凋亡素原核表达载体构建及活性测定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外合成或通过基因工程表达的凋亡素Apoptin 是一种可以特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对人体正常细胞无毒性和转化活性的蛋白，为抑制肿瘤的生长提供可能。
目的：构建凋亡素基因的原核表达载体，优化诱导蛋白表达的相关条件，检测纯化所得目的蛋白的活性。
方法：将已构建好的凋亡素基因亚克隆至原核表达载体 pET-28b(+)中，将该质粒转化至大肠杆菌E.coli宿主菌中，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析目的蛋白，并检测所表达的目的蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用。
结果与结论：凋亡素基因被成功的克隆至 pET-28b(+)，在26 ℃、IPTG 0.5 mmol/L诱导8 h的情况下，Apoptin为包涵体表达，表达产物经 SDS-PAGE 分析，在相对分子质量约15 000的位置出现目的蛋白条带，大小与预期结果一致，经变复性和亲和层析纯化后，获得高纯度目的蛋白，进一步检测发现其对肺癌细胞H460及H1299具有一定的促凋亡作用。实验成功构建了凋亡素原核表达载体PET-28b-Apoptin，获得了具有一定生物活性的目的蛋白，为进一步研究凋亡素的功能和开发其应用价值研究奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 基因病毒载体及相关因子模型, 凋亡素蛋白, 原核表达, 纯化, 活性测定

Abstract:

BACKGROUND: Apoptin is a protein which is synthesized in vitro or expressed by genetic engineering, without toxic and transformation activity of normal cells. Apoptin can specifically induce the apoptosis of tumor cells and provide the opportunity of inhibiting the growth of cancer.
OBJECTIVE: To construct a prokaryotic expression vector for apoptin, optimize the expression conditions, and detect the activity of the purified protein.
METHODS: The apoptin gene that had been constructed was cloned into prokaryotic expression vector pET-28b (+), which was transformed into E.coli host bacteria. Apoptin was induced by isopropyl-beta-D- thiogalactoside, and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The inhibition activity of apoptin on tumor cells was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Apoptin gene was successfully cloned into pET-28b (+). Apoptin protein was induced to express in form of inclusion body by isopropyl-beta-D-thiogalactoside (0.5 mmol/L) at 26 ℃. And the expression of apoptin with relative molecular mass of about 15 000 was identified by polyacrylamide gel electrophoresis. The target protein was purified by denaturation-renaturation and affinity chromatography, which has pro-apoptotic effect on lung cancer cells H460 and H1299. The prokaryotic expression vector pET-28b-apoptin is successfully constructed. The apoptin protein with bioactivity is obtained, which allows further functional study of apoptin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Apoptosis, Lung Carcinoma

中图分类号:

R318

张艳玲，徐霞，江露含，杜晶春. 凋亡素原核表达载体构建及活性测定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2928-2932.

Zhang Yan-ling, Xu Xia, Jiang Lu-han, Du Jing-chun. Construction of a prokaryotic expression vector for apoptin and activity determination [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2928-2932.

图/表（结果） 2

2.1 原核表达载体PET-28b-Apoptin的PCR鉴定结果挑取转化后的阳性克隆，以特异扩增 Apoptin 的引物为模板做PCR检测，可见500 bp的目的基因片段，见图1，结果

显示Apoptin已经成功插入到质粒中，大小符合预期。

2.2 原核表达载体PET-28b-Apoptin的双酶切鉴定结果将可疑的阳性菌株质粒提取出来，通过NcoⅠ和 NotⅠ双酶切进行进一步的鉴定，可见500 bp 的目的基因片段，见图2，表明Apoptin己成功克隆入PET-28b载体中。

2.3 重组质粒诱导表达的SDS-PAGE分析结果电泳显示，重组质粒经诱导表达后在预期位置上出现特异性的表达条带。特异性的表达条带出现在菌体经破碎后收集的沉淀中，显示重组蛋白几乎全部以包涵体的形式表达于沉淀中，上清中很少(见图3泳道3、4)，表达的重组蛋白相对分子质量大小为15 000。

2.4 纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果 PET-28b-Apoptin 转化菌培养裂解后，收集各个缓冲液洗脱下的液体，SDS-PAGE 电泳并染色发现，在上柱前，于M_r 15 000处出现目的条带(泳道3)、上柱后目的条带仍存在，但条带变细，说明目的蛋白已部分结合在纯化柱上(泳道4)，用含不同浓度的咪唑洗脱目的蛋白，发现每个浓度的洗脱液中都有目的蛋白被洗脱下来，而在咪唑含量为100 mmol/L时杂条带较少(泳道6)，其相对分子质量(M_r)为15 000(见图4)。

