补肾接骨中药对骨折修复的成骨作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.028

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (15): 2442-2448.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.028

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补肾接骨中药对骨折修复的成骨作用及机制

曾展鹏，周驰，李康活，王海彬，唐宏宇

广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405

修回日期:2015-03-12 出版日期:2015-04-09 发布日期:2015-04-09
通讯作者: 曾展鹏，广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405
作者简介:曾展鹏，男，1973年生，广东省梅州市人，汉族，1997年广州中医药大学毕业，硕士，副主任医师。
基金资助:
广东省科技计划项目(2013B021800167)；国家自然科学基金项目(81373665)

Osteogenesis effects and mechanisms of Kidney Chinese Herbs after fractures

Zeng Zhan-peng, Zhou Chi, Li Kang-huo, Wang Hai-bin, Tang Hong-yu

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Revised:2015-03-12 Online:2015-04-09 Published:2015-04-09
Contact: Zeng Zhan-peng, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Zeng Zhan-peng, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan of Guangdong Province, No. 2013B021800167; the National Natural Science Foundation of China, No. 81373665

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨折愈合是成骨细胞与破骨细胞耦联相互作用相互影响促进骨质生长的过程，其中成骨细胞介导骨的形成，破骨细胞介导骨吸收，使骨重建处于一种动态平衡中，于动态平衡环境中促进骨生长，而目前研究多数倾向于单独的成骨或者破骨机制，但会忽略这两种细胞共同存在的环境下相互作用机制。
目的：观察补肾接骨中药对成骨与破骨细胞耦联中骨护骨素-核因子κB受体激活剂的配基-核因κB受体活化因子的影响及其在骨折治疗中的作用机制。
方法：分离小鼠成骨、破骨细胞并体外细胞培养，建立小鼠“成骨-破骨细胞共育系”作为研究平台，补肾接骨中药1.25，2.5，6.25 g/(kg•d)灌胃，空白对照组给予同等体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续7 d。
结果与结论：共育培养24 h后，成骨细胞内碱性磷酸酶水平明显高于单纯培养的成骨细胞(P < 0.05)。实时PCR检测显示，共育体系细胞中碱性磷酸酶、Runx2及骨护骨素表达增加(P < 0.05)，呈剂量依赖性(P < 0.05)。Western-blot检测显示，高浓度[6.25 g/(kg•d)]中药能明显促进骨护骨素、核因子κB受体激活剂的配基的表达，抑制核因子κB受体活化因子蛋白表达(P < 0.05)。结果证实，补肾接骨中药可动态调节骨护骨素-核因子κB受体激活剂的配基-核因子κB受体活化因子信号通路，对促进骨组织重建与恢复有着积极的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 补肾接骨, 中医药, 骨痂, 成骨-破骨细胞, 耦联, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Fracture healing is the coupling interaction of osteoblasts and osteoclasts that promotes bone growth, in which osteoblast-mediated bone resorption and osteoclasts-mediated bone reconstruction make the bone reconstruction in a dynamic equilibrium to promote bone growth. However, the majorities of the current studies focus on osteogenic or osteoclastic mechanism alone, and ignore the interaction mechanism between these two cells under co-existing conditions.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Kidney Chinese Herbs on osteoblasts and osteoclasts coupling of osteoprotegerin-receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-receptor activator of nuclear factor kappaB and its mechanism of action in fracture treatment.
METHODS: Mouse osteoblasts and osteoclasts were isolated and cultured in vitro to establish the mouse “osteoblast-osteoclast co-culture system” as a research platform. Then, Kidney Chinese Herbs at doses of 1.25, 2.5, 6.25 g/(kg•d) were given intragastrically for 7 consecutive days. Mice in the blank control group were fed with the same volume of normal saline.
RESULTS AND CONCLUSION: The alkaline phosphatase activity in osteoblasts co-cultured with osteoclasts was significantly higher than that in osteoblasts cultured alone at 24 hours of culture (P < 0.05). Real-time PCR showed that in the co-culture system, the expression of alkaline phosphatase, Runt related transcription factor 2 and osteoprotegerin were increased in a dose-dependent manner (P < 0.05). Western blot assay showed 6.25 g/(kg•d) Kidney Chinese Herbs could dramatically promote the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappaB ligand, but restrained the expression of receptor activator of nuclear factor kappaB (P < 0.05). These findings indicate that Kidney Chinese Herbs can dynamically regulate the osteoprotegerin-receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-receptor activator signaling pathway, and has a positive effect to promote bone reconstruction and rehabilitation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Drugs, Chinese Herbal, Osteoclasts, Osteoblasts

中图分类号:

R318

曾展鹏，周驰，李康活，王海彬，唐宏宇. 补肾接骨中药对骨折修复的成骨作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(15): 2442-2448.

