猪心脏瓣膜成肌纤维细胞的分离、鉴定与培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (51): 7684-7689.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.013

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猪心脏瓣膜成肌纤维细胞的分离、鉴定与培养

刘凤丹，胡伟林，陈正平，李永胜

华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科，湖北省武汉市 430000

收稿日期:2016-09-17 出版日期:2016-12-09 发布日期:2016-12-09
通讯作者: 李永胜，博士后，副教授，华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科，湖北省武汉市 430000
作者简介:刘凤丹，女，1989年生，河南省夏邑县人，汉族，硕士，主要从事wnt信号通路对急性肺损伤的调控作用研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070190)

Isolation, identification and culture of porcine heart valve myofibroblasts

Liu Feng-dan, Hu Wei-lin, Chen Zheng-ping, Li Yong-sheng

Department of Emergency, Tongji Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China

Received:2016-09-17 Online:2016-12-09 Published:2016-12-09
Contact: Li Yong-sheng, M.D., Associate professor, Department of Emergency, Tongji Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China
About author:Liu Feng-dan, Master, Department of Emergency, Tongji Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070190

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肌成纤维细胞：瓣膜间质细胞位于瓣膜内皮下，是心脏瓣膜最多的细胞类型，和瓣膜内皮细胞一起是构成心脏瓣膜内稳态最重要的细胞。成肌纤维细胞是一种能够表达平滑肌α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原纤维、并具有一定分化潜能的重要的瓣膜间质细胞，不仅在瓣膜的结构中起着支架作用，尤其在瓣膜的正常生理以及病理应答过程中发挥着重要的调控作用。
钙化性心脏瓣膜病：多指老年退行性心脏瓣膜病。随着年龄增长，心脏瓣膜结缔组织发生退行性变、纤维化、钙化等，而导致的瓣膜或支架的功能异常。目前，钙化性主动脉瓣疾病已成为主动脉瓣狭窄及瓣膜置换的首要病因，预计其发病率进一步提高，但其发病机制尚不明确。

摘要
背景：瓣膜间质细胞是心脏瓣膜中的主要细胞成分，成肌纤维细胞是一种能够表达平滑肌α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原纤维，并具有一定分化潜能的重要的瓣膜间质细胞，不仅在瓣膜的结构中起着支架作用，尤其在瓣膜的正常生理以及病理应答过程中发挥着重要的调控作用。
目的：建立一套可靠的心脏瓣膜成肌纤维细胞分离、原代培养与鉴定的方法，为心瓣膜钙化等疾病的进一步研究奠定基础。
方法：①从猪心中获取主动脉辨，分别用酶联和消化法、普通酶消化法以及组织块种植法提取猪主动脉瓣瓣膜成肌纤维细胞，进行原代培养；②显微镜观察3种方法培养出的成肌纤维细胞的活性和形态；③用光学显微镜和免疫细胞化学方法鉴定细胞。
结果与结论：①3种方法中，利用胰酶和胶原酶Ⅱ联合消化，然后迅速终止消化的方法获得成肌纤维细胞的活性更高，状态更好，纯度更高；②在荧光显微镜下，观察到获得的主动脉瓣成肌纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白染色阳性，抗血管性血友病因子染色阴性，提示培养的细胞为成肌纤维细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-3083-6477(刘凤丹)

关键词: 组织构建, 组织工程, 瓣膜钙化, 瓣膜间质细胞, 成年猪, 成肌纤维细胞, 平滑肌细胞, 细胞培养, 分离, 纯化, 细胞鉴定, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Valvular interstitial cells are the main components of the heart valves. Myofibroblasts, as a kind of valvular interstitial cells, can express alpha-smooth muscle actin and type I collagen fiber, and hold differentiation potential. These cells cannot only play a support role in the valve structure, but also play a regulatory role in the process of the valve normal physiological and pathological responses.
OBJECTIVE: To obtain a reliable method of separation, primary culture and identification of myofibroblasts laying a foundation for further study on the cardiac valvular calcification.
METHODS: Aortic valve myofibroblas extracted from porcine hearts were primary cultured by trypsin and collagenase combined digestive method, common enzyme-digestion method and tissue-culture method, respectively. The myofibroblast activity and morphology were observed using microscope, and myofibroblasts were identified using light microscope and immunocytochemistrial method.
RESULTS AND CONCLUSION: Myofibroblasts had a higher activity and purity cultured by trypsin combined with collagenase II digestion method. Aortic valve myofibroblasts were positive for alpha-smooth muscle actin and negative for von Willebrand factor under fluorescence microscope, suggesting that myofibroblasts were successfully obtained.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cell Culture Techniques, Cell Separation, Myocytes, Smooth Muscle, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘凤丹，胡伟林，陈正平，李永胜. 猪心脏瓣膜成肌纤维细胞的分离、鉴定与培养[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(51): 7684-7689.

