纳米羟基磷灰石聚酰胺复合材料在人工肱骨头柄界面的结合能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.30.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：纳米羟基磷灰石/聚酰胺66是一种新型的纳米仿生复合材料，具有良好的组织相容性以及骨传导性，但其植入体内后和骨界面的接合生长如何、临床应用是否安全等尚需要进一步研究。

目的：观察纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料在人工肱骨头柄界面的结合能力。

方法：将兔随机分为2组，均进行肩关节肱骨头转换，复合材料组植入纳米羟基磷灰石/聚酰胺人工肱骨头；对照组植入自体髂骨。置换后对兔进行骨髓间充质干细胞原代培养，再将骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料共培养进行观察。

结果与结论：细胞培养24 h后，骨髓间充质干细胞在复合材料局部生长情况较好。复合材料组培养1，4 h的细胞黏附率显著高于对照组(P < 0.05)。复合材料组共培养4.5，5.5，6.5 h细胞吸光度值百分率值显著高于对照组(P < 0.05)；置换24周后复合材料组表面骨组织、纤维层的比例变化幅度及覆盖率最高(P < 0.05)。结果证实，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料植入体柄具有一定的界面骨结合能力，可使界面骨整合良好。

关键词: 生物材料, 纳米材料, 纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料, 人工肱骨头柄界面, 结合能力, 界面骨整合, 细胞黏附数量, 细胞形态, 细胞生长曲率, 骨髓间充质干细胞, 细胞生长

Abstract:

BACKGROUND: Nano-hydroxyapatite/polyamide 66 is a new nanobionic composite material and has good biocompatibility and bone conduction, but after implantation, whether the composite material can bind to vertebral bone interface and whether it is safe in clinical use still need further studies.

OBJECTIVE: To observe the ability of nano-hydroxyapatite/polyamide composite binding to the interface of artificial humeral head.

METHODS: The rabbits were randomly divided into two groups: composite group was implanted with nano-hydroxyapatite/polyamide composites; control group implanted with autologous bone. After the replacement, rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were subjected to primary culture, and then the cells were co-cultured with the composite material.

RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours after culture, bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the composite materials. The cell adhesion rate was significantly higher in the composite group than the control group at 1 and 4 hours after culture (P < 0.05). After co-culture 4.5, 5.5, 6.5 hours, the absorbance value of cells in the composite group was higher than that in the control group (P < 0.05). At 24 weeks after replacement, changing ranges in the proportions of bone tissue and fibrous layers on the implant surface as well as coverage rate in the composite group were the highest (P < 0.05). These findings indicate that the nano-hydroxyapatite/ polyamide composite implant has a certain binding capacity, which can make a good interface osseointegration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Humerus, Stem Cells

中图分类号:

R318

刘勇，黄伟. 纳米羟基磷灰石聚酰胺复合材料在人工肱骨头柄界面的结合能力[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(30): 4764-4768.