Zeng Zhan-peng, Zhou Chi, Li Kang-huo, Wang Hai-bin, Tang Hong-yu . Osteogenesis effects and mechanisms of Kidney Chinese Herbs after fractures[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(15): 2442-2448.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 纳入雌雄C57小鼠30只，进入结果分析25只，死亡4只和感染1只，均补充各组动物数量，最终计入结果分析的小鼠数量30只，用于细胞培养的小鼠不计入数量分析。

2.2 建立了稳定的“成骨-破骨细胞共育系”模型 培养3周，如图1A所示，单纯的成骨细胞培养，碱性磷酸酶染色仅有少量的阳性表达，说明只有很少的细胞分泌碱性磷酸酶；而如图1B所示，在将成骨细胞和破骨细胞共培养后，染色可见大量的阳性表达，说明有大量的细胞分泌碱性磷酸酶。与之相吻合的，对成骨细胞内碱性磷酸酶进行定量检测，如图1C所示，共育体系中的低、中、高剂量组碱性磷酸酶阳性细胞数分别为：2.15±0.23，2.16±0.34，3.57±0.37个，其各组表达均大于单纯培养的成骨细胞(1.00±0.13；P < 0.05)。

2.3 骨吸收陷窝的观察结果 培养2周，扫描电镜下察，发现共培养体系中象牙骨表面骨质缺失，陷窝明显，而单独破骨细胞吞噬组，其象牙骨表面相对较为完整，骨陷窝不明显。见图2。

2.4 细胞共育的体系中补肾接骨中药对该信号通路中相关基因表达的影响 共育体系中细胞中碱性磷酸酶、Runx2及转化生长因子β1表达增加(P < 0.05)，呈剂量依赖性。在共育体系中，低剂量的补肾接骨中药，对细胞中碱性磷酸酶，Runx2及转化生长因子β1等基因表达有促进作用(P < 0.05)；淫羊藿为主的药物，对碱性磷酸酶及Runx2基因有较明显的促进作用(P < 0.05)。淫羊藿对细胞中碱性磷酸酶，Runx2等基因表达，未检测出有剂量依赖性，但高剂量淫羊藿可增加碱性磷酸酶和Runx2基因的表达(P < 0.05)，低剂量和中剂量相比较，转化生长因子β1并没有明显增加，见表2。

2.5 细胞共育的体系中补肾接骨中药对该信号通路中相关蛋白表达的影响 据数据统计发现，与空白组相比较，补肾中药组各蛋白表达均有增加，低剂量与中剂量相比较，各蛋白表达差异不显著，高剂量中药对OPG，RNAK蛋白的生成有明显的促进作用，而对RNAKL蛋白的生成有一定的抑制作用，而无论高、低剂量中药均对OPG蛋白均有明显促表达作用，随着补肾中药的剂量的增加(P < 0.05)，OPG表达也逐渐增加(P < 0.05)，见表3。

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引言

目前骨质疏松性骨折成为当今社会严重危害患者生存质量和占用医疗资源的难治性疾病，因此，如何防治骨质疏松性骨折，恢复骨结构的完整性，改善骨生物学性能是当前研究促进骨损伤修复研究领域的热点、难点问题之一^[1]。骨结构完整性的恢复是目前治疗骨折修复的热点问题，而其中尤以促进骨痂形成为重。

在骨修复的过程中，成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间为促进与抑制相互拮抗、对立统一的关系^[2]。成骨与破骨处于耦联的过程中，骨组织代谢主要是由成骨细胞和破骨细胞完成的^[3]，机体在骨形成和骨吸收的过程中不断转换，以动态平衡机体功能活动。

正常生理条件下，成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收相互耦联，使骨重建处于一种动态平衡中，从而维持机体骨量与骨密度的正常^[4]。耦联的破坏，出现骨形成减少或(和)骨吸收增强，引起骨代谢的变化，表现为机体的修复失败，可发生骨质疏松等^[5]。从另外一个方面，可以看到，在骨的重建过程中，如骨折的早、中、晚期修复中，破骨细胞骨修复中有积极的意义。

