转化生长因子β3在半月板发育过程中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：由于半月板仅红区有血供，其营养主要来自关节内的滑液。半月板损伤后，由于半月板自身愈合能力差，半月板无血供区域几乎无法愈合。

目的：分析转化生长因子β3在大鼠半月板发育过程中表达情况及特点。

方法：选取鼠龄1，7，14，21，28，35 d的Wistar大鼠半月板，用免疫组织化学和RT-PCR方法分别检测随不同鼠龄半月板内转化生长因子β3的表达部位及表达量化。

结果与结论：免疫组织化学发现大鼠由出生到成鼠过程中，转化生长因子β3表达从关节囊开始逐渐扩展至红区、红白区、白区；RT-PCR结果显示不同鼠龄的半月板中转化生长因子β3均可见表达，发育过程中转化生长因子β3表达逐渐增加，生长至成鼠(成鼠标准100 g/只)后表达趋于稳定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 转化生长因子β3, 半月板, 膝关节

Abstract:

BACKGROUND: Since the meniscal blood supply is only in the red zone, the synovial fluid becomes the main nutrition source of the meniscus. As its poor self-healing ability, the meniscus is almost impossible to heal in non-blood supply regions.
OBJECTIVE: To investigate the expression and characteristics of transforming growth factor-β3 in the rat meniscus during postnatal development.
METHODS: Meniscus tissues of Wistar rats with different ages (1, 7, 14, 21, 28, 35 days) were adopted, and immunohistochemistry and RT-PCR methods were performed to detect the location and expression pattern of transforming growth factor-β3 within the meniscus.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemistry results revealed that the expression of transforming growth factor-β3 started from the joint capsule, and gradually extended to the red zone, gray zone, and white area; RT-PCR results showed the mRNA expression of transforming growth factor-β3 in the rat meniscus at different ages, and during development process gradually increased until adult stage (rat weight > 100 g), which remained relatively stable.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Transforming Growth Factor beta3, Menisci, Tibial, Knee Joint

中图分类号:

R318

王健，孙羽，白希壮. 转化生长因子β3在半月板发育过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5274-5278.

Wang Jian, Sun Yu, Bai Xi-zhuang. Expression of transforming growth factor beta3 in meniscus development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5274-5278.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2009年1月至2010年3月在中国医科大学试验中心地点完成。

材料：

实验动物：鼠龄为1，7，14，21，28，35 d的Wistar大鼠共72只，由中国医科大学动物部提供，雄性大鼠，清洁级。

转化生长因子β3在大鼠半月板发育过程中的表达实验所用试剂：
试剂	来源
Trizol试剂，反转录盒，LaTaq酶，转化生长因子β3上下游引物合成	大连宝生物公司
兔抗大鼠转化生长因子β3多克隆抗体、羊抗兔抗体试剂盒	武汉博士德公司

实验方法：

半月板取材：将Wistar大鼠(1 d龄大鼠、7 d龄大鼠在显微镜下取材)拖颈处死后浸泡于体积分数75%乙醇中 5 min，通风橱中用大头钉固定四肢于木板上，取膝正中切口，分离皮下显露髌骨、髌腱，切断髌腱反折向上，切断前后交叉韧带，使胫骨外旋外翻，用刀片轻刮内侧关节间隙打开关节囊，剥离半月板边缘组织，完整取下置于1 mL Trizol液中。

半定量RT-PCR检测：Tizol法提取细胞总RNA，RNA定量为1 g/L并行电泳纯度检测，MLV试剂盒反转录合成cDNA第一链，反转录反应体系(0.5 µL)如下：模板RNA 2 µL+Oligo(dT)1 µL+RNase free dH2o 3 µL，70 ℃保温10 min后迅速在冰上急冷2 min以上，离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集与管底。模板RNA/引物的变性溶液6 µL +5XM-MLV Buffer 2 µL+dNTP Mixture 0.5 µL + dNTP Inhibitor 0.25 µL+RTase M-MLV 0.5 µL+RNase freed H₂O 0.75 µL，42 ℃保温1 h，70 ℃保温15 min后冰上冷却。转化生长因子β3引物设计：上游5’-tgc cca acc cca gct cta agc g-3’，下游5’- gcc ttt gaa ttt gat ttc ca -3’。PCR反应体系(50 µL)：cDNA模板5 µL+上下游引物各1 µL+ Premix LA Taq聚合酶25 µL+dd H₂O 18 µL，反应条件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 28 s，共35个循环。10%琼脂糖电泳鉴定产物，数码照相并行灰度值分析(Labwork40分析软件)。以目的产物灰度值表示结果。

免疫组织化学：无菌操作下取1，7，14，21，28，35 d Wistar大鼠整个膝关节，固定，脱钙，石蜡包埋，切片。二甲苯脱蜡，水化，0.01柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)高压修复抗原5 min，内源性过氧化物酶阻滞剂阻断其活性，正常鼠血清封闭，兔抗大鼠转化生长因子β3多克隆抗体1∶150稀释，4 ℃过夜，羊抗兔IgGⅡ抗，DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度，苏木精复染、盐酸乙醇分化、返蓝、脱水、透明、封固、镜检。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件采集图像并观察。