Liu Yong, Huang Wei . Binding capacity of nano-hydroxyapatite/polyamide composite material on the interface of artificial humeral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(30): 4764-4768.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] 孟纯阳,安洪,蒋电明,等.新型纳米骨重建和修复材料基磷灰石/聚酰胺体内植入的生物相容性及安全性[J].中国临床康复,2004, 8(29):6330-6333.
[2] 李鸿,李玉宝,严永刚,等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66多孔材料制备和生物安全性初步评价[J].生物医学工程杂志,2008,25(5): 1126-1129.
[3] 相子民,应大君,吴雪晖,等.自制异体骨腰椎间融合器的力学测评[J].第三军医大学学报,2007,29(12):1237-1239.
[4] Ito Z, Matsuyama Y, Sakai Y, et al. Bone union rate with autologous iliac bone versus local bone graft in posterior lumbar interbody fusion. Spine (Phila Pa 1976). 2010;35(21): E1101-E1105.
[5] 殷小平,夏忠斌,游建友,等.血管内支架成形术治疗颅内动脉狭窄性短暂性脑缺血发作的疗效观察[J].临床神经病学杂志,2011, 24(3):188-190.
[6] Watanabe K, Yamazaki A, Morita O, et al. Clinical outcomes of posterior lumbar interbody fusion for lumbar foraminal stenosis: preoperative diagnosis and surgical strategy. J Spinal Disord Tech. 2011;24(3):137-141.
[7] Bansal S, Chauhan V, Sharma S, et al. Evaluation of hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate mixed with bone marrow aspirate as a bone graft substitute for posterolateral spinal fusion.Indian J Orthop. 2009;43(3): 234-239.
[8] 王高举,王清,王松,等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合生物活性人工椎体在骨质疏松性胸腰椎爆裂骨折前路手术中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(38): 7579- 7582.
[9] 何斌,蒋电明,欧云生,等.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66人工椎体置入与椎体重建[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(47):8889-8892.
[10] 嵇伟平,韩培,蒋垚.纳米骨植入材料表面结构及作用机制研究进展[J].国际骨科学杂志,2007,28(2):125-127.
[11] 贾德民,古菊,周扬波,等.新型改性纳米碳酸钙对天然橡胶的补强作用[J].华南理工大学学报:自然科学版,2004,32(3): 94-97.
[12] 孙水升,李春忠,张玲,等.纳米二氧化硅颗粒表面设计及其填充聚氯乙烯复合材料的性能[J].高校化学工程学报,2006,5(20): 798-804.
[13] 李颖华,曹丽云,黄剑峰,等.生物医用纳米羟基磷灰石的性质及其制备[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(41): 8143-8146.
[14] 王海斌,赫淑清,赵冬梅,等.羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架材料的制备及生物安全性[J].复合材料学报,2008, 25(6):88-92.
[15] 陈琦,王大平,刘建全.纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合材料制备及生物相容性研究[J].国际骨科杂志,2010,31(6):349-351.
[16] 张凯,王大平,刘建全.仿生增强型纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架研究现状[J].国际骨科杂志,2010,31(6):352-357.
[17] 强小虎,张杰.纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合材料的性能测试[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(5):911-913.
[18] Neuendorf RE, Saiz E, Tomsia AP, et al. Adhesion between biodegradable polymers and hudroxyapatite: relevance to synthetic bone-like materials and tissue engineering scaffolds. Acta Biomater. 2008,4(5):1288-1296.
[19] Niu X,Fan Y,Liu X,et al. Repair of bone defect in femoral condyle using microencapsulated chitosan, nanohydroxyapatite/collagen and poly (L-lactide)-based microsphere scaffold delivery system. Artif Organs. 2011; 35(7):1525-1594.
[20] Kruyt MC,de Bruijn JD,Yuan H,et al. Optimization of bone tissue engingeering in goats: a preoperative seeding method using cryopreserved cells and localized bone formation in calcium phosphatescaffolds. Transplantation. 2004;77(3):359-365.
[21] 张凯,王大平,朱伟民,等.骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石支架材料题外相容性研究[J].中国临床解剖学杂志,2011, 29(2):213-217.
[22] Phipps MC, Clem WC, Catledge SA, et al. Mesenchymal stem cell responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of poly caprolactone, collagenⅠand nanoparticulate hydroxyapatite. PLoS One. 2011;6(2): e16813.