近年来的研究发现，骨保护素-核因子kB受体激活剂的配基-核因子kB受体活化因子(osteoprotegerin-ligand of receptor activator of NF-kappaB-receptor activator of NF-kappaB，OPG-RANKL-RANK)是破骨细胞分化过程中一条关键的信号传导通路^[6]。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达护骨素与RANKL 竞争性结合，阻止RANKL与RANK之间的结合^[7]。OPG-RANK-RANKL调节轴是破骨细胞分化和活化的主要调节形式，其中跨膜受体RANK的激活是该调节轴作用的核心^[8]。

RANK 信号传导通路，以及通路中各因子作用的研究，不仅对该调节轴作用机制的阐明具有重要意义，更为在分子水平认识和干预骨代谢疾病提供了理论基础^[9]。RANK激活后的信号通路调节是OPG-RANK-RANKL调节轴的重要组成部分，其中适配分子TRAF6(TNFreceptor- associated factor 6)是该信号网络的中心环节，并可能成为细胞因子和激素调节作用的靶点^[6]。

实验旨在观察补肾接骨中药对成骨与破骨细胞耦联中相关基因碱性磷酸酶、RUNX-2、转化生长因子β1及RANK，RANKL表达的影响，进而探讨补肾法通过调节OPG- RANKL-RANK信号通路促进骨折治愈合的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年10月至2015年1月在广州中医药大学国家重点骨科实验室完成。

材料：

实验动物：不同周龄C57小鼠30只，雌雄各半，用于分组干预；另购买同种类6周龄C57雌鼠出生24 h内的胎鼠4只和6周龄C57雌鼠3只用于细胞培养，均购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0002粤监证字20080007；实验动物使用许可：SYXK(粤)2008-0092，实验场地为SPF级环境(广东省动物实验环境设施检测合格证：粤监证字2008C067号)。

补肾接骨中药：仙灵骨葆胶囊由淫羊藿、续断、补骨脂、地黄、丹参、知母6味中药组成，由贵州仙灵药业有限公司生产，国药准字Z20025337；1 g胶囊内容物含补骨脂素0.93 mg，异补骨脂素0.95 mg 和淫羊藿苷9.2 mg，将其溶于10倍蒸馏水中，90 ℃煎煮至上清液浓缩为2∶1。冷却后，加入体积分数95%乙醇，搅拌均匀，滤纸过滤，4 ℃冷藏静置48 h，以4 500 r/min离心15 min，取上清。沉淀物再加体积分数95%乙醇，搅拌均匀，滤纸过滤，4 ℃冷藏静置12 h，以4 500 r/min 离心15 min，上清与上一次乙醇上清合并。60 ℃恒温水浴浓缩挥发乙醇，至2 g/mL原生药液，放入4 ℃冰箱保存备用。灌胃前用蒸馏水配制成所需浓度的药液。

实验方法：

含药血清量效关系测定：参照以往实验方法^[3]，实验分中药高、中、低剂量组和空白组进行对比研究。补肾接骨中药分别以等效剂量的0.5，1.0，2.5倍剂量，连续2次(间隔2 h)灌胃，于末次灌胃后1 h采血；同等条件下制备生理盐水灌胃对照血清。各组含药血清添加浓度(体积分数)又分别为10%，20%和30%。

分组及干预：将C57小鼠30只随机分为高、中、低剂量各8只和空白组6只。用相当于人日用临床剂量，按照人-大鼠体表面积比值折算大鼠等效给药剂量，仙灵骨葆胶囊予以质量浓度为0.25 g/mL水溶液(取1 mL原生药液加7 mL蒸馏水，所得药液浓度即为0.25 g/mL，按1.25，2.5，6.25 g/(kg•d)(10 mL/kg)灌胃给药，空白对照组给予同等体积的生理盐水(10 mL/kg)，每日1次，连续7 d，第7天灌服中药后30 min麻醉，腹主动脉采血，离心提取含药血清，于第3代传代细胞进行干预。

