非小细胞肺癌肿瘤组织干细胞标志物CD133的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：非小细胞肺癌肿瘤组织中干细胞标志物CD133表达会呈现出一定的变化，并与疾病的发生和发展存在一定的联系。

目的：探讨非小细胞肺癌肿瘤组织干细胞标志物CD133的表达情况，分析其与临床病理因素以及预后之间的关系。

方法：收集135例非小细胞肺癌组织标本和60例正常肺组织标本。采用免疫组织化学染色法检测两组标本CD133的表达，并分析非小细胞肺癌肿瘤组织中CD133蛋白的表达与临床病理因素之间的关系。

结果与结论：①非小细胞肺癌组CD133蛋白阳性表达率显著高于正常对照组(P < 0.05)。②CD133蛋白阳性表达与非小细胞肺癌患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤位置、组织学类型无关(P > 0.05)；随着非小细胞肺癌肿瘤组织分化越差，CD133蛋白阳性表达呈现出不断上升趋势(P < 0.05)；CD133蛋白阳性表达率在不同临床分期以及淋巴结有无转移之间差异也有显著性意义(P < 0.05)。③CD133以及TNM分期是非小细胞肺癌患者预后独立影响因素(P < 0.05)，CD133蛋白表达阳性组中位生存时间显著短于阴性组(P < 0.05)。以上结果表明CD133参与非小细胞肺癌的发生和发展以及浸润和转移，对疾病的进展以及预后判断有重要的临床意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 非小细胞肺癌, 干细胞标志物, CD133蛋白

Abstract:

BACKGROUND: The CD133 expression in non-small cell lung cancer shows some changes, which is definitely related to the occurrence and development of diseases.
OBJECTIVE: To investigate the expression of CD133 in non-small cell lung cancer, and to analyze its relationship with clinical pathological factors and prognosis.
METHODS: Non-small cell lung cancer tissue specimens from 135 cases were collected, and normal lung tissue specimens from 60 cases were set as normal control group. Immunohistochemical staining was used to detect CD133 expression in two groups, and the relationship between the expression of CD133 protein and the clinical pathological factors was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The positive expression of CD133 protein in the non-small cell lung cancer group was significantly higher than that in the normal control group (P < 0.05). (2) CD133 protein expression had no association with age, gender, tumor size, tumor location, histological type (P > 0.05), and CD133 protein expression was significantly increased with the differentiation of non-small cell lung cancer (P < 0.05). The positive expression rate of CD133 protein was significantly different between different clinical stages and lymph node metastasis (P < 0.05). (3) CD133 and TNM staging were independent prognostic factors for non-small cell lung cancer (P < 0.05), and the median survival time was significantly shorter in the positive group than in the negative group (P < 0.05). The results indicate that CD133 is involved in the occurrence, development, infiltration and metastasis of non-small cell lung cancer, and it hasimportant clinical significance for the disease progression and prognosis.

Key words: Stem Cells, Carcinoma, Non-Small-Cell Lung, Neoplastic Stem Cells

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6至8月在河南大学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 肺组织标本河南大学淮河医院病理科提供135例非小细胞肺癌组织标本，均经石蜡包埋，其中男100例，女35例；年龄25-83岁，平均年龄(55.16±12.05)岁；腺癌30例，鳞状细胞癌105例；淋巴结无转移90例，淋巴结转移45例；低分化癌20例，中分化癌100例，高分化癌15例；周围型肺癌40例，中央型肺癌95例；病理分期Ⅰ期20例，Ⅱ期40例，Ⅲ期40例，Ⅳ期35例。纳入标准：①临床均经组织学(或者细胞学)检查，确诊为非小细胞肺癌。②患者术前均未接受放、化疗或者其他抗肿瘤治疗。排除标准：其他类型肺癌患者。

另选择60例正常肺组织标本设为正常对照组，标本均经临床病理学证实为正常肺组织。

1.3.2 主要试剂与仪器鼠抗人CD133单克隆抗体(美国 Epigentek 公司)，甲醛溶液(上海哈灵生物科技有限公司)，二甲苯溶液(上海博耀生物科技有限公司)，乙醇溶液(上海弘顺生物科技有限公司)，PBS(北京同立海源生物科技有限公司)，孵育箱(北京博奥森生物技术有限公司)，显微镜(北京嘉美纽诺生物科技有限公司)，切片机(海德创业(北京)生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组织化学染色所有标本经体积分数为4%甲醛溶液进行固定，石蜡包埋组织，进行连续切片，切片厚度为4 μm，然后利用二甲苯溶液和不同体积分数乙醇溶液进行脱蜡水化等处理。严格按照免疫组织化学染色试剂盒说明书进行操作，一抗为兔抗人CD133多克隆抗体，稀释度为1︰200，利用PBS代替一抗作为空白对照，利用已知阳性片作为阳性对照。

1.4.2 结果判定 CD133阳性表达为细胞膜以及细胞浆出现棕黄色颗粒。

对CD133阳性表达结果进行评分，评分包括着色范围(高倍镜下阳性细胞所占比例)和着色强度两部分。①着色范围：10%以下为1分，11%-50%为2分，51%-75%为3分，75%以上为4分。②着色强度：棕褐色3分，棕黄色2分，淡黄色1分，无色0分。以着色范围和着色强度评分的乘积为最终评分结果，其中，最终得分大于2分，则为阳性；≤2分，则为阴性。所有标本均随机计数10个高倍视野(×400)，取其中位值，在不了解患者临床预后情况的前提条件下，由3名资深病理科医生分别独立进行观察和结果评定，对于独立判断存在差异的标本，予以共同观察，并得出最终的判定结果。

