多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢中结缔组织生长因子及基质金属蛋白酶9的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.027

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明，卵泡发育、成熟、排卵和黄体形成以及退化等卵巢的生理过程都涉及细胞外基质的形成，而基质金属蛋白酶9和结缔组织生长因子与细胞外基质的形成有着密切的关系。
目的：探讨卵巢中结缔组织生长因子及基质金属蛋白酶9的表达与多囊卵巢综合征的关系。
方法：将有规律动情周期的SD雌性大鼠随机分为2组，模型组大鼠采用来曲唑灌胃建立多囊卵巢综合征模型，对照组灌胃等量的羧甲基纤维素。当模型组大鼠动情周期固有规律不存在，连续出现间期时采集大鼠的血清和卵巢组织，对照组在其间期采集标本进行检测。
结果与结论：放射免疫分析法和免疫组织化学染色法检测显示，与对照组相比，模型组的血清促黄体生成激素、血清垂体泌乳素、窦前卵泡卵泡膜胞浆中的结缔组织生长因子、卵泡基底膜胞浆结缔组织生长因子、白膜结缔组织生长因子以及黄体中基质金属蛋白酶9表达量明显升高(P < 0.05)，促卵泡激素、血清雌二醇和卵泡基底膜中的基质金属蛋白酶9表达量则明显降低(P < 0.05)。结果证实，结缔组织生长因子可能与多囊卵巢综合征中可能与小卵泡的过多生长和排卵障碍有关，基质金属蛋白酶9可能与多囊卵巢综合征中的排卵障碍有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 基因病毒载体及相关因子动物模型, 多囊卵巢综合征, 结缔组织生长因子, 基质金属蛋白酶9, 细胞外基质, 促黄体生成激素, 卵泡基底膜, 大鼠多囊卵巢综合征模型；排卵障碍, 卵巢局部调节因子, DAB显色

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have demonstrated that the physiological process of the ovary, including follicle development, maturity, ovulation, corpus luteum formation and regression, is related to the formation of extracellular matrix. However, matrix metalloproteinase 9 and connective tissue growth factors had a close relationship with the formation of extracellular matrix.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between the expression of connective tissue growth factor and matrix metalloproteinase 9 and polycystic ovary syndrome.
METHODS: The female SD rats with regular estrous cycle were randomly divided into control and model groups. The rats in the model group were intragastrically with letrozole to establish the model of polycystic ovary syndrome, while the rats in the control group were intragastrically with the same amount of carboxymethyl cellulose. When the natural law of estrous cycle of rats in the model group did not exist and consecutive interval appeared, rat serum and ovarian tissues were collected. Rats in the control group were detected by collecting specimen in the interval.
RESULTS AND CONCLUSION: Radioimmunoassay and immunohistochemical staining results showed that compared with the control group, the expression of serum luteinizing hormone, serum prolactin levels, connective tissue growth factor in preantral follicles theca cytoplasm, connective tissue growth factors in follicular basement membrane cytoplasm, connective tissue growth factors in albuginea and matrix metalloproteinase 9 in corpus luteum significantly increased (P < 0.05). The contents of follicle stimulating hormone and serum estradiol, and expression of matrix metalloproteinase 9 in follicular basement membrane significantly decreased (P < 0.05). The
results indicate that connective tissue growth factors may be related to the excessive growth of small follicles and ovulation disorders in polycystic ovary syndrome, while matrix metalloproteinase 9 may be related to ovulation disorders in polycystic ovary syndrome.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Ovary, Connective Tissue Growth Factor, Matrix Metalloproteinase 9, Extracellular Matrix

中图分类号:

R318

孙亚男. 多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢中结缔组织生长因子及基质金属蛋白酶9的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4412-4416.

Sun Ya-nan. The expression of connective tissue growth factor and matrix metalloproteinase 9 in the ovary of rat models of polycystic ovarian syndrome [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4412-4416.

