成骨细胞旁分泌影响软骨细胞中MMPs与TIMPs的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞之间体外共培养能最大限度的模拟体内真实的微环境，细胞划痕实验及炎症因子白细胞介素1β刺激后基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制剂之间的平衡可能破坏，从而导致关节软骨细胞外基质的降解，软骨细胞功能的失调，关节软骨的退变。

目的：在成骨细胞上清液与软骨细胞体外共培养下，观察炎症因子白细胞介素1β对体外培养的软骨细胞的迁移、基质金属蛋白酶及组织金属蛋白酶抑制剂表达的影响。

方法：实验分为软骨细胞单培养组﹑软骨细胞与成骨细胞上清液共培养组和软骨细胞与成骨细胞上清液共培养+白细胞介素1β组，划痕实验观察3组24 h软骨细胞的迁移变化；半定量PCR实验分析以上3组24 h软骨细胞中基质金属蛋白酶1，2，3，9及组织金属蛋白酶抑制剂1，2，3，4的变化情况。

结果与结论：与单培养组比较，共培养组和共培养+白细胞介素1β组细胞迁移率显著增加(P < 0.01)；与单培养组比较，共培养组中基质金属蛋白酶1，2，3，9基因表达明显增高(P < 0.05)，共培养+白细胞介素1β组基质金属蛋白酶1，3，9基因表达明显增高(P < 0.01)；与单培养组比较，共培养组和共培养+白细胞介素1β组中组织金属蛋白酶抑制剂1基因表达明显升高(P < 0.01)，组织金属蛋白酶抑制剂3，4基因表达明显下降(P < 0.05)。提示成骨细胞上清液与软骨细胞共培养促进软骨细胞的迁移，增强软骨细胞中基质金属蛋白酶1，2，3，9的基因表达且调节组织金属蛋白酶抑制剂家族的基因表达。白细胞介素1β抑制共培养的软骨细胞迁移及组织金属蛋白酶抑制剂家族的基因表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 成骨细胞, 骨性关节炎, 基质金属蛋白酶, 组织金属蛋白酶抑制剂, 白细胞介素1β, 共培养

Abstract:

BACKGROUND: Cell co-culture can maximize the simulation of in vivo microenvironment. Cell scratch test and interleukin-1β can destroy the balance between matrix metalloproteinases (MMPs) and matrix metalloproteinase inhibitors (TIMPs), resulting in extracellular matrix degradation of the articular cartilage, functional disorders of chondrocytes and articular cartilage degeneration.

OBJECTIVE: To study the effect of interleukin-1β on migration, MMP and TIMP expression of chondrocytes co-cultured with osteoblast supernatant in vitro.

METHODS: There were three groups: chondrocyte monoculture group, osteoblast+chondrocyte group (co-culture group), osteoblast+chondrocyte+interleukin-1β group (interleukin-1β group). Cell scratch test was conducted to observe the migration of chondrocytes within 24 hours. Semi-quantitative PCR test was used to detect the changes in expressions of MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-9 in chondrocytes within 24 hours.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the monoculture group, cell migration rate of the other two groups were increased significantly (P < 0.01). Compared with the monoculture group, the gene expressions of MMP-1, MMP-2, MMP-3 and MMP-9 were increased significantly in the coculture group (P < 0. 05); the gene expressions of MMP-1, MMP-3, MMP-9 were increased significantly in the interleukin-1β group (P < 0. 01). Compared with monoculture group, the gene expression of TIMP-1 was increased significantly (P < 0. 01), but the gene expressions of TIMP-3 and TIMP-4 were declined significantly (P < 0. 05) in the other two groups. These findings indicate that co-culture of chondrocytes with osteoblasts can promote chondrocytes migration, enhance gene expression of chondrocytes MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 and regulate gene expression of TIMPs family. Interleukin-1β inhibits the migration of chondrocytes co-cultured with osteoblasts and gene expression of TIMPs family.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Chondrocytes, Osteoblast, Matrix Metalloproteinases

中图分类号:

R318

关鹏，赵伟，张全有，谢静，尹利军，赵虎成，许建文. 成骨细胞旁分泌影响软骨细胞中MMPs与TIMPs的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5306-2311.