成骨细胞的培养方法：经体积分数0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将上述同种类C57小鼠24 h内的胎鼠4只，置入体积分数75%乙醇中浸泡5 min。于超净台上取顶骨，放入PBS皿中，刮除附着组织，待骨质发白、透亮，再放入PBS小瓶反复冲洗，换液3次，以体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶消化30 min后吸弃酶液，再以PBS冲洗3次，加入体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶，将骨剪成1 mm²大小，放置15 min后加入与酶液等量的含体积分数15%小牛血清的DMEM培养基，吸取上清液，以1 000 r/min离心10 min，将下层液接种于50 mL培养瓶，离心液去上清后接种于25 mL培养瓶，分别加入上述培养基，置入37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱内。每2日换液1次，待细胞长满后，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。

成骨细胞的鉴定：待细胞爬片，生理盐水冲冼后，以饱和丙酮固定，染色采用碱性磷酸酶试剂盒，观察骨小结节的形成情况和细胞分泌。加入四环素培养1 h后，荧光显微镜观察。

破骨细胞的培养：选取6周龄的C57雌性小鼠3只，按150 mg/kg的剂量经尾静脉注射5-Fu后第4天予以处死。体积分数75%乙醇浸泡5-10 min后，于无菌条件下取出脾脏。在预置培养液的培养皿中于脾游离端剪一小口，用弯形小镊向小口方向推压脾的内容物以制备细胞悬液。96孔板培养，每孔0.1 mL(培养液含10 g/L小牛血清白蛋白、10^-⁸ mol/L白细胞介素6，50 U/mL白细胞介素3、含0.3%琼脂的α-MEM和体积分数为30%的FCS)。在37 ℃下于体积分数为5%CO₂培养箱中培养7 d，显微镜下可见细胞集落形成后转种于另一个96孔板培养(培养液含200 U/mL GM-CSF、α-MEM和体积分数5%的FCS)，每孔0.1 mL，培养7 d。弃去上层培养液，刮下贴壁细胞，再次转种于另一96孔板培养(培养液含10^-8 mol/L的1，25(OH)₂D₃、α-MEM和体积分数10%的FCS)，0.1 mL/孔，培养7 d，即可获得破骨细胞。

破骨细胞的鉴定：染色采用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)试剂盒，将细胞爬片PBS冲洗后经2.5%戊二醛4 ℃固定30 min，放入孵育液(0.1 mmol/L醋酸缓冲液18 mL，六偶氮副品红1 mL，萘酚AS-BI磷酸盐20 mg，酒石酸钾钠50 mmol/L)内，37 ℃孵育30 min，取出细胞爬片，蒸馏水冲洗，中性树胶封固，光镜观察。并以TRAP(+)多核细胞(3个或3个以上核)为破骨细胞，对每个玻片上10个随机视野(×200)中的破骨细胞进行计数(个/玻片)。

成骨细胞和破骨细胞耦联模型的建立：取上述培养的破骨细胞和成骨细胞，建立共培养体系，于距培养孔底部约2 mm处打孔，连通相邻4孔，微孔滤膜(0.45 μm)置于中间层，以琼脂糖凝胶(质量分数为3%)密封膜与培养板结合处，隔离左右两室，以防细胞混杂，上清液可以相互交通。培养板制备完毕后紫外线灯照射消毒，备用。

并在共育的第3天于含药血清干预细胞，在共培养体系中，成骨细胞上以Runx2受体定位，破骨细胞上以RANK定位，确认共育体系中的细胞特征。

骨吸收陷窝的观察：将破骨细胞及共育体系细胞分别混合牛骨薄片于12孔板培养5 d，取出骨片。在4 ℃下将骨片于体积分数2.5%戊二醛固定液中固定7 min，固定后于体积分数0.25% NH₄OH溶液中进行1 min超声清洗，反复3次，依次不同体积分数乙醇脱水，晾干后以甲苯胺蓝试剂于室温下染色3 min，蒸馏水清洗，扫描电镜下观察。

细胞共培养体系中上游调控基因碱性磷酸酶、Runx2及转化生长因子β1在成骨细胞中的基因表达的实时PCR检测：cDNA制备：细胞内总RNA的提取及cDNA第一链的合成采用RNeasy试剂盒完成。以12.5 μL无RNase的水溶解0.5-1.0 μg总RNA后，在70 ℃下维持5 min，变性后予以冰激。向处理后的总RNA中加入1 μL MMLV 反转录缓冲液(25 ℃，含5 μmol/L随机引物，0.5 mmol/L dNTP mix，1.0 U/μL RNAsin及10 U/μL MMLV反转录酶)，加水调节体积至20 μL。在42 ℃条件下维持1 h以合成cDNA第一链，95 ℃、5 min终止反应。

