牛肌腱冻干脱细胞支架的生物力学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.30.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前的脱细胞方法在去除细胞的同时对细胞外基质存在一定的损伤，降低了脱细胞支架的生物力学性能。
目的：分析冻干牛肌腱脱细胞支架的生物力学特性。
方法：取新鲜小牛趾伸屈肌腱，去除小牛肌腱表面的滑膜、腱膜及软组织，双蒸水冲洗干净后低压冻干，通过物理方法制备肌腱纤维束60个，随机均分为两组，实验组于无菌操作下置入丝氨酸蛋白酶抑制剂，室温下持续24 h，无菌PBS冲洗后，再移入低浓度胰酶+乙醇混合溶液中，在不破坏细胞外基质的情况下去除细胞壁，室温下持续5 h，再将纤维束移入脱氧核糖核酸酶溶液中持续5 h，最后将已完成脱细胞步骤的支架使用PBS冲洗48 h，无菌室内室温下干燥；对照组不做处置。检测两组材料的弹性模量、耐久性及最大应力。
结果与结论：两组耐久性相似，但实验组在相同位移处的应力小于对照组；两组弹性模量比较差异无显著性意义，但实验组最大应力低于对照组(P < 0.01)。说明冻干脱细胞支架能够在一定程度上模仿牛肌腱的生物力学功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 脱细胞支架, 韧带, 冻干, 生物力学, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Current decellularized methods have the certain damage to the extracellular matrix and reduce the biomechanical properties of acellular scaffolds.
OBJECTIVE: To explore the biomechanical properties of decellularized scaffold of lyophilized bovine tendon.
METHODS: Sixty lyophilized fiber bundles from fresh flexion tendon of calf toes were randomly divided into two groups: control group and experimental group. In the experimental group, serine protease inhibitors were placed aseptically for 24 hours at room temperature, then the samples were rinsed with PBS and transferred to the low concentration of trypsin+ethanol mixed solution to remove the cell wall without destruction of the extracellular matrix at room temperature for 5 hours; after that, the fiber bundles were cultured in DNA enzyme solution for 5 hours, finally the acellular scaffold was completed and rinsed with PBS for 48 hours and dried at room temperature in sterile room. No treatment was done in the control group. Modulus of elasticity, durability and maximum stress were determined in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Similar elastic modulus and durability were found in the two groups, but the maximum stress in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.01). These findings indicate that the lyophilized acellular tendon fibers can mimic the biological function of bovine tendon
fibers to a certain extent.

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中图分类号:

R318

钱闯，陈雄生，周盛源，朱巍. 牛肌腱冻干脱细胞支架的生物力学特性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(30): 4865-4869.

Qian Chuang, Chen Xiong-sheng, Zhou Sheng-yuan, Zhu Wei. Biomechanical properties of a decellularized scaffold of lyophilized bovine tendon[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(30): 4865-4869.

图/表（结果） 2

2.1 实验样本分析本次实验共测试了两组各30个样本，共计60个样本，其中有7个样本(对照组3个，试验组4个)实验失败，均在步骤⑤时提前断裂，断裂处均位于用于固定的钳夹处。其失败的原因可能是：将纤维束安装到试验机的过程中并没有与实验拉伸方向平行，导致钳夹处剪切力增大，产生对样本切割，使样本在钳夹出撕裂。其余53个样本均断裂在样本中部。经脱细胞处理纤维束的质量较未处理的纤维束有所减轻，但是差异不大(P=0.91)。在脱细胞处理后，实验组纤维束的长度仍然为70 mm。

2.2 耐久性实验结果在耐久性检测中发现，两组样本在一次应力之后在同样拉伸情况下所需要的应力均出现下降，实验下降更加明显，其中对照组为10-9.84 MPa，实验组为10-9.38 MPa。在接下来的循环中，两组应力也均呈现出不断下降的趋势(图1)，而在8次循环之后，实验组的应力变化趋于平稳。在两组间比较中可见，实验组在每个循环中所需的应力均小于对照组(图2)。

2.3 弹性模量实验结果实验每个样本均能得到1个应力-应变曲线图，取每条曲线上的直线部分的斜率为每个样本的弹性模量，利用独立样本间t检验的方法比较，结果显示样本符合正态分布(P=0.832)，对照组弹性模量为(312±41) MPa，实验组为(278±43) MPa，两组弹性模量比较差异无显著性意义[95%置信区间(-7.209 31， 60.790 6)，P=0.74]。

