛋白的RAW 264.7细胞行免疫荧光双染，His染色标记为红色荧光，cathepsin B、cathepsin L、LAMP1、IGFⅡR染色均标记为绿色荧光，共定位显示为黄色荧光，DAPI染色的细胞核为蓝色荧光。结果发现，在添加外源性CREG蛋白后，其特异的His标签与溶酶体内组织蛋白酶cathepsin B、cathepsin L和溶酶体膜标志蛋白LAMP1有明确的共定位关系，表现为黄色荧光；同时，His标记蛋白与M6P/IGFⅡR也有共定位关系(图1)。以上结果提示，外源性CREG蛋白导入细胞后，与内源性CREG蛋白具有同样的溶酶体定位，并且可能与溶酶体酶及M6P/IGFⅡR有相互作用关系。

2.2 外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR有相互作用关系 RAW 264.7细胞培养基中加入 20 mg/L的外源性CREG蛋白24 h后收集细胞并裂解细胞提取蛋白。Protein A agarose捕捉到His抗原抗体复合物后经煮沸游离抗原、抗体和Protein A agarose，上清行SDS-PAGE电泳，结果显示抗cathepsin B、cathepsin L和M6P/IGFⅡR抗体可检测到明显条带，而阴性对照组则无条带检出(图2)，提示带有His标签的CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶cathepsin B、cathepsin L和M6P/IGFⅡR有直接相互作用关系。

2.3 CREG对M6P/IGFⅡR表达变化无影响，而影响其细胞内定位在RAW 264.7细胞培养基中加入20 mg/L的外源性CREG蛋白24 h后收集细胞。转染control siRNA和CREG siRNA的RAW 264.7细胞在转染72 h后收集细胞行Western blot检测。结果发现，在添加外源性CREG蛋白和转染CREG siRNA下调CREG表达变化后，RAW 264.7细胞中M6P/IGFⅡR表达量与对照组相比差异无显著性意义(图3)。进一步设想，CREG是否影响了M6P/IGFⅡR的细胞内定位。实验中在RAW 264.7细胞培养基中加入20 mg/L的外源性CREG蛋白24 h后行免疫荧光染色，而转染了control siRNA和CREG siRNA的RAW 264.7细胞则在转染72 h后进行免疫荧光染色。分别以抗M6P/IGFⅡR抗体与抗LAMP1抗体对不同处理组RAW 264.7细胞行免疫荧光双染，IGFⅡR染色标记为红色荧光，LAMP1染色标记为绿色荧光，共定位显示为黄色荧光，DAPI染色的细胞核为蓝色荧光。结果发现，在添加外源性CREG蛋白后，IGFⅡR标记的红色荧光广泛分布于细胞质和细胞膜上，并与溶酶体结构蛋白LAMP1有共定位关系，表现为黄色荧光；而在CREG表达下调的RAW 264.7细胞中，IGFⅡR标记的红色荧光主要分布于细胞核周围，且与LAMP1仅有部分共定位关系(图4)。上述结果表明，CREG对M6P/IGFⅡR表达变化无影响，而影响其在细胞内的定位。

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引言

动脉粥样硬化是一种由于血管壁慢性结构和功能紊乱，从而导致冠心病和颈动脉疾病等各种重要血管疾病发生发展的病理表现。除脂质功能失调及动脉脂质堆积外，免疫-炎症反应也是造成动脉粥样硬化的一个关键因素^[1-2]。巨噬细胞炎症在动脉粥样硬化进程的各个阶段均发挥重要作用，包括从动脉粥样硬化始发到斑块破裂，继而引发血栓形成的级联效应^[3]。因此寻找到一种巨噬细胞炎症的调节因子可能成为动脉粥样硬化治疗的新途径。自噬具有对抗炎症的作用^[4-5]，在巨噬细胞炎症中可能也发挥重要作用。溶酶体是自噬的重要细胞器，主要负责细胞基质降解和再循环，通过降解胞内和胞外病原体发挥对宿主细胞的防御功能^[6-7]。 E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A- stimulated genes，CREG)是一种可对抗腺病毒E1A癌蛋白诱导的转录激活和细胞转化的分泌型糖蛋白^[8]。以往已有研究证实，CREG是一种可以与6-磷酸甘露糖(mannose- 6-phosphate，M6P)/胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-like growth factor II receptor，IGFⅡR)直接结合的溶酶体蛋白，并依赖于与M6P受体的相互作用，从而有效转运至溶酶体^[9]。外源性添加的重组人CREG蛋白是否与内源性CREG蛋白具有相同特性，是否能与M6P/IGFⅡR相互作用尚不清楚。本研究应用细胞免疫荧光双染和免疫共沉淀方法，观察外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR有相互作用关系，并应用gain-of-function和loss-of- function模型，通过Western blot和细胞免疫荧光双染方法，观察CREG对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点 2013年5月至2014年5月于解放军沈阳军区总医院全军心血管病重点实验室暨辽宁省心血管病转化医学研究重点实验室完成。

