碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料与动物体内骨组织的相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.012

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (16): 2523-2528.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.012

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碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料与动物体内骨组织的相容性

鹿鸣1，2，张雪松1，徐辉3，胡文浩1，杨晓青1

1解放军总医院骨科，北京市 100853；2总参管理保障部北极寺老干部服务管理局门诊部，北京市 100191；3山东聊城市人民医院骨科，山东省聊城市 252004

收稿日期:2015-03-21 出版日期:2015-04-16 发布日期:2015-04-16
通讯作者: 张雪松，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，解放军总医院骨科，北京市 100853
作者简介:鹿鸣，男，1984年生，北京市人，汉族，解放军总医院在读硕士，主治医师。

In vivo animal study on osteal histocompatibility of carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites

Lu Ming1, 2, Zhang Xue-song1, Xu Hui3, Hu Wen-hao1, Yang Xiao-qing1

1Department of Orthopedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 2Beijisi Clinic of Administer and Support Department, GSHQ, Beijing 100191, China; 3Department of Orthopedics, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252004, Shandong Province, China

Received:2015-03-21 Online:2015-04-16 Published:2015-04-16
Contact: Zhang Xue-song, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
About author:Lu Ming, Studying for master’s degree, Attending physician, Department of Orthopedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; Beijisi Clinic of Administer and Support Department, GSHQ, Beijing 100191, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料相对于羟基磷灰石材料和其他纳米羟基磷灰石二元复合材料在力学强度、韧性和弹性模量等方面有了明显的提高，可用于承受载荷部位的骨缺损修复。
目的：评价新型生物复合材料碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66在骨组织的生物相容性。
方法：使用巴马小型猪8只，在每只巴马小型猪的胸椎建立骨缺损模型并植入碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料，在植入后8，16，24周处死动物并取材，行骨密度检测，胸椎椎体缺损处行苏木精-伊红染色。在植入前、植入后1，8周取血，查肝肾功能并进行对比。
结果与结论：植入后8周，椎体松质骨断端封闭，复合材料被肉芽组织包裹，椎体松质骨断端可见软骨细胞，界面间软骨成骨活跃。植入后16周，肉芽组织机化通过纤维内成骨方式生成新的骨组织并与骨端骨质大致融合。植入后24周，新生骨组织已成为成熟的板层骨，断端与复合材料结合紧密。植入复合材料的椎体骨密度在植入后8，16，24周的均数呈上升趋势(P < 0.05)，随着植入时间增长，成骨量增加。植入前后的肝肾功能差异无显著性意义。实验可以初步认为碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66是一种组织相容性、生物活性好，无肝肾毒性的新型骨缺损修复材料。

关键词: 生物材料, 材料相容性, 纳米羟基磷灰石, 聚酰胺66, 碳纤维, 组织相容性, 骨缺损, 修复

Abstract:

BACKGROUND: Compared with hydroxyapatite materials and other nano-hydroxyapatite composites, carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites have been significantly improved in the mechanical strength, toughness, elastic modulus and other aspects. It can be used for repairing bone defects of loading parts.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites in bone tissues.
METHODS: Eight Bama mini pigs were taken to establish models of thoracic vertebral defects and implanted with carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites. At 8, 16 and 24 weeks after implantation,
the animals were sacrificed, respectively, for bone mineral density detection and hematoxylin-eosin staining. Blood samples for kidney and liver function tests were taken before and 1 and 8 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining of bone samples showed that the materials could bond with the bone defect interface without rejection, and could induce osteogenesis of chondrocytes. At 8 weeks after surgery, the broken ends of cancellous bone closed and the composite material was wrapped by granulation tissues. At 16 weeks after surgery, granulation tissues were organized and new bone developed directly from fibroblast cells. The new bone tissues were nearly fused with the end of cancellous bone. At 24 weeks after surgery, new bone tissue became mature lamellar bone, and the end of cancellous bone was connected tightly with the composite material. Bone mineral density of the implanted vertebra showed an increase trend at 8, 16 and 24 weeks after implantation. Over time, the bone mass was increased. The liver and kidney function tests showed that there was no significant difference before and after implantation. It is preliminarily believed that the carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composite has excellent histocompatibility and bioactivity without hepatic toxicity and nephritic toxicity.