图/表（结果） 4

2.1 造模成功动物数量及过程共收集48只SD大鼠，在制作过程中未出现感染或者死亡现象，100%造模成功，最终48只大鼠进入结果分析。其造模流程图见图1。

2.2 模型方法的改进本次实验使用的是Poresky造模法，并在其基础上将给药方式改为皮下注射，且缩短了给药时间，将实验步骤简单化。
2.3 模型稳定性经过多年的实验验证，使用Poresky法制作的大鼠模型具有较高的稳定性，且大鼠自身的发育机制与人类非常接近，因此常被用来制作各种疾病模型，以降低临床实验的风险。
2.4 两组大鼠内分泌情况分析从表1可以看出模型组血清促黄体生成激素较对照组明显升高(P < 0.05)；模型组促卵泡激素与对照组相比则明显降低(P < 0.05)；模型组血清雌二醇也较对照组偏低(P < 0.05)；模型组血清垂体泌乳素较对照组也明显升高(P < 0.05)；模型组睾酮的与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 两组大鼠结缔组织生长因子在卵巢中的表达尽管结缔组织生长因子在卵巢的颗粒细胞，卵泡基底膜，始基卵泡、白膜和窦前卵泡卵泡膜胞浆中均会表达，但实验结果表明在多囊卵巢综合征大鼠模型组中，不是所有卵巢组织的结缔组织生长因子表达情况都有显著变化。其中模型组大鼠窦前卵泡卵泡膜、卵泡基底膜和白膜胞浆中的结缔组织生长因子表达量较对照组明显偏高(P < 0.05)，见表2。

2.6 两组大鼠基质金属蛋白酶9在卵巢组织中的表达尽管基质金属蛋白酶9在卵巢的颗粒细胞，卵泡基底膜，始基卵泡、白膜和窦前卵泡卵泡膜胞浆中均会表达，但实验结果表明在多囊卵巢综合征大鼠模型组中，不是所有卵巢组织的基质金属蛋白酶9表达情况都有显著变化。只有在黄体和卵泡基底膜胞浆中的基质金属蛋白酶9的表达量变化显著，与对照组比较差异显著，其中模型组黄体中基质金属蛋白酶9表达量较对照组明显升高(P < 0.05)，模型组卵泡基底膜中的基质金属蛋白酶9表达量较对照组明显降低(P < 0.05)。见表3。

参考文献

[1] Lowe P, Kovacs G, Howlett D, et al. Incidence of polycystic ovaries and polycystic ovary syndrome amongst women in Melbourne, Australia. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2005; 45(1):17-19.

[2] 李洪忠,杜艳秋,侯丽辉,等.多囊卵巢综合征对健康的长期影响研究综述[J].世界中西医结合杂志,2012,07(7):630-632.

[3] 吕雯,麻亚茜,娄阁,等.上皮性卵巢肿瘤细胞外基质的表达及意义[J].现代妇产科进展,2002,11(1):21-23.

[4] 赵志明,杨素娟,杨暖,等.MMP-2,-9及其抑制物TIMP-1在多囊卵巢综合征患者黄素化颗粒细胞上的表达[J].生殖医学杂志,2014, 23(6):464-469.

[5] 张静波,李聪,李英红,等.AEG-1和MMP-9在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床相关性和病理特征[J].实用肿瘤学杂志,2013, 27(3):234-238.

[6] 吕跃峰.卵巢组织中结蹄组织、肝细胞生长因子及间隙连接蛋白在多囊卵巢综合征患者中的表达及其干预治疗[J].中国医药导报, 2013,10(19):23-25.

[7] 杨正望,周芳,谈珍瑜,等.不同造模方法对大鼠多囊卵巢综合征模型的影响[J].中国实验动物学报,2010,18(1):13-16.

[8] 马琳琳,吴效科.多囊卵巢综合征产科并发症及其防治[C].全国中西医结合妊娠期疾患专题学术会议论文集,2011:23-26.

[9] 张多加,吴效科.多囊卵巢综合征与表观遗传学[J].中国妇幼保健,2013,28(33):5574-5576.

[10] 王海燕,郑鹏生,曹浩哲,等.两种剂量LE和CC对PCOS不孕患者促排卵效果比较[J].中国妇幼健康研究,2013,24(3):384-385, 397.

[11] 唐小玲,毛绍蓉.更年期雌激素、孕酮、睾酮与肥胖的关系[J].标记免疫分析与临床,2010,17(2):132-133, 121.

[12] 赵岫,张琴,高晓杰,等.小剂量雌激素联合促性腺激素释放素类似物治疗儿童特发性中枢性性早熟[J].新乡医学院学报,2011, 28(4): 454-457.

[13] 曹姗姗,田秀珠.CTGF HGF及Cx 43在多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及二甲双胍的干预作用[J].中国药物与临床,2012, 12(12): 1554-1556.

[14] 孟艳岑,张明敏,崔丹丹,等.补肾、活血对超促排卵小鼠着床期间子宫内膜MMP-2、MMP-9、TIMP-3表达的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2013,42(6):627-632.

[15] 王俊杰,雷小敏,易慕华,等.PCOS患者着床窗口期子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达变化及意义[J].山东医药, 2009,49(50):13-15.