重组人CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用实验试剂：
试剂	来源
小鼠巨噬细胞RAW 264.7	中国科学院细胞库
抗CREG抗体、抗cathepsin B抗体、抗cathepsin L抗体、抗IGFⅡR抗体	美国R&D公司，
抗LAMP1抗体、CREG蛋白	英国Abcam公司
抗His抗体	美国Invitrogen公司
抗β-Tubulin抗体	北京康为世纪公司
Control siRNA及CREG siRNA	美国Santa Cruz公司
HiPerFect Transfection Reagent	德国Qiagen公司
增强化学发光试剂(ECL)	美国Amersham公司
蛋白测定BCA试剂盒	美国Pierce公司
辣根过氧化物酶标记的二抗	中杉公司
DMEM和小牛血清	GIBCOBRL公司

1.3 实验方法

1.3.1 细胞免疫荧光双染吸弃RAW 264.7细胞培养基，PBS漂洗3次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；1% Triton X-100室温通透20 min，PBS漂洗3次，5 min/次；体积分数10%山羊血清封闭1 h，弃血清，

加入PBS稀释的一抗(抗His抗体与抗cathepsin B/抗cathepsin L/LAMP1/IGFⅡR抗体；抗IGFⅡR抗体与抗LAMP1抗体)(1∶100)，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，5 min/次；同时加入Alexa Fluor 555标记的荧光二抗和Alexa Fluor 488标记的荧光二抗(1∶300)室温避光孵育1 h，PBS漂洗3次，5 min/次；DAPI染细胞核5 S，PBS漂洗，去离子水漂洗，抗淬灭封固剂封固。在共聚焦显微镜下观察、照像。RAW 264.7细胞用相应抗体及DAPI可分别检测到红色/绿色和蓝色荧光表达，共定位显示为黄色荧光。

1.3.2 免疫共沉淀预冷的PBS洗涤细胞2次，吸干PBS；加入预冷的RIPA Buffer，1 mL裂解液/10⁷个细胞；将细胞从培养皿刮下，悬液转至离心管，混匀，冰上放置15 min裂解细胞。每5 min振荡1次，充分裂解；4 ℃ 14 000×g离心裂解液15 min，迅速转移上清至新离心管，弃掉沉淀。每1 mL细胞裂解液加入100 μL Protein A agarose(50%)，4 ℃摇晃10 min，以去除非特异性杂蛋白；4 ℃，14 000×g离心15 min，上清转移至新离心管中；测定蛋白浓度，定量，分装，-80 ℃保存；用PBS将总蛋白稀释到1 g/L；每1 mg总蛋白加入3 μg抗His抗体，对照组加入3 μg小鼠IgG抗体。将细胞裂解液与抗体轻轻混匀，4 ℃缓慢摇动孵育1 h；加50 μL Protein A agarose捕捉抗原抗体复合物，4 ℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；14 000 r/min瞬时离心5 s，收集Protein A agarose -抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA裂解液洗3次，每次加入800 μL；将Protein A agarose重悬于SDS蛋白上样缓冲液中，混合均匀后煮沸5 min，200×g离心1 min，上清转移至新离心管中进行SDS-PAGE电泳。

1.3.3 Control siRNA和CREG siRNA的转染应用HiPerFect Transfection Reagent将control siRNA和CREG siRNA转染至RAW 264.7细胞中。转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至6孔板，使其在转染日密度达到80%-90%。细胞铺板在2 mL含血清及抗生素的正常生长培养基中。转染前每孔细胞换为2 mL不含血清不含抗生素的DMEM培养基。分别用100 μL无血清培养基(DMEM培养基)稀释14 μL10 μmol/L的control siRNA及CREG siRNA，100 μL DMEM培养基稀释21 μL HiPerFect Transfection Reagent试剂，两者混合，室温放置15 min。直接将复合物加入到细胞培养基中，摇动培养板，轻轻混匀。37 ℃，5% CO₂培养24 h后，弃掉培养基，重新加入2 mL含体积分数15%FBS及抗生素的DMEM培养基。37 ℃，体积分数5%的CO₂中培养24 h后传代，继续培养24 h后进行干扰效率鉴定及其它相关实验。