Key words: Hydroxyapatites, Histocompatibility, Nanoparticles, Bone and Bones, Animal Experimentation

中图分类号:

R318

鹿鸣，张雪松，徐辉，胡文浩，杨晓青. 碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料与动物体内骨组织的相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(16): 2523-2528.

Lu Ming, Zhang Xue-song, Xu Hui, Hu Wen-hao, Yang Xiao-qing . In vivo animal study on osteal histocompatibility of carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(16): 2523-2528.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析及植入后一般情况观察所有8只实验用小型猪全部存活，无脊髓损伤、瘫痪等并发症，所有实验用小型猪均在苏醒后开始进食、水，植入后约5 d切口及其周围组织略红，无肿胀和炎性分泌物溢出，14 d后切口愈合良好。造模流程图见图2。

2.2 复合材料植入后实验动物血液生化指标变化各组尿素、肌酐、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶在植入前、植入后1，8周差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表1。结果表明复合材料植入前后各项肝肾功能指标差异无显著性意义，复合材料无肝肾毒性。

2.3 复合材料植入后实验动物椎体骨组织内组织学变化植入后8周，可见椎体松质骨断端基本由新生骨组织封闭，复合材料植入物被肉芽组织包裹(图3A)，椎体松质骨断端可见软骨细胞，界面间软骨成骨活跃(图3B)。植入后16周，可见肉芽组织机化通过纤维内成骨方式转化为大量新生成骨组织并与骨端骨质大体融合(图3C)。植入后24周，新生骨组织已成为成熟的板层骨(图3D)，断端与复合材料结合紧密。

2.4 复合材料植入后实验动物椎体骨密度变化如表2所示，CF-r-HA/PA66植入的椎体在植入后8，16，24周的骨密度均数呈上升趋势(P < 0.05)，成骨量增加，表明数据差异具有显著性意义，骨密度在3个观察时间点的数值呈上升趋势，成骨量增加。

2.5 不良反应及生物相容性分析所有8头巴马小型猪植入后全部存活，进食、精神好。CF-r-HA/PA66复合材料在实验动物体内是一种生物相容性好、无肝肾毒性、具有良好骨诱导活性，无其他不良反应的骨缺损修复材料。

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引言

由于创伤、肿瘤、感染和手术等多种因素造成的骨缺损始终是骨科所面临的一大难题，也是骨科医师和材料研究者一直致力研究的重点。

羟基磷灰石因其具有与自然骨相似的结构，组织相容性好，广泛应用于骨组织的修复。然而羟基磷灰石的力学性能较差，其抗弯强度低、脆性大、易断裂，其弹性模量、力学性能和人体骨不匹配，难以在承受载荷的骨组织中应用，只能应用于不承受负荷或仅承受小的纯压应力负荷的骨修复。

为了提高羟基磷灰石的强度和韧性，羟基磷灰石/天然高分子复合材料，羟基磷灰石/合成高分子复合材料等的研究成为热门领域^[1]，其技术也得到迅速发展，以期望合成植入后能够修复骨缺损区，并最终达到结构和机械性能与宿区骨组织相一致的骨移植材料^[2-3]。目前研究者已合成了大量的纳米羟基磷灰石/天然高分子合生物材料，如纳米羟基磷灰石/胶原纤维复合材料，纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合材料，但多数材料在临床实际应用中情况并不理想。

因为纳米羟基磷灰石/合成高分子复合材料在结构上与天然骨更接近^[4]，具有更好的力学性能，所以纳米羟基磷灰石/合成高分子复合材料成为骨组织修复材料的主要研究方向。

纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/ polyamide66，n-HA/PA66)是近年来发展出来的一种新型硬组织修复材料，这种复合材料具有高度的仿生性，其无机相的纳米羟基磷灰石在化学组成和结晶结构上同骨磷灰石极为相似；有机相聚酰胺(PA66)与人体的胶原蛋白在分子结构上十分相似，含有极性的酰胺键、羧基以及羟基基团，使其能引导组织细胞生长，促进细胞生成类骨质进而矿化，加快骨损伤的愈合^[5]。该材料的突出优点在于，材料的组成、结构与天然骨组织相似，且具有优良的力学相容性，其强度与模量人体骨组织相当^[6]，对其已有较广泛和深入的研究^[7-10]，已有椎体支撑体、椎间融合器、骨填充材料和人工椎板等产品在临床上有广泛应用^[11-17]，尤其在应用于脊柱手术中的支撑体和椎间融合器显示出了良好的前景^[18]，已广泛应用于临床中^[19-22]。

在承受载荷部位的骨缺损的修复，不仅需要有足够的力学强度，同时具有良好的韧性以及合适的弹性模量，纳米羟基磷灰石/聚酸胺材料虽有良好的模量，但强度不足以用于承受载荷部位的的骨缺损修复^[9]；而碳纤维(carbon fiber，CF)具有良好的机械性能、生物稳定性和生物相容性，已被广泛用作生物复合材料的加固^[9]，可在纳米羟基磷灰石/聚酰胺66中添加碳纤维提高生物活性复合材料的力学性能。

因此，碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(carbon fiber reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide66，CF-r- HA/PA66)产品在强度上较原纳米羟基磷灰石/聚酰胺66产品有了提高，表现出了良好的抗拉伸、剪切和弯曲、延展性和能量吸收能力^[9]。将羟基磷灰石的高生物学活性、聚酰胺的细胞诱导性和碳纤维的强度与韧性相结合，使材料的生物活性和力学性能与人类皮质骨的生物活性和力学性能更相似，在承受载荷部位的骨修复及固定修复方面具有良好的应用前景。

在既往的研究中，多限于对材料的制备和体外生物安全性的评价，文章观察了CF-r-HA/PA66复合材料在动物体内组织相容性、肝肾毒性和成骨情况。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年12月至2014年9月在解放军总医院动物实验中心完成。

材料：

实验动物：健康成年雄性巴马小型猪8只，体质量为35-40 kg，由解放军总医院动物实验中心提供。

CF-r-HA/PA66复合材料：由四川大学纳米生物材料研究中心分析测试中心提供，为高10 mm、直径6 mm 的复合材料圆柱状物。

实验方法：

分组及骨缺损模型猪的构建：取健康成年雄性巴马小型猪8只，随机分为观察8，16，24周组共3组，每只动物植入前禁食24 h，但可自由饮水，先对动物采用咪达唑仑与速眠宁(1∶1)合剂进行肌注，用量0.5 mL/kg，进行麻醉诱导。将动物转入动物手术室后，采用体积分数3%戊巴比妥钠，静脉注射，用量1.5-3.0 mL/kg。连接呼吸机、监测仪监测术中呼吸、心率以及血氧和二氧化碳的变化。麻醉后进行气管插管后连接呼吸机、心电监测仪。

采用右侧卧位进行备皮，碘酒、乙醇消毒，常规铺单后沿小型猪胸腔前外侧肋骨做约20 cm的斜形切口，逐层切开，彻底止血，去除一根肋骨，打开胸膜、使用肋骨撑开器撑开肋骨，保护左肺后，显露出3节胸椎(图1A)，使用骨膜剥离器剥离骨膜，用环钻和刮匙在每节胸椎中央开圆柱形槽(高10 mm，直径8 mm，图1B)^[23]。将CF-r-HA/PA66圆柱体复合材料放入3个椎体骨槽中(图1C)，用骨蜡封闭植入材料后的骨槽(图1D)。逐层缝合。植入后小型猪不做固定，单独动物笼饲养，植入后2 d给予抗生素注射预防感染；观察记录实验动物精神状态、进食、切口有无感染。

植入后8，16，24 周处死动物后，做后正中切口进入，将植入复合材料的椎体取出，行组织学切片和骨密度检测。

血液生化检测：分别在植入前、植入后1周和植入后8周取血，在解放军总医院生化科进行血液中尿素、肌酐、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平检验^[24]，对数值进行统计学检验，判断植入物是否有肝肾毒性。