2.4 最大应力实验结果两组样本最后均在100 mm/min的拉伸速度下达到样本中部的断裂，此刻的应力即是每个样本的最大应力。利用独立样本间t检验的方法比较，结果显示样本符合正态分布(P=0.458)，对照组最大应力为(54.80±7.49) MPa，实验组最大应力为(42.78±6.88) MPa，

两组最大应力比较差异有显著性意义[95%置信区间 (7.420 28，16.631 7)，P < 0.001]。

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引言

临床上韧带损伤后自身愈合能力差，需要应用替代物进行韧带的修复重建，当前韧带替代物主要包括自体移植物、异体移植物、异种移植物、人工合成材料和天然材料。虽然自体韧带移植为最有效的修复重建方法，成为韧带修复重建的金标准，但康复时间长甚至康复不满意，同时也会出现自体供区疼痛、肌腱炎、肌肉萎缩等并发症而不能广泛应用于临床^[1]。前交叉韧带撕裂的同种异体组织移植已取得了短期的良好疗效^[2-4]，但这些异体组织价格高昂，实用性差，可能有传播疾病的危险。另外，这些异体组织的消毒方法还没有统一的标准，可能会对其生物机械特性产生负面效果。异种材料移植同样在前交叉韧带的重建中被研究，研究表明异种材料的机械应力不佳并有移植物撕裂的报道^[5]。由于肌腱韧带的特殊性质及其高强度的工作环境，使得该方面的组织工程研究变得异常困难。脱细胞技术能保留韧带良好的生物力学特性，仿生三维结构，使得宿主对异体、异种韧带支架的免疫排斥已显著降低^[2-3]。脱细胞支架实质是细胞分泌的产物，组织或器官在其基础上形成。细胞外基质的组成和超微结构由影响细胞表型的因素决定，包括力学、生物化学环境、对氧的要求、pH值和固有的基因表达模式。反过来，细胞外基质又影响细胞的生物行为和表型。基质的组成和结构显著影响细胞黏附、增殖和三维排列^[6]。理想的脱细胞支架制备方法应既能有效去除组织中的细胞成分，最大程度降低材料的免疫原性，又能保留相对完整的三维支架结构，保持足够的生物力学强度，以满足组织修复重建的需要^[7]。脱细胞处理的典型方法包括在低渗盐水中广泛漂洗，用稀释的过氧乙酸(0.1%)处理或在Triton 100×中培育，然后用环氧乙烷或γ辐照消毒。这些方法已被证明可完全去除细胞成分，降解< 300 bp的核酸碎片且保留生长因子如碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的生物活性^[8]。猪小肠黏膜下层是富含Ⅰ型胶原的结缔组织，进行脱细胞后，卷曲而成圆柱体型的脱细胞支架，具有良好的力学性能和组织相容性，有利于细胞黏附、生长及增殖，并且能够在体内快速降解^[9]。同种异体组织由于其天然结构确实可以用来制作脱细胞支架，然而毕竟这些组织并非自身的，目前，出现了很多有关同种同体和同种异体材料之间重建前交叉韧带的比较，许多研究表明两者之间并无显著差异^[10]。但有一些报道指出，同种异体移植较同种同体纤维更有可能引起膝关节松弛和韧带断裂^[11]。有体内试验指出，同种异体组织的重建时程要长于同种同体组织，但其主要过程是相似的(组织坏死、细胞增殖和完全替代)^[12]。自身组织早在移植后的第6周就开始“细胞增殖阶段”，而同种异体组织在早期细胞增殖不明显，甚至没有血管再生^[13]。进一步研究发现，同种异体组织自第6周开始至52周血管数量逐渐增加，而自身组织的血管分布是逐渐减少的。冻干脱细胞支架的特点是在能够完全脱细胞的同时，减少化学脱细胞试剂对基质的损害，其针对性的脱细胞流程也能在不损伤细胞外基质的情况下实现细胞的去除，使脱细胞支架的结构更加完整，拥有与相应组织更为接近的生物力学特征。本实验通过比较经过特殊方式冻干脱细胞处理的牛肌腱与未经脱细胞处理冻干牛肌腱的生物力学特性，探讨其在临床应用上的前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：随机对照实验。