1.3.4 Western blot 用含有0.1%蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解RAW264.7细胞，振荡混匀，冰上放置 20 min，每5 min振荡混匀。用4 ℃离心机14 000 r/min 离心20 min，收集上清即为提取蛋白。电泳，转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h,用含有兔抗小鼠CREG一抗(1∶1 000)的1%脱脂牛奶4 ℃摇晃过夜，TBS-T洗3遍，15 min/次。山羊抗兔二抗(1∶2 000)室温摇晃孵育1 h，TBS-T洗3遍，15 min/次。ECL发光试剂盒暗室中发光显影。

1.4 主要观察指标外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用关系，以及CREG对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0进行统计分析，两样本均数的比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。每组实验结果重复3次。

讨论

M6P/IGFⅡR是一种M_r300 000的多功能跨膜糖蛋白，包括含有15个重复域的较大的胞外区域和较小的胞内区域。该受体的主要功能之一就是与M6P结合糖蛋白(如溶酶体酶)结合并将其从转运高尔基体网络或细胞表面向溶酶体转运^[10]。并且，M6P/IGFⅡR可以调节溶酶体酶如cathepsin B和cathepsin D的效能及活性，M6P/IGFⅡR的缺失可导致cathepsin B和其他溶酶体酶分泌增多，从而促进恶性细胞转移^[11-12]。已有研究报道，CREG可通过其糖基直接与M6P/IGFⅡR 结合^[13]。在人纤维母细胞中M6P/IGFⅡR介导的CREG摄取导致该内吞蛋白转运至含有LAMP1的细胞器中^[14]。以往研究证实，CREG是一种与M6P/IGFⅡR直接结合的溶酶体蛋白，并依赖于与M6P受体的相互作用有效转运至溶酶体^[9]。外源性添加CREG蛋白是否与内源性CREG蛋白具有相同特性并能与M6P/IGFⅡR相互作用却尚不清楚。外源性CREG蛋白是带有His标签并通过与Ni-NTA柱结合纯化的蛋白。为研究外源性CREG蛋白与溶酶体的定位关系，实验中在RAW 264.7细胞培养基中加入20 mg/L的外源性CREG蛋白24 h后行免疫荧光染色。分别以抗His抗体与抗cathepsin B、抗cathepsin L、抗LAMP1、抗IGFⅡR抗体对添加了带有His标签的外源性CREG蛋白的RAW 264.7细胞行免疫荧光双染。结果提示，外源性CREG蛋白导入细胞后，与内源性CREG蛋白具有同样的溶酶体定位，并且可能与溶酶体酶及M6P/IGFⅡR有相互作用关系。

为进一步验证上述结果，作者应用了免疫共沉淀以确定外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用。免疫共沉淀是以抗原和抗体之间的专一性为基础，用于研究蛋白质相互作用的经典方法，用于确定两种蛋白在完整细胞内生理性相互作用。本研究中Protein A agarose捕捉到His抗原抗体复合物后经煮沸游离抗原、抗体和Protein A agarose，上清行SDS-PAGE电泳，结果显示抗cathepsin B、cathepsin L和M6P/IGFⅡR抗体可检测到明显条带，而阴性对照组则无条带检出，提示带有His标签的CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶cathepsin B、cathepsin L和M6P/IGFⅡR有直接相互作用关系。

为明确CREG对M6P/IGFⅡR表达变化是否有影响，作者应用gain-of-function和loss-of-function模型，Western blot检测CREG表达上调和表达下调后M6P/IGFⅡR表达变化情况。结果发现，在添加外源性CREG蛋白和转染CREG siRNA下调CREG表达变化后，RAW 264.7细胞中M6P/IGFⅡR表达量与对照组相比无统计学差异。进一步设想，CREG是否影响了M6P/IGFⅡR的细胞内定位。分别以抗M6P/IGFⅡR抗体与抗LAMP1抗体对不同处理组RAW 264.7细胞行免疫荧光双染，结果发现，在添加外源性CREG蛋白后，IGFⅡR标记的红色荧光广泛分布于细胞质和细胞膜上，并与溶酶体结构蛋白LAMP1有共定位关系；而在CREG表达下调的RAW 264.7细胞中，IGFⅡR标记的红色荧光主要分布于细胞核周围，且与LAMP1仅有部分共定位关系。上述结果表明，CREG对M6P/IGFⅡR表达变化无影响，而影响其在细胞内的定位。M6P/IGFⅡR对溶酶体的结合及转运有非常重要的作用，CREG能否通过调节M6P/IGFⅡR的细胞内定位而影响溶酶体功能，从而影响自噬介导的抗炎作用，有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Interactions between the recombinant human CREG protein and cathepsins and M6P/IGFIIR

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