人参皂苷Rh2干预催产素诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期实验已证明了10 μmol/L催产素能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化。
目的：观察人参皂苷Rh2在催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化过程中的作用。
方法：采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。实验共分为5组，空白对照组细胞常规培养2周；催产素诱导组：10 μmol/L催产素连续诱导培养2周；人参皂苷Rh2低、中、高剂量组：分别加入0.5，1，2 μmol/L人参皂苷Rh2，培养24 h后加入10 μmol/L催产素，连续诱导培养2周。
结果与结论：光学显微镜下观察显示，与空白对照组相比，催产素诱导组的细胞部分细胞体积变大，部分细胞密集重叠生长，随人参皂苷Rh2剂量增大细胞密集重叠生长的范围增大。免疫组织化学染色和免疫印迹法结果显示，催产素诱导组和人参皂苷Rh2低、中、高剂量组中心肌肌钙蛋白T，连接蛋白43的蛋白表达均显著高于空白对照组(P < 0.05)；人参皂苷Rh2剂量增大而阳性表达增强，并显著高于催产素诱导组(P < 0.05)。激光共聚焦检测结果显示，催产素诱导2周后，催产素诱导组骨髓间充质干细胞中游离钙的相对荧光强度显著升高(P < 0.05)，而人参皂苷Rh2处理组的荧光强度高于催产素诱导组，与剂量呈正相关(P < 0.05)。结果证实，人参皂苷Rh2在体外可显著增强催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人参皂苷Rh2, 催产素, 骨髓间充质干细胞, 心肌细胞, 心肌肌钙蛋白, 连接蛋白43, 游离钙, 显微结构, 免疫印迹法, 免疫组织化学染色

Abstract:

BACKGROUND: Our prior experiments have confirmed that 10 μmol/L oxytocin can induce transformation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Ginsenoside Rh2 on oxytocin-induced transformation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial cells.
METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by differential adherence method. These isolated cells were randomly divided into five groups. In the blank control group, cells were routinely cultured. In the oxytocin group, cells were cultured with 10 μmol/L oxytocin for 2 consecutive weeks. In the Ginsenoside Rh2 low-, middle-, and high-dose groups, cells were treated with 0.5, 1, 2 μmol/L Ginsenoside Rh2 respectively for 24 hours and then with oxytocin for additional 2 consecutive weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: Optical microscopy showed that compared to the blank control group, some cells in the oxytocin group exhibited an increased soma and some cells grew in clusters and the cell clusters enlarged with the increase in Ginsenoside Rh2 dose. Immunocytochemical staining and western blot analysis showed that cardiac Troponin T and connexin 43 protein expression in the oxytocin, Ginsenoside Rh2 low-, middle-, and high-dose groups were significantly greater than in the blank control group (P < 0.05), and cardiac Troponin T and connexin 43 protein expression in the Ginsenoside Rh2 groups was increased with the increase
in Ginsenoside Rh2 dose and was significantly higher than that in the oxytocin group (P < 0.05). Confocal laser scanning microscopy showed that the relative fluorescence intensity of free calcium in the bone marrow mesenchymal stem cells in the oxytocin group was significantly increased after induction by oxytocin for 2 weeks (P < 0.05), while the relative fluorescence intensity in the Ginsenoside Rh2 groups was significantly higher than that in the Ginsenoside Rh2 groups and was positively correlated with the dose of Ginsenoside Rh2. These findings suggest that Ginsenoside Rh2 can obviously promote oxytocin-induced transformation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial cells in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Oxytocin, Stem Cells, Calcium

中图分类号:

R394.2

王乐，田立，郑明奇，刘刚，吉立双，马国平. 人参皂苷Rh2干预催产素诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的转化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3633-3638.

Wang Le, Tian Li, Zheng Ming-qi, Liu Gang, Ji Li-shuang, Ma Guo-ping. Effects of Ginsenoside Rh2 on oxytocin-induced transformation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardial cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3633-3638.