主要观察指标：①SP法免疫组织化学染色结果。②半定量RT-PCR检测结果。

统计学分析：采用SPSS 13.0进行分析。凝胶成像灰度用直线回归方法分析鼠龄与灰度值的关系，得到直线回归方程式：y=0.569 8x+77.506，两者之间有显著相关性，P=0.003。

讨论

近年来组织工程发展迅速，半月板愈合相关研究较多，人工支架结合细胞因子、人工支架结合干细胞等思路为半月板治疗带来新的希望^[6-11]。 Rubinstein等^[9]对28例半月板关节镜下切除术患者进行5.3年随访，12例发生了骨性关节炎，7例发生了严重骨性关节炎，5例进行了全膝关节置换，1例考虑中，其他还存在一些症状。单纯半月板部分切除术后长期随访发现：大部分病例X射线片膝关节有退行性改变，发生骨关节炎。因此，应当尽可能地修复、保留损伤的半月板^[10-13]。实际临床研究则指出在特定情况下，半月板损伤后仍有相当程度愈合能力。Logan等^[13]曾对42名运动员行半月板损伤手术治疗，其中83%患者同时进行前交叉韧带重建，术后随访至平均10.4个月，81%重新恢复至早先运动水平，半月板愈合率明显优于单纯切除半月板者。研究提示韧带重建制备骨道过程中，原骨髓内细胞因子释放进入关节腔，促进半月板愈合。其具体机制仍有待深入研究。

转化生长因子β3属于转化生长因子β超家族成员，可调节细胞生长分化，使正常成纤维细胞表型发生转化，促进成纤维细胞、成骨细胞和许旺细胞生长，可以诱导脊髓间充质干细胞转化为软骨细胞^[14-23]。

采用干细胞进行组织修复极具研究前景。已有研究指出可通过引入组织干细胞促进软骨再生，但是，目前国际上已发表的干细胞促进软骨再生实验研究虽多，但未能得到一致结果，且仍需大量研究说明其作用机制。早期多数学者认为半月板红白区及白区几近无愈合能力，但近年来Logan等^[13]对42名运动员进行该手术，有83%同时做了前交叉韧带重建，平均10.4个月后81%重新从事自己的运动，愈合率明显好于单纯切除半月板的愈合率，提示半月板伤后仍可愈合。Amoczky等^[24]的研究表明：外源性血凝块级存在于其中的各种生长因子能使得犬半月板无血供区的小损伤得到修复，从实验方面证实了血凝块对半月板无血区损伤的修复作用，骨髓内细胞因子起到促进愈合作用。因此，除单纯采用引入干细胞方式促进软骨修复、再生，亦可考虑从软骨发育、损伤修复等方面机制着手，认真探索，寻找促进半月板再生和修复的途径。

Nakata等^[25]在大量基础实验中已经被证实，骨形态发生蛋白具有促进软骨愈合的作用。其中，骨形态发生蛋白2、7等因子明确促进骨组织再生，已有相关商品化产品投入临床。文献报道动物实验中，转化生长因子、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子、骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子等因子可增加关节软骨细胞DNA的合成，促进软骨细胞的增殖等^[26]。本实验中免疫组织化学发现大鼠由出生到成鼠过程中，转化生长因子β3表达从关节囊开始逐渐扩展至红区、红白区、白区；RT-PCR结果显示上述过程中转化生长因子β3表达增加，生长至成鼠后表达趋于稳定。不同鼠龄的半月板中转化生长因子β3均可见表达，发育过程中转化生长因子β3表达逐渐增加，至成鼠后表达情况趋于稳定。

文献检索结果显示目前大多数半月板相关研究均认为，转化生长因子β在半月板发育、修复中起到重要作用^[27]。而现今仅限于对转化生长因子β1作用的探索，且水平参差不齐，均认为其在损伤修复起到重要作用。但是，转化生长因子β1同样在软骨损伤炎症发展过程中起重要作用，不有利于组织修复。研究指出，转化生长因子β1/Smads信号转导通路促进炎症反应发生，其中转化生长因子β1是中性粒细胞和单核细胞的有力趋化剂^[28]。若使转化生长因子β1过度表达，或引入外源性转化生长因子β1，可引发炎症或加重炎症反应^[29-30]，不利于组织修复，无法达到组织工程意义的修复目标。

目前尚未有研究阐诉转化生长因子β1在体内同时表达的异构体转化生长因子β3在半月板发育、损伤修复中的作用。转化生长因子β3是能调节细胞生长和分化的转化生长因子β超家族一员。能使正常成纤维细胞的表型发生转化；对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要调节作用；促进成纤维细胞、成骨细胞和许旺氏细胞的生长；诱导脊髓间充质干细胞分化为软骨细胞。本研究意在通过测定转化生长因子β3在大鼠半月板发育过程中的表达情况，分析其表达的时间和空间分布特点，为今后促进半月板愈合相关研究提供新的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程