[23] 戚孟春,邓久鹏,董伟,等.骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养生物活性研究[J].口腔医学研究,2011, 26(6):805-808.
[24] 代震宇,李军,赵增辉,等.纳米羟基磷灰石/聚氨基酸符合材料生物安全性评价[J].第三军医大学学报,2010,32(21):2294- 2298.
[25] 李鸿,李玉宝.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66多孔材料制备和生物安全性初步评价[J].生物医学工程杂志,2008,25(5): 1126- 1129.
[26] Nandi SK, Kundu B, Ghosh SK, et al. Efficacy of nano-hydroxyapatite prepared by an aqueous solution combustion technique in healing bone defects of goat. J Vet Sci. 2008;9(2):183-191.
[27] Xu Q, Lu HY, Zhang JC, et al. Tissue engineering scaffold material of porous nanohydroxyapatite/polyamide 66. Int J Nanomed. 2010;5:331-335.
[28] Smith IO, McCabe LR, Baumann MJ. MC3T3-E1 osteoblast attachment and proliferation on porous hydroxyapatite scaffolds fabricated with nanophase powder. Int J Nanomed. 2006;1(2):189-194.
[29] 谢红军,王银龙,周健,等.纳米羟基磷灰石复合骨髓基质细胞修复兔股骨缺损的实验研究[J].口腔医学,2008,28(3):154-156.
[30] Steinbrech DS, Mehrara BJ, Rowe NM, et al. Gene expression of TGF-beta, TGF-beta receptor, and extracellular matrix proteins during membranous bone healing in rats. Plast Reconstr Surg. 2000;105(6): 2028- 2038.
[31] 胡波,杨述华,肖德明,等.血管内皮生长因子复合纳米羟基磷灰石人工骨修复兔桡骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(32):6209-6212.
[32] 刘阳,朱立新,王庆波,等.可注射性n-HA/CS-BMSCs复合物修复兔股骨缺损的实验研究[J].中国临床解剖学杂志,2010, 28(4):421-429.
[33] 蒋电明,权正学,欧云生.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合生物活性人工椎体在胸腰椎爆裂骨折中的应用[J].中华创伤杂志, 2006,12:884-887.
[34] 蒋电明,权正学,黄伟.纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合生物活性人工椎板的初步临床应用[J].中国修复重建外科杂志,2007, 5:441-444.
[35] 代震宇,李军,蒋电明.纳米羟基磷灰石/聚氨基酸复合材料生物安全性评价[J].第三军医大学学报,2010,21:2294-2299.
[36] 许勇,朱立新,田京.纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料与兔骨髓间充质干细胞的生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(8):1423-1426.
[37] 黄谦,吴涛,梁杰.全骨髓培养法和密度梯度离心法分离hBMSCs的比较研究[J].中国修复重建外科杂志,2009,23(11): 1360-1364.

引言

假体植入骨组织内，假体表面将和接触的骨组织之间形成一个界面^[1]。常规材料更多的以金属材料为主，该材料具有较高的综合力学性能，但是金属材料属于惰性材料缺乏有效的生物活性界面，从而造成界面骨能力低。近年来，随着中国医疗技术的飞速发展人工肱骨头在临床上也经常使用，而且目前使用带有纳米涂层的人工假体，以利于骨组织长入^[2]。近年来，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料在人工髋关节置换中广为使用，且效果理想。纳米羟基磷灰石是临床上使用较多的材料之一，该材料和其他材料相比生物相容性较高，并且该材料还具有良好的骨传导性^[3]。聚氨基酸也是临床上使用较多的材料，该材料具有良好的生物相容性及降解特性，且在骨科疾病患者中得到广泛应用。同时，聚氨基酸还具有良好的生物活性，材料降解速度能够调节，对人体也不会产生伤害。有研究采用羟基磷灰石/胶原蛋白混合材料制成13周内可被吸收的人工椎体^[4]，并且能够吸附人类重组2型骨形态发生蛋白，能够促进骨痂生长，能有效防止内植物塌陷。殷小平等^[5]进行了一次实验，实验中将纳米羟基磷灰石/聚氨基酸通过原位聚合法复合，研制出综合性能比较良好的复合材料，并将其运用于颅内动脉狭窄性短暂性脑缺血发作患者中，实验结果显示：这种材料和其他材料相比力学强度好，降解速率能够调节等而在临床上得到使用。但是，目前临床上对于纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料在人工肱骨头柄界面的结合能力尚存在较大的争议，植入体内后和骨界面的接合生长如何、临床应用是否安全等尚需要进一步研究^[6]。文章以此分析了纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料在人工肱骨头柄界面的结合能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2014年5至12月在重庆医科大学实验室完成。