Guan Peng, Zhao Wei, Zhang Quan-you, Xie Jing, Yin Li-jun, Zhao Hu-cheng, Xu Jian-wen. Paracrine effect of chondrocytes on gene expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5306-2311.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态观察结果与软骨细胞单培养比较，软骨细胞与成骨细胞培养液共培养下，细胞保持了更好的状态和活性，单培养组在饥饿培养时，细胞出现变圆的亮点，表示细胞的贴壁能力正在下降; 而共培养组细胞在培养液营养不足的情况下，镜下观察细胞的贴壁依然紧密，呈圆形、长梭形，胞质透亮，核大呈椭圆形位于细胞中央。镜下结果表明：在共培养下，成骨细胞和软骨细胞相互交流和影响，从而维持了细胞的正常形态。 2.2 共培养及共培养+白细胞介素1β对软骨细胞迁移的影响结果与软骨细胞单培养比较，共培养组和共培养+白细胞介素1β组明显诱导了软骨细胞的迁移(如图1)。与软骨细胞单培养比较，共培养组和共培养+白细胞介素1β组细胞迁移率在24 h分别增加(42.0±0.1)%和(15.0±0.1)%(P < 0.01，如图2)。与共培养组比，共培养+白细胞介素1β组在24 h时明显减慢了软骨细胞的迁移(P < 0.05，如图2)。

2.3 共培养和共培养+白细胞介素1β下基质金属蛋白酶1，2，3，9 的基因表达半定量 PCR结果显示：在磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达相对稳定的情况下，与单培养比较，共培养组基质金属蛋白酶1，2，3，9 mRNA的基因表达显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；共培养+白细胞介素1β组中基质金属蛋白酶1，3，9 mRNA 的基因表达显著增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。见图3，见表2。

2.4 共培养和共培养+白细胞介素1β条件下组织金属蛋白酶抑制剂1，2，3，4的基因表达半定量 PCR结果显示：在磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达相对稳定的情况下，与单培养比较，共培养组和共培养+白细胞介素1β组均增加了组织金属蛋白酶抑制剂1 mRNA基因的表达(P < 0.01)，明显降低了组织金属蛋白酶抑制剂3，4 mRNA基因的表达(P < 0.05)，组织金属蛋白酶抑制剂2 mRNA基因的表达差异无显著性意义(P > 0.05)。见图4，见表3。

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引言

在骨性关节炎中主要涉及到关节软骨的破坏﹑软骨下骨和关节滑膜的变化。近年来随着人口的老龄化和高肥胖率增多骨性关节炎患者也逐年增加^[1]。骨性关节炎的治疗主要包括：物理治疗﹑消炎止痛﹑减肥﹑功能锻炼和外科治疗等。外科治疗患者需要承担一定的风险且手术费用昂贵，大部分患者会选择尽量避免外科治疗。软骨的破坏是产生骨性关节炎的常见病因，软骨细胞外基质的降解是导致软骨自身修复困难的重要原因之一。作为细胞微环境的重要组成成分细胞外基质直接参与细胞的增殖﹑黏附﹑迁移﹑细胞分化和细胞凋亡等一系列过程^[2]。细胞外基质中蛋白的成分可被基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)所降解，基质金属蛋白酶无论在细胞内还是细胞外的细胞外基质蛋白成分的降解和重塑中均发挥非常重要的作用^[3]。基质金属蛋白酶根据其作用底物的特异性可分为：胶原酶(基质金属蛋白酶1，8，13)，明胶酶(基质金属蛋白酶2，9)，间质溶解素(基质金属蛋白酶3，10，11)，基质溶解素(基质金属蛋白酶7，26)，以及其他类型的酶(基质金属蛋白酶12，19，20，21)^[4]。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)是一组能抑制基质金属蛋白酶活性的多功能天然抑制物^[5]。在骨性关节炎中基质金属蛋白酶也不例外的参与了关节软骨细胞外基质的降解。因此，组织金属蛋白酶抑制剂可以通过抑制基质金属蛋白酶来调节软骨细胞外基质重塑和活性。实验用白细胞介素1β诱导软骨细胞，观察与成骨细胞培养液体外共培养中基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂基因的表达，实际上是在体外模拟骨性关节的炎症早期阶段，从而可能为临床骨性关节炎诊断或治疗提供指导作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2013年6至9月在清华大学生物力学研究所完成。

材料：

实验动物：出生后1 d的昆明种乳鼠，雌雄不限，由清华大学动物实验中心提供，实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。

成骨细胞旁分泌影响软骨细胞中基质金属蛋白酶与组织金属蛋白酶抑制剂表达实验试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMED培养基、胎牛血清、胰蛋白酶	GIBCO公司，美国
Ⅱ型胶原酶	Sigma公司，美国
PCR扩增仪	Bio-Rad公司，美国
凝胶成像系统(手动型)LG2000型	杭州郎基公司
低速自动平衡离心机	上海启明电子科技公司