[16] 赵志明,孙亚楠,郝桂敏,等.多囊卵巢综合征患者卵泡液 MMP-2、9及其抑制物水平的研究[J].河北医药,2012,34(10): 1460-1462.

[17] Baka S, Zourla K, Kouskouni E, et al. Matrix metalloproteinases 2 and 9 and their tissue inhibitors in the follicular fluid of patients with polycystic ovaries undergoing in vitro fertilization. In Vivo. 2010;24:293-299.

[18] Lewandowski KC, Komorowski J, O’Callaghan CJ, et al. Increased circulating levels of matrix metalloproteinase-2 and -9 in women with the polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91:1173-1177.

[19] 姚莉娟,徐晓娟,王婧婧,等.体现中医病因病机的多囊卵巢综合征动物模型评价及筛选[J].世界科学技术-中医药现代化,2014, 16(10):2137-3148.

[20] 张海荣,张彦春,王蔼明,等.多囊卵巢综合征模型大鼠血清生长素水平及卵巢组织生长素的表达及意义[J].解放军医学杂志,2012, 37(2):113-116.

[21] 杜芳,王继东,姚珍薇.再生基因Reg IV在多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠卵巢中的表达[J].生殖与避孕,2012,32(11):721-727.

[22] 王铮,张婷婷,朱焰,等.益气养阴化瘀方对多囊卵巢综合征模型大鼠高雄激素血症及胰岛素抵抗的影响[J].生殖与避孕,2010, 30(3):145-150.

[23] 杨正望,尤昭玲,冯光荣,等.多囊卵巢综合征动物模型的构建及中药干预机制述评[J].湖南中医学院学报,2006,26(1):56-58.

[24] 吴雏燕,江钟立,邱树卫,等.一种新的稳定多囊卵巢综合征大鼠模型的建立[J].中国康复医学杂志,2008,23(4):334-338.

[25] Manneras L, Cajander S, Holmang A, et al. A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome. Endocrinology. 2007; 148(8): 3781-3791.

[26] 邝少松,黄小琼,饶子亮,等.大鼠多囊卵巢综合征动物模型血脂代谢及抗氧化作用[J].中国比较医学杂志,2007,17(9):519-522.

[27] 孙林,魏巍,关咏梅,等.u-PA、u-PAR和PAI-1在睾酮联合hCG致多囊卵巢大鼠中的表达与意义[J].生殖与避孕,2006,26(10): 579-583.

[28] 夏燕,王惠仔,郑建淮.多囊卵巢综合征大鼠模型诱导的实验研究[J].中国优生与遗传杂志,2010,18(7):124-125.

[29] Liu X, Andoh K, Mizunuma H,et al. Effects of recombinant human FSH (rhFSH), urinary purified FSH (uFSH), and hMG on small preantral follicles and tertiary follicles from normal adult and androgen-sterilized female mice. Fertil Steril. 2000; 73(2):372-380.

[30] Yavasoglu L, Kucuk M, Coskun A,et al. Polycystic ovary syndrome and prolactinoma association. Intern Med. 2009; 48(8):611-613.

[31] Takahashi N, Takeda K, Imai M. Inhibitory effects of p-dodecylaminophenol on the invasiveness of human fibrosarcoma cell line HT1080. Bioorg Med Chem. 2013; 21(19):6015-6021.

[32] Santos FC, Rochel-Maia SS, Fochi RA, et al. MMP-2 and MMP-9 localization and activity in the female prostate during estrous cycle. Gen Comp Endocrinol. 2011;173(3):419-427.

[33] Xu X, Jackson PL, Tanner S, et al. A self-propagating matrix metalloprotease-9 (MMP-9) dependent cycle of chronic neutrophilic inflammation. PLoS One. 2011;6(1):e15781.

[34] Cauwe B, Martens E, Van den Steen PE, et al. Adenylyl cyclase-associated protein-1/CAP1 as a biological target substrate of gelatinase B/MMP-9. Exp Cell Res. 2008;314(15): 2739-2749.

[35] Xiong H, Zhang ZG, Tian XQ, et al. Inhibition of JAK1, 2/STAT3 signaling induces apoptosis, cell cycle arrest, and reduces tumor cell invasion in colorectal cancer cells. Neoplasia. 2008;10(3):287-297.

[36] Ding Q, Jin T, Wang Z, et al. Catalase potentiates retinoic acid-induced THP-1 monocyte differentiation into macrophage through inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Leukoc Biol. 2007; 81(6):1568-1576.