材料：

实验动物：成年六七周龄大白兔20只，体质量为2.3-2.5 kg，雌雄不限，实验动物均由南方医科大学动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号：SCXK(粤)2007-0010。

复合材料：实验主要利用纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料取右肩前外侧切口约50 mm，放置纳米羟基磷灰石/聚酰胺人工肱骨头，由苏州市欣荣医疗器械有限公司特制。纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料制备采用原位聚合法。复合材料直径为5 mm，厚度为2 mm圆片状，其中，纳米羟基磷灰石质量比占30%，且材料占包含了4种氨基酸：6-氨基乙酸、γ-氨基丁酸、L-脯氨酸和赖氨酸，材料由四川国际纳米技术科技有限公司制备和提供^[7]。

复合材料相容性观察实验相关仪器及试剂：
仪器及试剂	来源
恒温培养箱	索尼，日本
EL800酶标仪	Bio-Tek，美国
CO₂细胞培养箱	LRB MODEL 2300，美国
倒置相差显微镜	Olympus，日本
电压力蒸汽消毒器	上海仪器总厂，中国
DMEM	Gibco，美国
胎牛血清	Hyclone，美国
二甲基亚砜	Sigma，美国

实验方法：

分组：将20只兔随机分为2组，复合材料组10只植入纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料；对照组10只，植入大白兔自体髂骨。

肱骨头置换方法^[7-9]：①体位。大白兔保持侧俯卧姿势，便于术中各方向活动；对于需要外侧显露途径时，让大白兔保持仰卧姿势。②与显露任何途径均可充分显露。如有肱骨头屈曲挛缩，宜用前侧切口。后侧手术显露途径较简单，损伤小，临床多采用。③显露关节囊后，将关节囊“T”型或“I”型切开，向两侧翻开，并推开关节囊，充分显露肱骨头。④安放置换材料，并进行适当的修正、复位等操作步骤。⑤引流。

兔骨髓间充质干细胞原代培养：麻醉后将置换后的兔处死^[10]，分离骨膜，沿着骨长轴方向进行转孔，然后进行PBS冲洗，搜集骨髓，加入PercoⅡ梯度液，并进行离心(离心速度为2 000 r/min，时间30 min)，采用显微镜对大白兔细胞形态等信息进行观察，了解大白兔细胞贴壁情况并进行换液^[11]。

兔骨髓间充质干细胞与复合材料共培养：将纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料在完全培养基内浸泡24 h后，并将其放在24孔板内，并加入1 mL培养基。根据1×10⁶细胞浓度将兔骨髓间充质干细胞放在培养板内进行培养，隔日换液^[12]，将培养24 h的兔骨髓间充质干细胞设为对照组。

主要观察指标：

接种后细胞生长情况：采用CCK-8试剂和酶标仪对各组细胞吸光度值进行检测，观察共培养1，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5 h的细胞生长情况^[13-14]。

假体表面骨组织、纤维层变化：置换后3，6，12，24周，兔假体表面骨组织、纤维层所占的比例变化幅度。

兔骨髓间充质干细胞和复合材料共培养的形态学变化：培养24 h后，光学显微镜下观察各组成骨、骨愈合和材料在体内变化，材料与骨界面及表面新骨及血管形成情况^[15]。

细胞黏附率：接种后1，4 h后在不同的时间段分别取4个不同的样本，加入PBS洗涤液冲洗，采用体积分数0.25%胰酶消化贴壁细胞，观察并记录贴壁细胞的数量以及总的细胞数量，根据相关公式计算出各组细胞黏附率(细胞黏附率=贴壁细胞数/细胞总数×100%)^[16]。