图/表（结果） 3

2.1 诱导培养后骨髓间充质干细胞形态的变化诱导培养2周后，倒置于显微镜下观察，空白对照组细胞可见局部少量细胞密集生长；催产素诱导组细胞呈长梭形，部分细胞体积变大，随时间增长而部分细胞密集重叠生长，直至到达一定程度后不再增殖；人参皂苷Rh2低、中、高剂量组的细胞形态与催产素诱导组相似，随药物剂量增大而细胞密集重叠生长的范围增大。见图1。
2.2 各组细胞cTnT和CX43的蛋白表达诱导培养2周后，采用免疫组织化学染色检测cTnT，CX43的蛋白表达。如图2所示，空白对照组仅有少量细胞中cTnT呈弱阳性；催产素诱导组、人参皂苷Rh2低、中、高剂量组部分细胞中cTnT均呈阳性表达，胞质中可见棕黄色网状结构；随人参皂苷Rh2剂量增大而阳性表达增强，且在密集重叠部分呈强阳性表达，显著高于催产素诱导组。
如图3所示，空白对照组中CX43几乎无表达；催产素诱导组、人参皂苷Rh2低、中、高剂量组部分细胞中CX43均呈阳性表达，胞质中可见棕黄色颗粒样结果；人参皂苷Rh2剂量增大而阳性表达增强，显著高于催产素诱导组。

诱导培养2周后，Western blot结果显示，空白对照组中cTnT，CX43的蛋白几乎不表达，催产素诱导组中cTnT，CX43的蛋白表达显著高于空白对照组(P < 0.05)，人参皂苷Rh2剂量增大而蛋白表达显著增高，且高于催产素诱导组，其中高剂量组中的蛋白表达显著高于催产素诱导组(P < 0.05)。见图4。

2.3 各组骨髓间充质干细胞中游离钙水平变化见表1。
诱导培养1周后，与空白对照组相比，各处理组骨髓间充质干细胞中游离钙的相对荧光强度有一定程度的增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)；诱导培养2周后，催产素诱导组中游离钙的相对荧光强度显著升高(P < 0.05)，人参皂苷Rh2低、中、高剂量组中游离钙的相对荧光强度升高幅度显著大于催产素诱导组，且随药物剂量增大而升高幅度显著增大(P < 0.05)。

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引言

骨髓间充质干细胞属于成体干细胞，是一类具有自我更新和多分化潜能的早期未分化细胞，存在于骨髓中除造血干细胞外的另一类早期前体细胞，可向骨、脂肪、肌肉、韧带和骨髓基质等间叶细胞衍化的组织分化。具有易于分离，体外培养多次传代后基因的稳定性良好，多向分化，免疫原性低的优点，即使是异体移植，骨髓间充质干细胞对宿主的排斥反应也相对比较小。因此是用于心血管疾病干细胞移植治疗的理想种子细胞[^1-3]。
随着组织细胞工程技术和基因工程的发展，骨髓间充质干细胞的研究备受广泛关注。由于骨髓间充质干细胞取材方便、损伤小，增殖能力强、便于外源基因的转染和传代能保持正常细胞遗传学，以及较少涉及伦理道德的特点，已经引起了国内外学者的重视。
近年来，国内外已开展多项干细胞移植治疗急性心肌梗死的临床研究，显示干细胞移植能改善心脏功能和重构，提高左室射血分数，证明干细胞移植治疗具有安全性和有效性^[4-5]。然而左室射血分数提高幅度仅约3%^[6]，因此疗效低是干细胞治疗的最大难题。作者在前期实验中已进行了不同剂量催产素对大鼠骨髓间充质干细胞的诱导作用，结果发现，催产素可诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞，10 μmol/L浓度的催产素是诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的最佳浓度。
临床上常用他汀类作为心血管疾病的基础药物之一，研究表明可通过抗炎、抗氧化应激等作用改善微环境促进骨髓间充质干细胞存活，且可增强其自身抗凋亡的能力^[7-9]。但尚未有研究表明他汀类具有增加干细胞向心肌细胞转化的作用。
中药对骨髓间充质干细胞移植治疗心血管类疾病也有重要的作用。研究表明在猪的心梗模型中，通心络可改善心梗后心肌的微环境，增加抑制骨髓间充质干细胞的存活^[10]。
人参(Panax ginseng C.A. Meryer)是五加科多年生草本植物，是中国传统的名贵中草药，经常用于治疗体虚欲脱、脾虚食少、惊悸失眠、心力衰竭等病变，称作百药之王。大量研究证明，人参皂苷是其主要有效成分之一，其中人参皂苷Rh2具有显著的抗肿瘤，增强免疫力，促进和改善学习与记忆能力等作用^[11]。且人参皂苷能够通过抗神经细胞的凋亡，促进神经干细胞的分化，减轻兴奋性氨基酸的神经毒性作用，但其作用机制还在不断地探索中^[12-13]。
人参皂苷Rh2的来源广泛，推测在干细胞移植方面，具有增强受体免疫力，因此，应该具有广阔的研究前景。尚未有人参皂苷Rh2在骨髓间充质干细胞移植方面的报道。实验以此观察人参皂苷Rh2在催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化过程中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2014年1至9月在河北医科大学干细胞实验室完成。
材料：
实验动物：健康清洁级4周龄SD大鼠8只，体质量约120 g，雌雄不拘，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞分离培养：麻醉后颈椎脱臼处死大鼠，置于体积分数90%苯扎溴按溶液中浸泡3 min，然后用体积分数80%乙醇浸泡2 min，冲洗。
在无菌条件下，快速游离双下肢股骨，尽量去除胫骨周围组织，剪去干骺端，用注射器吸取无菌PBS液3 mL，插入髓腔搅拌并冲洗，直至骨髓变白，将冲洗液转移至离心管，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入5 mL培养液重悬，