Liu Feng-dan, Hu Wei-lin, Chen Zheng-ping, Li Yong-sheng. Isolation, identification and culture of porcine heart valve myofibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(51): 7684-7689.

图/表（结果） 3

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引言

随着中国老龄化的到来，中老年退行性钙化性心脏瓣膜病的发病率也越来越高。相关文献记载，主动脉瓣钙化性瓣膜病患者中有75%的人超过85岁，心脏瓣膜退行性钙化在50岁及以上人群的罹患率达18.3%^[1-4]。成肌纤维细胞是一种能够表达平滑肌α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原纤维、并具有一定分化潜能的重要的瓣膜间质细胞^[5-6]。瓣膜间质细胞是心脏瓣膜中的主要细胞成分，不仅在瓣膜的结构中起着支架作用，尤其在瓣膜的正常生理以及病理应答过程中发挥着重要的调控作用^[7]。心脏瓣膜的瓣叶增厚、基质重塑及钙盐沉积等是心脏瓣膜钙化的重要病理特征，也是导致瓣膜功能失常而引发一系列相关心脑血管疾病的病理基础，这种病理性改变与瓣膜间质细胞的异常转化和增殖密切相关^[8-9]。平滑肌α-平滑肌肌动蛋白阳性表达的成肌纤维细胞被认为是激活型细胞，在瓣膜硬化和钙化时其数量是增加的，当其受到风湿性炎症信号以及分泌细胞因子的巨噬细胞和血小板等影响时可能会发生一系列生物学行为的改变^[10-11]。也就是说，当人体处于异常血流动力学环境或其他病理条件刺激下，成肌纤维细胞可能向增殖、收缩甚至钙化等表型转化，最终引起心瓣膜狭窄、关闭不全或风湿性心脏病等临床表现。可见，瓣膜成肌纤维细胞的异常激活在瓣膜狭窄、钙化过程中起着重要作用。

目前大量的研究证明主动脉瓣膜钙化性疾病是一个主动性炎症反应过程，是主动脉狭窄和硬化的首要原因，其发病机制尚未完全明确，如瓣膜基质的重塑、钙盐的沉积、异位骨化的发生等^[12-14]。文章主要从主动脉瓣肌成纤维细胞的原代培养入手，观察和分析细胞表型的改变，为进一步研究主动脉瓣膜钙化的机制奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学形态观察实验。

1.2 时间及地点于2013年6月至2014年8月在华中科技大学同济医学院基础实验室完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级6月龄成年猪18只，雌雄不限，体质量100 kg左右，由武汉Daoguanquan工厂提供。实验过程中对动物的处置程序都严格按照华中科技大学动物保护协会颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》文献记载的指导方针^[15]。

主要试剂及仪器：胎牛血清和无酚红的DMEM培养基均购自Gibco公司；PBS、胶原酶Ⅱ、DMSO、免疫荧光染色所用抗体购自Sigma 公司；0.25%胰蛋白酶购自Amresco公司；60 mm培养基、100 mm培养皿、25 cm²培养基75 cm²培养瓶均购自Corning公司；100×青霉素/链霉素(双抗)(吉诺生物医药技术有限公司)；山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司)；体积分数5% CO₂培养箱(德国Heraeus)；低温超高速离心机(Beckman公司)；高压灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)；光学显微镜(重庆光学仪器厂COIC-XDS-1B)；荧光显微镜(OLYMPUS)；普通离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂)； -80 ℃低温冰箱(SANYO)；细胞滤网(网孔20，40 μm)购自BD公司。

1.4 实验方法

1.4.1 猪主动脉瓣膜成肌纤维细胞原代培养成年猪使其安乐死，取下心脏迅速放入预先备好的含5%双抗冷PBS中转移到实验室。在超净台内，将猪心脏置于4 ℃含1%双抗冷PBS液中反复洗多次，直至清除残留的血液。沿心脏中部剪除心尖部，沿左心室至主动脉剪开，看到3片主动脉瓣，自主动脉瓣根部约20%处剪下主动脉瓣，迅速放入含1%双抗冷PBS中反复漂洗获取的主动脉瓣3次，5 min/次，以洗去红细胞。

方法1：酶联合消化法(n=6)。取出主动脉瓣置入0.25%胰酶(0.02%EDTA)的10 mL离心管，封口后放入预热为37 ℃的恒温摇床，低频振荡消化20 min，以除去内皮细胞；然后在超净台中取出瓣膜，用含1%双抗冷PBS漂洗3次，每次5 min；再将瓣膜块转到含胶原酶Ⅱ(2 g/L)的离心管中，放入预热为37 ℃的恒温摇床，进一步消化45 min，加PBS 10 mL终止消化；在20 ℃下，200 r/min低速离心4 min；弃去上清液，加入含体积分数20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基10 mL，轻轻吹打沉淀直至成为细胞悬液；用细胞滤器除去未消化完全的残留瓣膜，将滤出的细胞液接种于10 cm培养皿内，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中静置培养，利用瓣膜间质细胞比内皮细胞贴壁快，培养2 h后换液，去除未贴壁细胞，24 h后再换液，之后隔日换液。