2.5 纯化蛋白的活性分析结果 Apoptin的活性主要体现在诱导细胞凋亡上，在重组蛋白作用24 h后，分别在光镜下观察H460肺癌细胞及H1299肺癌细胞加蛋白组和阴性对照组的细胞的形态，加蛋白组细胞变圆，呈典型的凋亡状态，且变圆的细胞数量增多，表明凋亡的细胞数量增多，而加入缓冲液的阴性对照组细胞生长并未受到明显影响，与预期结果一致(见图5)。

参考文献

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年12月在广州医科大学完成。

材料：

凋亡素原核表达载体的构建及活性测定实验试剂及仪器：
细胞、试剂及仪器	来源
E.coli DH5α、E.coli BL21、pGM-T-Apoptin 、pET-28b、人非小细胞肺癌细胞H460、人非小细胞肺癌细胞H1299	由广州医科大学金域检验学院实验室保存
T₄ DNA连接酶、限制性内切酶 NcoⅠ、Not* Ⅰ*	NEB公司
Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒和小量质粒回收试剂盒	天根生化科技有限公司
诱导剂IPTG、筛选用卡那霉素(Kan) 和300 g/L丙烯酰胺及细胞裂解试剂盒(IP裂解液)	自广州诺思生物科技有限公司

实验方法：

重组质粒PET-28b-Apoptin的构建和鉴定：

基因的扩增：用已经设计好的能够特异性扩增Apoptin 全序列的引物：正向引物 5’-3’：CAT GCC ATG GTA TAT GCC AGG AAG GCT，反向引物5’-3’：AAA TAT GCG GCC GCC AGT CTT ATA CAC C，在此基础上根据测序的结果选择一对合适的限制性内切酶，在引物的两端分别连上 NcoⅠ和 NotⅠ酶切位点和其对应的保护碱基。上游引物：5’-CAT GCC ATG GTA TAT GCC AGG AAG GCT-3’下游引物：5’-AAA TAT GCG GCC GCC AGT CTT ATA CAC C-3’的5’端加入的NcoⅠ和NotⅠ酶切位点，并在引物中分别加入了CG和C保护碱基。提取保存的pGM-T-Apoptin质粒，以 pGM-T-Apoptin质粒为模板 PCR 扩增Apoptin 序列。反应参数为：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s， 72℃ 90 s，循环30次后，72 ℃延长5 min。

重组表达载体的构建：扩增的Apoptin目的片段经 NcoⅠ和NotⅠ双酶切后回收，并提取实验室保存的pET-28b 质粒，对pET-28b质粒和纯化后的PCR产物分别进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切，构建成重组表达质粒 pET-28b- Apoptin，并以其转化E.coli DH5α。通过酶切鉴定筛选出阳性重转化子。

阳性重组子的筛选与鉴定：转化菌涂在含氨苄青霉素的加入5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X gal)和IPGT的LB平板上，挑取白色菌落，扩增后提取质粒，NcoⅠ和NotⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，检测能否切出目的条带。

重组质粒pET-28b-Apoptin在大肠杆菌中的表达及纯化：将上述经过鉴定成功克隆有目的基因的质粒PET-28b-Apoptin转化E.coli BL21受体菌，同时用质粒PET-28b(+)转化BL21菌作对照。实验步骤：①分别挑取单个阳性菌落接种到3 mL含卡那霉素(kan)的LB培养液中过夜培养，至培养液的A600达0.6，次日各取4 mL培养菌液加入200 mL Kan+的LB培养液中，振摇培养8 h，在26 ℃的诱导温度下，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，继续振摇培养8 h，诱导蛋白表达。②离心收集培养液中的细菌，加入3倍体积的PBS，用超声细胞粉碎机冰上超声裂解细菌，收集裂解的沉淀物用含有尿素的PBS进行溶解，收集上清液，用镍填料的层析柱来进行亲和层析纯化。样品上柱前先用3倍柱床体积的1 mol/L PBS平衡柱子，将开始准备的样品上柱，收集滴出的液体，并做好标记；分别用3倍柱床体积的浓度为20，100，200，400 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗涤层析柱，收集滴出液体，做好标记；将上述每步收集的液体进行SDS-PAGE 分析，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白在咪唑为何浓度下可以纯化出来。③将收集的带目的蛋白的洗脱液用 PBS(pH 7.0)透析12 h除去咪唑。

目的蛋白的活性检测：上述透析所得的蛋白溶液。实验步骤：①细胞计数：根据实验的需要分别稀释H460及H1299肺癌细胞为10⁸ L^-¹。②细胞接种：12孔板四周的非实验各孔均用 200 μL PBS封边，空白孔中只加入培养基，其他孔中加入200 μL稀释好的细胞，将12孔板置于37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养12 h使细胞贴壁。③药物作用：当细胞生长至70%左右时，分别加纯化好的0.5 mg/L及1.5 mg/L的蛋白溶液。以纯化蛋白的缓冲液为阴性对照组，以不添加任何成分的细胞为空白对照。将12孔板置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中继续培养24 h。