实验方法：

细胞提取及培养：参考文献[6]的方法，将10只出生1 d的乳鼠在体积分数75%乙醇中浸泡消毒，在无菌操作台上用手术剪取出乳鼠后腿膝关节的关节软骨，用含有双抗的1×PBS反复冲洗，用手术剪将组织剪成1 mm×1 mm× 1 mm的组织块，吸尽PBS后加入4 mL的0.25%胰蛋白酶再将其装入50 mL的EP管中在37 ℃的恒温摇床上震荡 30 min。静置待组织块完全沉淀用移液枪吸去上层液体后加入0.2%的Ⅱ型胶原酶4 mL+4 mL的DMEM稀释，再放入恒温摇床摇2.5 h。取上清液在离心机上1 000 r/min条件下离心5 min，倒掉上清液，再加入6 mL的培养液用移液枪反复吹打后，以2 mL/瓶分别装入3个培养瓶，放入37 ℃﹑体积分数5%的CO₂孵育箱培养。待细胞长满底部后，将贴壁细胞移到新的培养瓶中，换DMEM(含体积分数10%的胎牛血清)继续培养，待细胞到一定溶度进行细胞传代用于实验，实验细胞一般在传代三四代时使用

软骨细胞与成骨细胞培养液共培养(co-culture)及细胞形态学观察：细胞传代至3代，将软骨细胞以1×10⁵ L^-1种于6孔板中，在板上标记单培养组﹑共培养组和共培养+白细胞介素1β组。单培养组加2 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM软骨细胞培养液，共培养组和共培养+白细胞介素1β组中各加1 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM软骨细胞培养液。在共培养组和共培养+白细胞介素1β组中各加入1 mL成骨细胞培养液，在共培养+白细胞介素1β组加入20 ng的白细胞介素1β(10 μg/L)。置于37 ℃﹑体积分数5%的CO₂孵育箱培养12 h，待细胞贴壁后换用含体积分数2%胎牛血清的DMEM培养液饥饿培养24 h。于倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。提取6孔板中细胞提取其总RNA进行实验。

细胞划痕实验：将实验分为2个时间段观察，分别为0 h和24 h段，在细胞贴壁后用1 mL无菌枪头分别在3个组各划一条平行的﹑均匀的竖线，用PBS冲洗去掉脱落的细胞，继续培养。在倒置显微镜下观察划痕修复过程，并于0，24 h拍照记录，分别测量3组划痕在0，24 h的相对痕距，最后比较不同细胞迁移率的差异。

常规聚合酶链式反应( semi-quantitative PCR)：反应体系为25 μL，引物序列见表1。Master Mix 12.5 μL，Primer正负引物各1 μL，cDNA 4 μL，RNase-free water 6.5 μL。解链94 ℃，30 s；退火60 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；循环数30-34个，2% 琼脂糖电泳，紫外光下获得电泳结果。

主要观察指标：①细胞形态观察结果。②共培养及共培养+白细胞介素1β对软骨细胞迁移的影响结果。③共培养和共培养+白细胞介素1β下基质金属蛋白酶1，2，3，9 的基因表达。④共培养和共培养+白细胞介素1β下组织金属蛋白酶抑制剂1，2，3，4的基因表达。