引言

材料方法

1.1 造模动物及材料健康6周龄有规律动情周期的SD雌性大鼠48只，由河南贯中实验动物中心提供，SYXK(豫) 2010-0001。实验前将所有大鼠放入温度和湿度均比较适宜的环境中饲养，饮水和进食均自由进行，在实验过程中对大鼠进行的所有实验步骤均符合动物实验管理规定。将48只大鼠随机分为对照组和模型组，每组24只。

多囊卵巢综合征模型构建实验相关试剂：
试剂	来源
促黄体生成素、垂体泌乳素、睾酮放射免疫试剂盒	天津中新科炬生物制药有限公司
促卵泡素、雌二醇放射免疫试剂盒	上海沪宇生物科技有限公司
结缔组织生长因子抗体	武汉博士德生物工程公司
结缔组织生长因子抗体，基质金属蛋白酶9抗体	北京中杉公司

1.2 造模方法实验于2013年1月至2014年1月在大庆市油田总医院中心实验室完成。
构建多囊卵巢综合征模型大鼠：两组均采用Poresky法构建多囊卵巢综合征模型大鼠[9]，模型组大鼠采用来曲唑灌胃(来曲唑预先溶于体积分数1%的羧甲基纤维素中)，给药剂量每日1 mg/kg[6]，持续21 d。对照组大鼠每日灌胃等量的体积分数1%羧甲基纤维素，持续21 d。灌胃期间每日进行阴道涂片，判断大鼠动情周期的变化。
1.3 标本采集当模型组大鼠动情周期固有规律不存在，连续出现间期时可以开始取标本，对照组在其间期取标本即可。最后一次灌胃来曲唑12 h后对大鼠禁食12 h，再以缺血法处死大鼠，采集心脏血液5 mL，2 000 r/min离心取血清，在-40 ℃保存备用。摘取各组大鼠的子宫和卵巢，分别称质量，并将卵巢沿长径方向剖开，以10 g/L甲醛定备用。
在模型制作的过程中，模型组和对照组均进行自由饮食，并在每周六测定其各自的体质量、血清促黄体生成激素水平以及胰岛素水平。如果大鼠的以上指标均发生变化，而且其空腹血糖水平有显著的上升迹象[10]，糖耐量发生变化，则说明多囊卵巢综合征大鼠模型制作成功。
1.4 造模成功的检测标准应用放射性免疫法测定促黄体生成激素、促卵泡激素、雌二醇、垂体泌乳素、睾酮的水平，以评定模型鼠的内分泌改变。
组织学观察：对卵巢组织修剪后进行石蜡包埋，之后以4 μm厚度进行切片并进行苏木精-伊红染色，首先将切片置于60 ℃烘箱中进行烤片约20 min，取出后立即放入二甲苯中20 min，之后再用梯度乙醇进行梯度脱水，最后以自来水冲洗干净后开始染色，染色时先以苏木精染核1.0-2.0 min，冲洗干净后以体积分数1%盐酸乙醇分色一两秒，冲洗后置于室温下显蓝约10 min，再以伊红进行胞浆染色，再次梯度乙醇脱水，二甲苯透明化处理，中性树胶封固即可。
结缔组织生长因子，基质金属蛋白酶9在卵巢组织中的表达，采用免疫组织化学法进行测定，结果判定时以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照，胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒时判定为阳性，拍取照片后经Biosens Digital Imaging System实施图像灰度值分析。
1.5 统计学分析采用SPSS 17.0软件实施数据分析处理，计量资料均以x(_)±s的形式表示，组间比较采用t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