方法2：普通酶消化法(n=6)。取出主动脉瓣置入含0.25%胰酶的试管中，4 ℃下消化过夜；然后取出瓣膜，用含1%双抗冷PBS漂洗3次，将瓣叶剪碎，转到质量分数0.01%胶原酶Ⅱ的离心管中，放入预热为37 ℃的恒温摇床，进一步消化50 min；1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入含体积分数20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基，轻轻吹打瓣膜使细胞沉淀悬液，置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中静置培养，每3-5 d换液。

方法3：组织块种植法(n=6)。将取下的主动脉瓣组织，沿瓣叶交界剪开，瓣叶游离部分心室面和主动脉面用刀片轻轻刮除，以消除瓣叶内皮细胞。剩余瓣叶用DMEM培养液洗涤两至三次，剪成约1 mm³大小组织块，接种与培养瓶内，使其固定，将有组织的一面向上放入37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中，静置使组织块贴壁，6 h后加入含体积分数15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基进行培养，第5天去除组织块，每3-5 d换培养液，每次换液量是原培养基的1/2或2/3。

1.4.2 成肌纤维细胞的传代培养 3种方法获得的细胞，均在细胞生长约80%培养皿底面积时传代，用0.25%胰蛋白酶进行消化，每瓶加入3 mL，置于37 ℃消化2-5 min，镜下观察，当细胞明显回缩时立即加等量的培养液终止消化，同时用吸管轻轻吹打使细胞脱落。充分混匀后吸出0.1 mL计数，得出细胞总数后，将含细胞的培养液稀释为(2.5-3.0)×10⁸ L^-1，在75 cm²培养瓶每瓶接种10 mL细胞悬液，继续培养，依次传代。注意方法1传代后也需再次2 h换液，以进一步纯化瓣膜间质细胞，3-6代细胞被用于试验。

1.4.3 成肌纤维细胞鉴定^[16] ①光学显微镜观察：在倒置显微镜下观察原代和传代的细胞形态及生长情况；②免疫细胞化学鉴定：将消毒好的无菌盖玻片置于24孔板中，将培养瓶中细胞消化好后吹打为细胞悬液，种于放有玻片的24孔板中，放入37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱内培养24 h后，用冷PBS快速洗涤细胞3次；加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3×5 min；然后每孔加入适量的0.5% Triton穿孔15 min，室温下用冰PBS洗涤3×5 min；再用1∶10效价山羊血清封闭30 min后，分别加用1%BSA稀释的抗α-平滑肌肌动蛋白的一抗(效价1∶200)和抗血管性血友病因子的一抗(效价1∶200)，对照组加入同体积未加一抗的1%BSA，4 ℃杂交过夜；室温下用冰PBS洗涤3×5 min；加入1%BSA稀释的FITC标记的二抗(效价1∶50)，避光孵育1 h，室温下用冰PBS洗涤4×5 min；DAPI 5 mg/L进行核染色2 min，抗淬灭封片剂封固，做好标记，立即置于荧光显微镜下观察图像，于520-530 nm区间激发荧光拍照并保存。

1.5 主要观察指标主动脉瓣成肌纤维细胞的形态和荧光成像。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