催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化实验相关试剂：
试剂	来源
催产素	上海禾丰公司
胰蛋白酶	美国Sigma公司
胎牛血清	德国PAA公司
cTnT抗体	英国NeoMarkers公司
连接蛋白43(CX43)抗体	美国invitrogen公司

将细胞悬液加入含有5 mL大鼠淋巴细胞分离液的离心管中，3 000 r/min离心30min，将白色薄膜层移至离心管中，加入5 mL分离液，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的全培养基，重悬细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1，37 ℃，体积分数5%CO₂恒温箱中孵育，15 h后更换新培养基，后每隔3 d天换液1次。待细胞铺满瓶底约90%时，加入胰酶进行消化传代。
分组及干预：将传至第2代的骨髓间充质干细胞消化后制成细胞悬液，以0.5×10¹⁰ L^-1的细胞浓度接种于24孔板中，实验分组：①空白对照组：常规培养，每隔2 d换液1次，培养2周。②催产素诱导组：加入催产素使最终浓度为10 μmol/L，连续诱导培养2周。③人参皂苷Rh2低、中、高剂量组：分别加入人参皂苷Rh2，使最终浓度为0.5，1，2 μmol/L，培养24 h后加入催产素使最终浓度为10 μmol/L，连续诱导培养2周。
免疫组织化学染色：收集相应细胞，用0.01 mol/L PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醇固定30 min，加入体积分数3%甲醇-H₂O₂孵育10 min，再加入Triton X-100处理30 min破膜，体积分数10%山羊血清封闭30 min。分别加入小鼠cTnT或CX43一抗(美国Santa Cruz公司)，4 ℃孵育过夜，再加入生物素化抗小鼠二抗(中国江苏碧云天生物有限公司)，室温孵育2 h。DAB显色液显色10 min，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固晾干。
光学显微镜下观察结果，采用Image-pro Plus 6.0软件分析数据。根据染色细胞所占面积和细胞染色强度两项指标进行综合评分判断。综合评分为(染色细胞分数+细胞染色强度分数)/2，0-0.5分为(-)；0.5-1.5分为(+)；1.5-2.5分为(++)；>2.5分为(+++)。
蛋白免疫印迹检测：收集相应细胞，提取细胞蛋白，蛋白定量后，调整蛋白量并用蛋白裂解液补齐体积，加入1/4样品体积的缓冲液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭液浸泡，37 ℃封闭2 h，加入小鼠来源的cTnT或CX43一抗(美国Santa Cruz公司)，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入相应抗小鼠二抗(美国Cell Signaling Technology 公司)，室温孵育1 h，化学发光法显色，以β-actin作为内参照校正，目的蛋白的吸光度与内参吸光度比值作用为目的蛋白的相对表达含量。细胞游离钙的监测：将细胞悬浮于HEPES缓冲液中，取1 mL加入多聚赖氨酸处理的金属小室内，于37 ℃静置20 min，在加入10 μg Fluo-3/AM，37 ℃温育30 min， 1 000 r/min离心两次，每次5 min，弃上清。加入HEPES缓冲液，用激光共聚焦扫描显微镜氩光监测细胞内Ca²⁺分布，激发波长为488 nm，检测系外线波长为512 nm，相对荧光强度值=(峰荧光强度-基线荧光强度)/基线荧光强度。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离培养的细胞形态。②免疫组织化学染色检测cTnT，CX43的蛋白表达水平。③免疫印迹法检测cTnT，CX43的蛋白表达水平。④激光共聚焦测定细胞内钙离子浓度。
统计学分析：采用SPSS 15.0统计软件对数据进行统计分析，实验数据均采用x±s表示，组间数据差异比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