X射线检查：置换后4，12，24周采用X射线检查，拍摄兔肩关节正侧位片^[13]。

统计学分析：计量资料用以x(_)±s表示，计数资料用百分率表示，组间数据差异的比较采用t 检验和χ²检验，P < 0.05作为差异有显著性意义。

讨论

纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料植入体柄在人工髋关节置换中广为使用，且效果理想^[17-18]。本次实验中，随着时间的不断增长，大白兔表面骨组织、纤维层出现上升趋势，且置换后24周时表面骨组织、纤维层所占的比例变化幅度最高。纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料能够和受体骨完全结合并且最终演化为患者自身的材料，避免了界面的存在而引起碎屑等而造成假体的松动等^[17-18]。同时，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料和其他材料相比优势较多，该材料本身所具备的弹性模量十分接近人体皮质骨，从而能够有效的降低应力产生的遮挡^[19]。本次实验中看出：培养24 h后，复合材料和对照组细胞形态差异不显著，且骨髓间充质干细胞在复合材料局部生长比较良好纳；同时，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料表面能够形成一层由成骨细胞等组成的致密的细胞层，能够在皮质骨髓腔一侧形成另一个细胞层。出现这种现象的原因是多方面的，而对于后者可能是由于人体周围的组织，如内外骨膜、骨髓以及骨质等具有成骨细胞的组织^[20]。同时，本次实验中还发现界膜内存在间充质细胞，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料表面成骨细胞的来源相对比较多，由此看出：纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料具有一定的骨诱导作用^[21-22]。本次实验结果显示，复合材料组培养1 h细胞黏附率为67%，培养4 h黏附率为89%，显著高于对照组，这种结果显著高于其他文献结果(骨结合力为60%)，其原因相对较多，如机械性方式^[22]。相关研究结果显示：假体表面具有的特征在一定程度上取决于该材料周围骨基质修复重建效果^[23-24]。假体材料表面粗糙程度不同、周围骨基质中成骨细胞发生的有丝分裂以及骨生长因子基因的表达也不尽相同^[25-26]。纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料属于纳米级羟基磷灰石成分，并且材料中混合了聚酰胺，羟基磷灰石警惕结合和晶体度和人骨磷灰石十分相似，能够降低颗粒直径，使得假体比表面积及其粗糙度得到增加，从而能够保证材料具有较好的抗剪切力、拉力以及压力，从而决定了该材料具有良好的骨传导和骨诱导能力^[27-28]。本次实验显示，两组置换4，12周后界面骨结合能力差异不显著；复合组材料置换24周后骨结合能力显著优于对照组。纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料中的羟基磷灰石能够电解出Ca、P等离子，能够和患者体内的Ca、P等离子结合在一起并在表面沉积，保证复合材料具备较高活性，能够增加患者骨愈合能力，保证患者手术初期假体就具有良好的稳定性^[29-30]。根据相关研究结果显示：纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料具有良好的对成骨细胞吸附能解力^[31-32]，材料中羟基磷灰石和常规羟基磷灰石相比，成骨细胞和纳米羟基磷灰石表面贴附更加明显，可能和纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料的高比表面积和活性有关^[33]；同时，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料还能够增加血清蛋白生物活性，从而促进骨形成，并且材料还能够降低纤维细胞的粘附作用^[34-35]。本次实验中，两组细胞培养1，2.5，3.5 h时生长差异不显著；复合材料组培养4.5，5.5，6.5 h细胞吸光度值显著高于对照组，由此看出：随着时间的不断延长，复合材料的骨结合面更加稳定，吸光度更强^[36-37]。但是，本次实验受到研究时间以及样本量等因素的限制，还存在一些缺陷和不足，还需要在今后的研究中予以不断完善。综上所述，纳米羟基磷灰石/聚酰胺复合材料植入体柄具有一定的界面骨结合能力，能够经过机械、化学和生物结合等使界面骨整合良好，适合基层医院推广使用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程