时间及地点：于2013年5月至2014年2月在解放军第二军医大学临床转化医学中心及上海大学力学实验室完成。

材料：小牛趾伸屈肌腱由解放军第二军医大学动物实验中心提供。

实验方法：

肌腱纤维束的制备与实验分组：去除小牛肌腱表面的滑膜、腱膜及软组织，双蒸水冲洗干净后，-80 ℃冻干8 h。低压冻干后通过物理方法，用显微器械将牛肌腱分离成长70 mm、干质量为100 mg的肌腱纤维束。分离过程中尽可能沿纤维走行方向钝性分离，避免操作中对纤维束的损伤。以此方法制备实验用纤维束60个，随机将这60个样本平均分到实验组和对照组内，待实验的纤维束用γ射线消毒后备用。实验组进行脱细胞处理，对照组不做任何处理。

脱细胞处理：将实验组内的肌腱纤维束在无菌操作下置入丝氨酸蛋白酶抑制剂中，室温下持续24 h。无菌PBS冲洗后，再将其移入低浓度胰酶+乙醇混合溶液中，在不破坏细胞外基质的情况下去除细胞壁，室温下持续5 h后，再将纤维束移入脱氧核糖核酸酶溶液中持续5 h。最后将已完成脱细胞步骤的支架使用PBS冲洗48 h，无菌室内室温下干燥。待完全干燥后称质量，测长度。比较脱细胞前后肌腱纤维的质量及长度差异。

生物力学实验：测试当天，由于室温速凝环氧树脂在固化时会放出大量的热，将对样本造成严重的烧灼，所以本次实验将样本取出后直接安装到德国ZWick/Roell试验机上，用夹具在样本两端各钳夹10 mm的组织，最后将样本调整到与实验轴线平行。加载至1 N，用游标卡尺量取样本中部的宽度和厚度作为横截面积。整个实验过程每隔约10 min喷洒1次生理盐水雾剂，以保持韧带的湿润。

具体实验步骤如下：①预处理阶段，在原长的0-2%之间做10个循环，速度为10 mm/min，以保证所有的样本都有共同的应变历程。结束后卸载至0 N，停留30 min，等待黏弹性影响基本消除。②加载至2 MPa，速度100 mm/min，保持位置不变15 min，记下此时的位置L1；结束后卸载至0 N，停留30 min。③加载至10 MPa，保持位置不变15 min，记下此时的位置L2；结束后卸载至0 N，停留30 min。④在L1-L2之间循环加载15次，3次循环/min，结束后，卸载至0 N，停留30 min。⑤加载速度30 mm/min，加载至 30 MPa，记录下载荷-形变曲线。卸载至0 N，停留30 min。⑥加载至样本断裂，速度为100 mm/min，记录下最大载荷。⑦记录各个样本的应力(MPa)、应变(%)、时间(s)。每次测试后会得到1组载荷(N)、时间(s)、形变(m)的数据。根据应力(MPa)=载荷(N)/横截面积(m²)，应变(%)=形变(m)/原长(m)。根据步骤②-④，可以得到每个样本每次相同形变下的应力变化，根据步骤⑤中的载荷-形变曲线可以绘出应力-应变曲线，其弹性模量(E)取应力-应变曲线线性部分的斜率。根据步骤⑥，可以得到每一个样本的最大载荷及最大应力。

主要观察指标：两组样本的生物力学实验结果。

统计学分析：本次实验均应用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理。以P < 0.05为差异有显著性意义。根据对照组与实验组两组样本间的质量，采用独立样本t 检验的方法，比较两组间样本质量上的差异，根据实验组脱细胞前后的样本质量数据，采用配对样本t 检验方法，比较脱细胞前后样本的质量差异。