主要观察指标：①原核表达载体PET-28b-Apoptin的PCR鉴定结果。②原核表达载体PET-28b-Apoptin的双酶切鉴定结果。③重组质粒诱导表达的SDS-PAGE分析结果。④纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果。⑤纯化蛋白的活性分析结果。

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讨论

从细胞凋亡的角度看，肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，也是凋亡异常的结果。细胞增殖和凋亡的平衡失调导致肿瘤的发生，细胞周期失控、细胞凋亡受阻，使受损的、衰老的和异常的细胞清除受限。因此，一种新的治疗方法产生：诱导肿瘤细胞凋亡来消除肿瘤。随着对Apoptin引发凋亡的进一步研究，发现Apoptin诱导的细胞凋亡具有很强的细胞特异性^[10]，可以特异性地诱导人的多种肿瘤细胞如肝癌细胞、卵巢癌细胞等，及转化细胞如骨肉瘤细胞等发生凋亡，而人正常的细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞等对Apoptin并不敏感，不杀伤正常细胞^[11-13]，这就为Apoptin成为特异的抗肿瘤药物提供了可能。

Apoptin是一种胞内蛋白，不能直接透过细胞膜，只有在肿瘤细胞内部才能表现出诱导凋亡活性^[14]。因此通过外源表达的Apoptin要发挥促凋亡作用，首先要能够有效地进入细胞内部，原核表达系统在大肠杆菌中表达可携带跨膜信号序列的Apoptin，该跨膜信号能够协助Apoptin成功进入靶细胞内部^[15-17]。

实验的目的是构建凋亡素基因的原核表达载体，在构建原核表达载体时，首先要考虑的是载体类型的选择。随着内切酶的发现及生物基因工程技术的发展，出现了利用各种利用不同载体在原核、真核系统中表达以获得目的蛋白的方法。在各种表达系统中，最早应用的是原核表达系统，这也是目前所掌握的最为成熟的表达系统。自20世纪70年代以来，主要利用T7噬菌体中的T7 RNA聚合酶，以在宿主菌中能高效合成外源蛋白的大肠杆菌成为基因工程中应用最为广泛的原核表达系统。本实验在扩增出Apoptin基因的基础上，经酶切鉴定成功构建了Apoptin的原核表达载体pET-28b-Apoptin，并转化受体菌，表达出Apoptin融合蛋白pET-28b-Apoptin。通过SDS-PAGE示相对分子质量约为15 000，与预期大小一致。且利用pET原核表达系统表达Apoptin基因时，Apoptin融合蛋白并没有出现截短或不表达等的现象，说明Apoptin可以在原核表达系统中正确表达，且蛋白状态比较稳定。

大肠杆菌的表达系统虽然具有很多的优点，但也存在一些不足，如目的蛋白常常以包涵体形式表达，而包涵体在溶解过程中又常常使所表达的蛋白失去活性，这往往导致后续蛋白的纯化及复性步骤变繁琐，也正因为如此，以包涵体的形式表达的重组蛋白的分离纯化以及蛋白如何复性成为了原核表达系统在应用过程中遇到的主要难题之一^[18]。本实验

所得目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中，上清中的可溶蛋白的含量极少。

蛋白纯化主要利用不同蛋白之间内在的相似性与差异性，从而达到将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来的目的。本实验选用了偶联镍离子的琼脂糖凝胶Ni-NAT，属于金属螯合亲和层析法，是利用蛋白质表面的组氨酸能与多种过渡金属离子如Zn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、CO²⁺、Fe³⁺等形成配位相互作用，从而能够吸附这些富含氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。可选用EDTA或是咪唑来洗脱重组目的蛋白，但EDTA会将Ni²⁺从NAT上洗脱下来，故本实验选用了咪唑进行洗脱。在用不同浓度的咪唑来洗脱目的蛋白时，要注意每次过柱的溶液都要收集并进行SDS-PAGE分析，以观察目的蛋白纯化的效果。

实验过程中发现了一些存在的问题：表达产物在每一条带中几乎都有出现，说明存在镍柱亲和效率不高的问题，这一问题可通过更换镍柱得到改善。且当咪唑含量为 100 mmol/L时，杂带较少，所得目的蛋白纯度良好。将所获得的融合蛋白通过体外检测活性，加入融合蛋白的H460与H1299肺癌细胞24 h后细胞明显肿胀变圆，呈凋亡状态，而加入缓冲液的对照组细胞生长并未受到明显影响，实验组与对照组相比具有显著差异。这说明本实验所获得的融合蛋白有促使H460与H1299肺癌细胞凋亡的作用，为其成为特异的抗肿瘤药物提供可能，也为进一步研究凋亡素的功能和凋亡素的开发应用研究提供了物质基础。

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