1.5 主要观察指标 ①非小细胞肺癌肿瘤组织和正常肺组织中CD133的表达情况。②非小细胞肺癌肿瘤组织中CD133蛋白的表达和临床病理因素之间的关系。③影响非小细胞肺癌预后的独立危险因素。④不同CD133蛋白表达患者的中位生存时间。

1.6 统计学分析实验过程中得出的数据均利用统计学软件SPSS 19.0进行处理分析，计量资料符合正态分布的予以t检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析；CD133蛋白表达阴性组和阳性组的生存分析使用Kaplan-Meier法，非小细胞肺癌预后多因素分析采用Cox回归模型分析，非小细胞肺癌肿瘤组织中CD133蛋白的表达和临床病理因素之间的关系进行Spearman等级相关检验和χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤干细胞是存在于肿瘤细胞中的一类特殊细胞^[6]，这些细胞具有自我更新能力以及较强的分化能力，可以发挥出多种功能^[7-10]。首先，肿瘤干细胞可以通过自我更新和增殖来为肿瘤细胞群的生长提供强大的活力来源，帮助其维持旺盛的生命力^[11]；其次，肿瘤干细胞还具有较强的迁徙和运动能力，极大的促进肿瘤细胞的转移，导致各种肿瘤的浸润和转移等^[12-13]。另外，在正常状态下，肿瘤干细胞还可以长期维持相对稳定的休眠状态，并具备较强的耐药性^[14-15]。目前，非小细胞肺癌肿瘤干细胞尚缺乏具有较强特异性的标记物^[16-18]。研究最多的是参照多能干细胞的标记物SOX2和乳腺癌干细胞的标记物CD44，以及脑胶质瘤特征标记分子CD133^[19]。CD133蛋白是一种特殊的糖蛋白，属于细胞膜蛋白超家族。CD133蛋白包含865个氨基酸，其功能主要是在细胞及器官成熟过程中起到转录调控作用。CD133在干细胞以及多种不同肿瘤干细胞表面表达^[20-21]。Tirino等^[22]选择新鲜肺癌组织标本，经流式细胞仪分选获得CD133阳性细胞，并表现出很强的生长能力，并推测CD133阳性细胞可能是非小细胞肺癌干细胞的重要标记物。但也有一些学者研究认为，CD133并不是非小细胞肺癌干细胞的指标^[23]。对于一些CD133阴性肺癌细胞而言，也可以具有一定的肿瘤干细胞性能。Cui等^[24]检测肺癌手术标本，了解相应的肺癌细胞CD133⁺/nestin⁺的表达情况，随访发现CD133⁺/nestin⁺和临床预后效果之间不存在任何关系。也有一些学者发现，循环造血祖细胞标志物CD133⁺可以预测非小细胞肺癌选择使用sorafenib plus erlotinib方面的价值^[25]。另外，高水平表达CD133⁺细胞的非小细胞肺癌对铂类药物产生一定的化疗耐药性。还有一些学者通过研究指出，CD133是耐药的一个表型，但并不是非小细胞肺癌生存预后的标志^[26]。总体来看，对于CD133蛋白，目前大多认为将其与其他标记物联合起来应用可以更好提高肺癌干细胞的检测水平^[27-33]。研究发现非小细胞肺癌组CD133蛋白阳性表达显著高于正常对照组(P < 0.05)，进一步分析非小细胞肺癌肿瘤组织中CD133蛋白的表达情况和临床病理因素之间的关系，结果显示CD133蛋白阳性表达与非小细胞肺癌患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤位置、组织学类型无关(P > 0.05)；CD133 蛋白阳性表达随着非小细胞肺癌肿瘤组织分化越差，呈现出不断上升趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)；CD133蛋白阳性表达率在不同临床分期以及淋巴结有无转移之间差异也有显著性意义(P < 0.05)。以往有研究表明，恶性肿瘤中CD133阳性表达率可以达到很高的水平，但是，并不是所有表达CD133的肿瘤细胞均具有相应的肿瘤干细胞特性和功能，仅有其中的一部分具有相应的肿瘤干细胞特性和功能^[34-35]。另外，在正常对照组的组织标本中，也出现了一部分细胞表达CD133蛋白的情况，该结果和其他一些学者的报道一致^[36-37]，分析出现这一结果的原因可能是CD133在非小细胞肺癌的形成过程中发挥出十分重要的作用^[38]。按照性别和年龄、TNM分期、淋巴结转移情况、CD133蛋白表达情况、组织分化程度将非小细胞肺癌肿瘤患者划分为不同的组别，并进行Cox回归分析。经统计学分析可以发现，CD133以及TNM分期是非小细胞肺患者预后独立影响因素(P < 0.05)。经Kaplan-Meier生存分析还发现，在中位生存时间方面，CD133蛋白表达阳性组显著短于阴性组(P < 0.05)。这一结果也表明，通过检测CD133表达可以对预后效果进行一定的判断，以更好的指导临床治疗，与其他一些学者的报道基本一致^[39-40]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程综上所述，干细胞标志物CD133会参与到非小细胞肺癌的发生和发展以及浸润和转移过程中，对疾病的进展以及预后判断具有十分重要的临床意义。本次研究受到时间以及实际条件等因素的影响，所纳入研究的病例数十分有限，相应的观察指标也较少，所获得的相关结果以及结论等均有可能存在一定的不足之处。为此，还有待在今后的研究中通过增加观察指标、不断扩大样本容量、延长观察时间等方式予以探讨。