催产素对骨髓间充质干细胞转化的具有诱导作用。随着人口增长和老龄化的出现，心血管类疾病患者的发病率不断增加，缺血性心力衰竭的负担也在不断地加剧^[14-17]。催产素是间充质干细胞向心肌细胞分化的药物诱导剂之一^[18-20]。
已有研究发现在胚胎期心脏中催产素水平高于出生后，其高峰值出现在心肌细胞大量增殖时期^[21-23]。国外科研人员研究发现催产素可诱导P19细胞、胚胎干细胞、心旁细胞等向心肌细胞分化^[24-26]。
作者之前实验发现催产素可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转换，并对不同剂量的催产素的诱导作用进行研究，发现10 μmol/L浓度的催产素是诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的最佳浓度。
人参皂苷Rh2促进催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化。实验同时联用人参皂苷Rh2和催产素作用于大鼠骨髓间充质干细胞，研究人参皂苷Rh2对催产素诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的作用。显微镜下观察显示，仅加入催产素诱导的部分细胞体积变大，并密集重叠生长。结果表明分离出来的骨髓间充质干细胞的生长能力良好，而加入人参皂苷Rh2培养24 h后，再加入催产素诱导的细胞形态，与单独催产素诱导的细胞相似，但细胞密集重叠生长的范围与人参皂苷Rh2剂量呈正相关，提示人参皂苷Rh2可能具有增加骨髓间充质干细胞的生殖能力，具有剂量依赖性，且能增强催产素诱导骨髓间充质干细胞的转化作用，可能与人参皂苷Rh2促进增加DNA合成和促进有丝分裂的作用有关。正常心肌组织中cTnT呈强阳性表达，若存在心肌损害，则cTnT的表达会减弱^[27-28]。
CX43是心脏的细胞缝隙连接蛋白，主要分布在心肌闰盘上，与心肌细胞间信息传导相关^[29-32]。
人参皂苷Rh2低、中、高剂量组细胞中心肌细胞增殖标记物cTnT和CX43的蛋白表达水平显著高于催产素诱导组，呈阳性表达，且与人参皂苷Rh2剂量呈正相关，提示人参皂苷Rh2可增加催产素诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化的作用，与剂量呈正相关。另一方面，加入人参皂苷Rh2培养后的细胞中，游离钙的相对荧光强度与单独使用催产素相比，有大幅度的提升，并与剂量呈正相关。
Ca2+作为心肌细胞内最重要的信号分子之一，参与了心机细胞的机械做功和能量代谢。游离钙浓度的增加有可能参与了人参皂苷Rh2促进心肌细胞电活动的产生。骨髓间充质干细胞内胞浆游离钙浓度的增加在向心肌细胞分化过程中起重要作用。其具体机制还需进一步开展进一步实验。
人参皂苷Rh2在催产素诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞转化过程中起促进作用，有可能与游离钙浓度的增加，参与心肌细胞钙离子通道有关。文章结果为人参皂苷Rh2用于干细胞向心肌细胞转化，干细胞移植提供了实验依据。具体的诱导分化机制仍待后续实验进行探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程