组织学观察：植入后8，16，24周，将实验动物处死并取材，将植入复合材料的椎体取出后，经过固定、脱钙、脱水、浸蜡包埋后制成切片，行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察植入复合材料的降解、骨小梁的长入等情况。

骨密度测量：将植入后8，16，24周的实验动物处死并取出植入复合材料的椎体，去净软组织于平放于扫描台上，用NORLAND XR36型双能X射线吸收骨密度仪(dual energy X-ray absorptiometry，DEXA)扫描。每个标本重复测量3次，取平均值。

主要观察指标：植入前后各组的肝肾功指标，组织学切片的骨组织长入情况，骨密度的变化。

统计学分析：采用SPSS 16.0和CHISS统计学软件进行数据统计分析，结果用x(_)±s表示，组间数据数据差异的采用单因素方差分析和q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

对于骨缺损的治疗，目前在临床上应用较广的是自体骨移植、同种异体骨移植。自体骨至今仍是衡量植骨融合的“金标准”^[25]，而自体骨取骨存在多种并发症。同种异体骨存在疾病传染、来源有限、费用较高等不足^[26]。所以，对于人工骨缺损材料的需求是极大的。

理想的骨缺损修复材料应具有以下特点：①生物相容性好；②力学性能较好；③有生物活性的表面^[27]。尤其对于一些应力集中部位修复材料的力学特性和生物活性要求就更高。羟基磷灰石具有优异的生物活性、生物相容性，有研究表明^[25]，羟基磷灰石对成骨细胞有较好的亲和性。

因此，为了提高羟基磷灰石的力学性能和综合性能，很多学者进行了大量的研究，发现将羟基磷灰石与聚合物制备复合物体系可以有效解决这一问题^[6^，²⁴^，^28-30]。纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料即为其中的一种，这种复合材料的力学强度接近人类皮质骨的力学强度，适宜的弹性模量，而且具有良好的生物相容性、生物稳定性^[31-49]。但在深入研究中发现^[9]，纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料强度和韧性不足以用于承受载荷较大部位的骨缺损修复，因此向复合材料中加入了常用的生物材料加固物碳纤维，制成CF-r-HA/PA66复合物。

实验通过动物体内实验来评价CF-r-HA/PA66复合材料的组织相容性，首先通过一般观察，所有用于实验的8头巴马小型猪全部存活，精神饮食正常，无脊髓损伤、瘫痪等手术并发症，无明显排异反应；其次，植入前、植入后1，8周的肝肾功检验结果经统计学检验后可以认为，CF-r-HA/PA66材料对巴马小型猪的肝肾功无影响，无急慢性毒性反应；并且通过组织学切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察椎体松质骨断端与复合植入物间的结合以及骨长入情况，植入后8周时，复合材料被肉芽组织包裹，椎体松质骨断端可见软骨细胞，界面间软骨成骨活跃，植入后16周时，肉芽组织机化通过纤维内成骨方式生成新的骨组织并与骨端骨质大体融合，植后24周时，新生骨组织已成为成熟的板层骨，断端与复合材料结合紧密；最后，通过对于骨密度检测和对于度密度数据的统计研究后，显示骨密度在3个观察时间点的数值呈上升趋势且差异有显著性意义，成骨量增加。骨密度检测结果与组织学切片观察结果可相互印证。

综上所述，本次实验证明了CF-r-HA/PA66在实验动物体内是一种生物相容性较好、无肝肾毒性、具有良好生物活性的新一代可支撑载荷的骨缺损修复材料。然而，CF-r-HA/PA66作为一种新的复合生物材料，目前仍然缺乏对其细胞学和分子生物学的研究，有许多的问题还没有得到解答，如骨诱导性、材料的降解、与其他复合材料或自体骨的成骨效果对比实验等，都需要进一步的探索和长期的随访。

实验相信随着对其研究的进一步深入，CF-r-HA/PA66复合材料也会面临新的挑战，得到新的改良，终将会成为一型具有广阔应用前景的新材料。

碳纤维增强纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料与动物体内骨组织的相容性

In vivo animal study on osteal histocompatibility of carbon fiber-reinforced nano-hydroxyapatite/polyamide 66 composites

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