讨论

胶原的临床应用可以追溯到20世纪30年代，当时应用于外科缝合的羊/牛肠线的主要成分便是化学法交联处理后的牛/羊肠组织胶原纤维^[14]。当时便有大量关于肠线过敏及组织相容性的争论文献^[15]。随着免疫化学的兴起，肠线的良好组织相容性得到了公认。利用胃蛋白酶消化的Ⅰ型胶原是目前应用最为广泛的胶原植入物，普遍认为牛胶原的超敏反应发生率在2%-4%，在接受胶原植入后，牛胶原过敏的概率提高了1%^[16]。脱细胞的过程旨在消除宿主对移植物/器官的免疫反应^[17]。移植物中的细胞核残留物、DNA及细胞蛋白等细胞成分均被认为是主要的免疫原^[18-19]。诸多应用常规脱细胞方法制作的简单组织(例如皮肤^[20]、肠黏膜^[21]、心包^[22]、血管^[23]、软骨等^[24])和大型器官支架(例如肝脏、肾脏等^[25])已在临床上得到了初步实验，证明了移植物的免疫原性降低确实能够通过脱细胞来完成。由于肌腱韧带的特殊性质及其高强度的工作环境，使得其损伤后的修复和组织工程研究变得异常困难。而临床上由于退变和损伤需要进行肌腱韧带延伸、替代治疗的患者数量又十分庞大，而且损伤的部位多变，每个部位肌腱韧带的机械应力性质又均不相同。作为肌腱韧带修复治疗“金标准”的自体韧带移植，又一直受供体数量限制无法满足大众的需要。用生物细胞外基质材料作为可降解支架，用异体或自体脱细胞支架来修复肌腱的方法是近几年提出的^[4]。已有一些体内试验证实这些基质可以调节肌腱的重建。但Chen等^[5]仍然在回顾这些产品的治疗结果时发现了一些问题，如机械应力不足，杂质的免疫原性反应，潜在的致病菌污染等均是这些自体、异体脱细胞支架所面临的问题^[26]。分离肌腱纤维是制作脱细胞支架的第一步，肌腱纤维的分离方法可以有物理方法、化学方法及热法磨浆。然而化学方法、热法磨浆等法会破坏胶原纤维中的主要成分Ⅰ型胶原，而使其蛋白变性^[27]。因此，目前只有物理分离法较为适合肌腱纤维的分离。冻干处理的肌腱纤维能够在保持其生物活性的情况下使肌腱纤维更易于分离^[28]。在本次组织工程支架的脱细胞过程中，由于去除了肌腱纤维表面腱膜的保护，能够利用低浓度的胰酶和EDTA，而不需要使用诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、TBP或者Triton X-100等洗涤剂^[29-32]，这使得支架中的胶原蛋白得到了最大程度上的保护^[33]。在去除细胞成分后，脱细胞支架的结构、长度和干质量均未出现较大差异，这可能与本次实验使用的脱细胞试剂较为温和有关，在此推测应用低浓度的胰酶和EDTA可在对肌腱细胞洗脱完全的前提下，对肌腱的细胞外基质造成较小的损伤。当然以上的推测仍需要进一步实验证实。生物力学实验结果显示，脱细胞支架在经过处理后虽然与正常牛肌腱相比有所降低，但相较于人膑韧带的最大应力(26.6-95.5 MPa)^[34]，仍在符合人体韧带修复的范围内。脱细胞处理后，肌腱耐久性和最大应力下降，其中原因可能是脱细胞支架处理过程中对胶原纤维间的连接损伤及纤维细胞的缺失造成的。这方面的不足可以参照非生物材料合成的支架，应用物理、化学等交联法加强纤维间的联系。人体各个部位肌腱的弹性模量均不相同，主要原因在于人体各个部位肌腱所承担的功能不同，对肌腱形变的要求均不相同，所以真正的人工肌腱需高度与正常肌腱的弹性模量相吻合^[35]。本次实验结果显示，脱细胞支架在经过处理后弹性模量并未出现显著下降，这表明了经过脱细胞处理的肌腱能够在一定程度上模仿正常肌腱的运动功能。课题组前期进行了有关异体兔膑韧带脱细胞支架材料生物相容性的初步研究，结果也提示脱细胞支架的免疫原性和生物相容性能够适应机体损伤的修复。在接下来的实验中，将针对冻干牛肌腱脱细胞支架异种间植入的组织相容性进行相应研究。结论：牛肌腱冻干脱细胞支架是一种对肌腱细胞外基质损伤较小的脱细胞方法，脱细胞后的肌腱纤维能够在抗牵张力上提供与正常组织类似的限制作用。而且实验还提示脱细胞支架的弹性形变性质与原肌腱类似，使脱细胞后的肌腱纤维拥有与未处理肌腱纤维相似的生物学特性，为其在临床应用中可以更好地满足患者的生理需求提供了可能。

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