统计学分析：数据采用 SPSS 17.0统计软件处理分析，结果以x(_)±s表示，各组检测的基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂基因表达结果进行方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种常见的慢性骨关节疾病，关节软骨退行性变是其主要的病变。尽管骨性关节炎的发病机制尚未阐明，但是最新研究报道合成和降解代谢信号通路的平衡对维持软骨组织内稳态起主要作用，一旦失调将会导致骨关节炎类疾病^[7]，而关节软骨由1%的软骨细胞和99%的细胞外基质组成，故细胞外基质成分的合成和降解失衡是造成骨性关节炎软骨变性的主要原因，基质金属蛋白酶的裂解作用是造成软骨细胞外基质降解的直接原因。细胞共培养能够最大限度的模拟体内微环境，观察细胞间的交流在细胞功能活动中所起到的作用。在关节内，关节软骨细胞和软骨下成骨细胞也存在密切交流，体外单培养切断了细胞之间的联系且不能满足复杂体内微环境的需要。因此，为了更好的模拟体内微环境的需要，本实验建立了软骨细胞-成骨细胞上清液共培养体系。相比单培养，共培养保持了更好的生长状态。白细胞介素主要包括促炎性和抑制炎性作用，促炎性白细胞介素包括白细胞介素1α，1β，2，5，6，8等，促炎性白细胞介素在骨性关节炎发病中起重要作用，而白细胞介素1β在骨性关节炎的病理生理过程中是一个关键因素^[8]。在共培养中加入白细胞介素1β给予划痕实验是为了进一步模拟骨关节炎早期炎症阶段。以往关于软骨细胞共培养的研究主要集中在软骨表层，即软骨细胞与其上面的滑膜细胞共培养^[9]。共培养人类关节软骨细胞和不为人所熟知的单核细胞、破骨细胞或巨噬细胞，它们的交流均有基质金属蛋白酶的改变^[10]，但它所涉及的病理机制仍模糊不清。有研究显示，软骨下骨成骨细胞在骨关节炎发病中起重要作用^[11]，软骨下骨成骨细胞的生物学的改变可能直接影响软骨细胞的代谢^[12-13]。相关学者做动物实验发现，软骨下骨成骨细胞病变直接导致骨性关节炎的发生及发展^[14]，因此软骨下骨成骨细胞对软骨细胞可能有着复杂的作用^[15]。细胞因子在骨性关节炎的发生、发展过程中起到重要作用，能够促进骨性关节炎软骨降解、滑膜炎症及软骨下骨的吸收，与代谢分解有关的细胞因子主要有基质金属蛋白酶^[16]。而本研究创新地运用软骨细胞-成骨细胞上清液共培养，通过基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂的基因表达发现软骨下骨成骨细胞对软骨细胞的影响。细胞迁移是活细胞普遍存在一种细胞活动方式。以往研究表明基质金属蛋白酶的表达能增加细胞的分化、黏附和迁移能力^[17-18]。本研究细胞划痕实验，共培养细胞迁移速率最快，共培养+白细胞介素1β其次，单培养最慢。有学者用人膝骨性关节炎中成骨细胞与软骨细胞共培养中，发现Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因表达的明显下降，说明骨关节炎成骨细胞能促使软骨细胞的退变^[19]。结果显示，基质金属蛋白酶1，2，3，9总体基因的表达在共培养组中最多，共培养+白细胞介素1β组其次，单培养组最少。与单培养比较，共培养组和白细胞介素1β+共培养组中基质金属蛋白酶1，2，3，9均明显升高，这在很大程度上说明成骨细胞上清液中聚集了哪些因子在其中起到了关键作用不得而知。机体在损伤后或病变后的炎症时期，白细胞介素1β是一种重要的炎症因子。实验中加入的白细胞介素1β(10 ng)远比成骨细胞上清液中自身的溶度高，但共培养+白细胞介素1β组中基质金属蛋白酶2，3基因表达较共培养组低，对于基质金属蛋白酶的调节可能并不是起到最重要的一个环节。在炎症的早期阶段，软骨细胞产生和分泌大量的组织金属蛋白酶抑制剂1通过抑制基质金属蛋白酶来保护细胞外基质不受破坏，而组织金属蛋白酶抑制剂3则在炎症的中晚期出现^[20]。本实验结果所示，划痕实验后共培养组和共培养+白细胞介素1β组中组织金属蛋白酶抑制剂1基因的表达在一个很高的水平，组织金属蛋白酶抑制剂3表达在一个较低的水平，这可能说明软骨细胞正处于炎症的早期阶段。有研究表明，组织金属蛋白酶抑制剂2以一个蛋白质的形式存在于细胞体内并保持一个固定的水平^[21]。本实验显示共培养组和白细胞介素1β+共培养组中组织金属蛋白酶抑制剂2与单培养比较无明显差异，这表明它不受外界因素所影响处于一个固定的水平。当然，本研究仅在一定程度上单纯地模拟骨关节炎软骨损伤后软骨细胞与成骨细胞旁分泌交流后基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂的变化，并不能完全反应体内整个病理过程。众所周知，软骨损伤的同时软骨细胞和滑膜细胞之间的交流也能调节基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂表达。不同细胞因子对软骨细胞基质金属蛋白酶的表达也不同^[22-23]。此外，对软骨细胞划痕实验模拟软骨损伤后24 h内所检测到的这些基因不能完全确定是炎症反应期还是重塑期。因此，更多因素参与、更长时间基因的检测对骨性关节炎软骨损伤机制的研究是必要的。本实验创新地采用共培养的方法检测了软骨细胞中基质金属蛋白酶1，2，3，9和组织金属蛋白酶抑制剂的表达情况，发现软骨细胞与成骨细胞旁分泌之间的相互交流影响了基质金属蛋白酶1，2，3，9和组织金属蛋白酶抑制剂的表达，并通过细胞划痕实验和白细胞介素1β作用于软骨-成骨细胞上清液共培养体系模拟骨关节炎的炎症阶段，为后续探索软骨损伤修复的机制和诊治方法提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程