至今为止，仍未有可靠有效的手段干预主动脉瓣膜钙化性病变的进展，其主要的原因就是没有完全弄清瓣膜钙化的发病机制^[17-18]。相关研究表明，心脏瓣膜钙化或许与慢性感染以及自身免疫情况有关^[19-20]；Coté等^[21]研究证实，瓣膜钙化性病变的发生、发展与慢性炎症关系密切，与此同时，瓣膜的狭窄程度与白细胞水平也有关系^[22]，但仍存在争论。因建立理想的体外瓣膜钙化研究模型相当困难，这就在一定程度上对研究瓣膜钙化的发病机制起到很大的限制作用。探讨主动脉瓣瓣膜钙化的发病机制，研究阻断其病理进程的可能性已成为心脏科医师观众的热点之一。但人们普遍认为主动脉瓣钙化是通过多种机制的相互作用从而诱导瓣膜间质细胞分化和向成骨细胞样表型转化，静息型的瓣膜间质细胞被激活后向成骨细胞型转化是退行性瓣膜钙化性疾病的发病关键，该激活的瓣膜间质细胞即成肌纤维细胞，组织化学特征是表达平滑肌α-平滑肌肌动蛋白，可以合成和分泌细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外基质成分、胶原蛋白、基质金属蛋白酶等^[23-25]。转化生长因子β和张力可以激活瓣膜成肌纤维细胞，使其Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白、热休克蛋白47的生物合成增加，导致瓣膜的细胞外基质结构发生改变^[26]。一旦肌成纤维细胞功能失衡，细胞就会呈现出持续性增殖，继而产生大量的细胞外基质，从而出现病理性纤维化^[21^，^27]。Kaden等^[28-29]研究发现，人主动脉瓣成肌纤维细胞受肿瘤坏死因子α、核因子κB受体激活物配体刺激后，基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2)、碱性磷酸酶的表达和活性明显增加，特别是骨钙素、骨形成蛋白和重要的成骨细胞转录因子Cbfa-1的基因表达明显上调，显示出成骨细胞样表型。在有炎症的前提下，用氧化型低密度脂蛋白刺激瓣膜成肌纤维细胞可导致其分泌某些强有力的炎性因子单核细胞趋化蛋白1、巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素6和白细胞介素8等^[25^，^30-31]。可见，成肌纤维细胞是瓣膜钙化过程的细胞学基础^[10]。因此，建立简单、稳定、有效的体外细胞模型对钙化性瓣膜疾病机制的研究至关重要。

自从Filip等^[32]报道猪心脏瓣膜间质细胞的培养方法,发现该细胞有平滑肌细胞的特性。随后瓣膜间质细胞的培养技术不断改进，多种动物的心脏瓣膜间质细胞在体外亦能成功培养。并发现猪主动脉瓣膜的解剖学和组织形态学与人类心脏瓣膜相似，因而较多地被应用于体外实验研究。本研究主要是描述猪心瓣膜成肌纤维细胞的分离、培养和鉴定。应用改进的方法成功培养出瓣膜间质成肌纤维细胞，经鉴定表型符合体外细胞实验的要求。作者在实验中经多次尝试3种方法获得的细胞得出以下结论：①方法1，两种酶联合消化处理细胞最主要的优点是培养周期相对较短，1周即生长汇合成单层，纯度可达到90%-95%，而且培养出的细胞数量多、活性强、传代细胞形态良好，传至六至七代时，细胞活性仍维持比较好的状态，可用于相关的体外功能试验或体外模型的建立，而且不需要特殊仪器或试剂，操作的程序较少，花费也较低；②方法2，过长时间的胰酶和胶原酶消化处理对细胞活性损伤都很大，需要加以观察和控制，胶原酶消化时间不宜超过3 h，优点就是周期短，但是获得的细胞由于消化过久活性很低，纯度不高，为70%-80%；③方法3，操作复杂，瓣叶的心室面和主动脉面难用刀子剔除干净，得出的成肌纤维细胞纯度不高，为60%-70%，而且培养周期较长，从接种组织块到细胞生长成单层，大约需要三至四周。此外，在选取标本时需要注意清除瓣环、腱索和钙化结节，避免带入瓣叶基底部心肌组织，在组织块接种前，应将瓣叶心室面和主动脉面用刀片刮除，以消除瓣叶内皮细胞或瘢痕组织，而且能获得高纯度的瓣膜间质细胞。作者还发现在严格控制培养条件下，成肌纤维细胞原代的形态相对单一，呈圆形或梭型，胞体较大，胞质突出，核大呈卵圆形。传代后，细胞排列多呈放射状、编织状或漩涡状走形，并伸出长短不一的伪足，后逐渐伸展成扁平形、菱形、纺锤形，半月形或不规则性。可看出心脏瓣膜间质细胞兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的形态，类似成肌纤维细胞的特性。瓣膜间质细胞位于瓣膜内皮下，是心脏瓣膜最多的细胞类型，和瓣膜内皮细胞一起是构成心脏瓣膜内稳态最重要的细胞，故鉴定主要是区分瓣膜间质细胞和内皮细胞。成骨样表型的肌成纤维细胞的组化特征是α-平滑肌肌动蛋白的表达，其不表达抗血管性血友病因子，同时内皮细胞表达抗血管性血友病因子而不表达α-平滑肌肌动蛋白，因此作者采用α-平滑肌肌动蛋白和抗血管性血友病因子来鉴定瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞。

尽管，任何体外细胞培养的研究都不能完全替代细胞在体内生长增殖的条件，但瓣膜肌成纤维细胞体外培养方法的建立，可以从体内错综复杂的影响因素中把肌成纤维细胞分离出来，再置于一定控制因素直接作用下，通过连续而直接的观察和研究细胞的形态结构、生长活性以及增殖等细胞活动及其影响因素，不仅可以揭示组织工程瓣膜形成的细胞学基础，而且还可为进一步研究钙化性心脏瓣膜疾病的相关机制提供研究模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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