由于多囊卵巢综合征会对患者正常的生理活动产生严重影响^[11]，患者不排卵，造成无法正常受孕，因此在带给患者生理上痛苦的同时，对患者家庭幸福也造成不利影响^[12]。该病涉及广泛的病理生理学改变^[13]，如遗传，神经内分泌，物质代谢以及卵巢的局部调控等变化^[14]，正因为如此，近年来关于该病的研究一直是生殖内分泌疾病的热门课题^[15]。多数多囊卵巢综合征患者无排卵功能，极少数稀发排卵但也存在黄体功能不足的问题^[15-17]，而关于多囊卵巢综合征与患者卵泡发育及排卵的关系目前尚不明确^[18]。本研究主要目的是通过建立大鼠多囊卵巢综合征模型，并对其血清性激素水平进行测定，同时分析结缔组织生长因子以及基质金属蛋白酶9在卵巢组织中的表达，为该病发病机制的阐明提供参考。
3.1 造模方法为了提高临床实验的安全性，学术界通常使用动物模型来研究进行疾病的研究^[19]，这种研究方法简单方便，容易实施，并且成功率较高，重复性也好^[20]，因此很受欢迎。目前在动物模型的研究中，使用最多的动物是大鼠，在本次实验中，文章使用的也是大鼠，原因有以下几点：①有研究证明，大鼠的各个系统的发育机制与人类非常相似^[21]。②大鼠生长较快，繁殖能力较强^[22]，经常被用作与生长发育有关的实验研究。③大鼠模型相对比较稳定^[23]，且操作比较简单。在本次实验中使用的造模方法是Poresky法，操作过程严格按照操作标准进行，而且模型制作结果也比较成功，因此对本次实验结果的准确性没有明显的影响。
3.2 大鼠模型中性激素变化近年来，先后有学者利用多囊卵巢综合征大鼠模型研究中药或某种西药对于多囊卵巢综合征的治疗效果^[24-26]，文章在对这些研究进行查阅分析时发现，在大鼠建模成功之后，其血清中的性激素指标均发生了上升或者下降，而在用药过程中，大鼠体内性激素指标也在不断发生变化，由此文章推测大鼠体内的性激素水平与多囊卵巢综合征的发生和发展之间有密切的关系。而本次的研究结果表明模型组大鼠血清中睾酮，促黄体生成素和垂体泌乳素均较对照组明显上升，原因可能如下所述，睾酮在模型组增加可能是由于模型组大鼠雄激素向雌激素转变的途径被阻断，从而引起睾酮的蓄积；而促黄体生成素的增加极有可能是对睾酮升高的一种正常反应，促黄体生成素的升高会引起卵巢局部促黄体生成素受体的增加，进而加速雄激素转变成雌激素。此外，实验还发现模型组大鼠血清中促卵泡激素和雌二醇的降低，出现这种结果的原因根据目前研究结果推测可能是由于芳香化酶抑制剂的使用导致雌激素的合成速率下降。由以上结果可见，本次实验结果与以往相关研究结果比较一致。
3.3 大鼠模型中的结缔组织生长因子水平变化结缔组织生长因子(结缔组织生长因子)可在多种组织细胞如血管内皮细胞，神经细胞，上皮细胞等中产生并分泌，其主要生理作用为促进有丝分裂，成纤维细胞增殖，合成胶原等^[27]。目前，相关研究已证实结缔组织生长因子在胚胎发育，伤口愈合的胞外基质形成中起到不可替代的作用，参与多种生理或病理的过程^[28]。尽管结缔组织生长因子在正常卵巢组织中的作用尚不明确，但文章仍可推出其在卵巢中可发挥与在其他组织类似的作用。就本次实验结果分析，文章通过免疫组化，在白膜，黄体，卵泡基底膜，颗粒细胞以及窦前卵泡卵泡膜等细胞的胞浆中均检测到了结缔组织生长因子的表达。组间t 检验结果发现在模型组大鼠的窦前卵泡卵泡膜，卵泡基地膜和白膜3个卵巢组织中，结缔组织生长因子的表达量较对照组明显偏高，这一结果说明结缔组织生长因子高表达与多囊卵巢综合征的发生，发展存在一定的关系。有报道认为促卵泡激素能够抑制结缔组织生长因子在卵巢组织中的表达，而本次实验结果发现血清中促卵泡激素降低，这可能是多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织中结缔组织生长因子高表达的一个原因，这一推断与相关报道基本相符^[29]。
3.3 大鼠模型中基质金属蛋白酶9水平变化基质金属蛋白酶9是一种胶原酶，其在破骨细胞中的表达量最高，多种细胞均能分泌。研究认为基质金属蛋白酶9的表达与细胞的转移，组织重建等有关，此外，与胞外基质的降解有着密切关系。基质金属蛋白酶9可促进包含大量胶原在内的胞外基质的快速分解而导致细胞凋亡。在雌性动物生殖系统中，受生理周期的影响，其细胞外基质也随生理周期的变化而波动，已有研究证实了基质金属蛋白酶9在生理周期的各个阶段均发挥着不可替代的作用[30-36]。实验结果表明卵巢的颗粒细胞，卵泡基底膜，始基卵泡、白膜和窦前卵泡卵泡膜胞浆中均会表达，但只有在黄体和卵泡基底膜胞浆中的基质金属蛋白酶9的表达量变化显著，与对照组比较差异显著。这一结果与相关研究发现多囊卵巢综合征患者基底膜增厚基本相符，由于在卵泡膜中基质金属蛋白酶9的表达减少，使基底膜成分的合成量大于降解的量，从而使基底膜增厚。
3.4 小结综合上述分析，结缔组织生长因子在多囊卵巢综合征中可能与小卵泡的生长和排卵障碍有关，基质金属蛋白酶9可能与多囊卵巢综合征中的排卵障碍有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程