PCR扩增：所测蛋白的PCR引物序列见表1，所有引物序列均已经过blast软件与Genbank序列进行对比和验证，确保每个引物不和其他基因序列配对。向PCR反应液(10 mmol/L Tris-Cl，0.3U Taq Polymerase，1.5 mmol/L MgCl₂，50 mmol/L KCl，0.2 mmol/L dNTP，0.001% gelatin)中加入等量的cDNA (含有约25 ng总RNA)，总体积为10 μL。

反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 50 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min。为了得到可重复性的结果，两三个PCR循环数被扩增，重复实验3次。含EB的2%琼脂糖凝胶分析PCR产物，紫外光下数码相机拍照，根据起始拷贝数的标准品作出标准曲线，获得反应过程中的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数(2^-^??Ct)。

OPG-RANKL-RANK信号通路中各蛋白Western blot分析：利用蛋白抽提试剂盒抽提培养细胞中的蛋白，并采用Lowry法测定其浓度。取纯化蛋白80 mg，加入等量2×SDS的蛋白加样液，煮沸3 min。以SDS-PAGE分离后，在转移缓冲液中浸泡凝胶与滤纸(3 mm)，铺胶，顺序为8层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜28层滤纸，最后在蛋白凝胶转膜仪上(8 V/cm²)转移1 h。用含50 g/L 无脂牛奶的TBS将转移好的硝酸纤维素膜于室温下封闭1 h后，TBS清洗，重复3次。加入相对应的兔抗鼠蛋白抗体(1∶200)，室温下孵育2 h，洗涤，再加入羊抗兔HRP(1∶500)，室温孵育1 h，再次洗涤后，DAB显色，所用一抗均为单克隆抗体。目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表该样品的蛋白相对含量。

主要观察指标：各组OPG，RNAK，RNAKL的表达量。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件进行数据分析，各组间数据差异比较采用两样本t 检验，相关指标与骨折愈合的关系采用多元线性回归分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

骨的形成是成骨细胞和破骨细胞共同作用的结果。正常情况下，人体的骨骼并不是稳定不变的，成骨细胞的骨形成作用和破骨细胞的骨吸收作用相互拮抗、相互耦联，使得机体的骨量和骨密度处于一种动态平衡中^[4]。

成骨细胞促进破骨细胞激活因子的表达^[10]。骨吸收的主要执行者为破骨细胞，但只有成骨细胞存在，破骨细胞激活因子的骨吸收作用才能进行表达^[11]。骨吸收刺激因子的作用是促进破骨细胞前体的增殖和向破骨细胞的分化，还可以增强破骨细胞的骨吸收功能，加速骨质的吸收^[12-14]。按照信号转导方式的不同可以将不同的骨吸收刺激因子分为3类：通过维生素D受体[1，25(OH)₂D₃]途径转导的；通过蛋白激酶A[PTH (白细胞介素1)]途径转导的；通过gp130(白细胞介素6，11)转导的^[5-7]。虽然骨吸收刺激因子可以强化破骨细胞的骨吸收作用^[23]，但这些因子的受体并不存在于破骨细胞的表面，也不能与破骨细胞发生反应，相反的是，其受体存在于成骨细胞表面，且能与之发生反应，最终作用于破骨细胞前体和破骨细胞，促进骨吸收作用^[15]。

截止至目前的研究结果表明，能直接刺激破骨细胞发育和使之激活的细胞因子只有RANKL，它可以促进破骨细胞的增殖、成熟及分化，并能够抑制破骨细胞的凋亡，延长其存活时间^[8]。

OPG-RANKL-RANK系统是一条重要的信号通道^[16]。近年来关于破骨细胞的研究表明，OPG-RANKL-RANK系统是破骨细胞分化和活化的主要调节形式，是目前为止发现的最为重要的一条信号通路，该通路的核心是跨膜受体 RANK 的激活^[9]，而位于破骨细胞细胞膜上的RANK是RANKL的受体^[10-11]。

实验成功建立了“成骨-破骨细胞共育系”细胞共培养模型，且证明了在共育体系中，低剂量的补肾中药，对细胞中碱性磷酸酶，Runx2等基因有促进的作用；淫羊藿为主的药物，高剂量时对OPG、碱性磷酸酶及Runx2的促进作用较明显。OPG的增加可抑制破骨细胞的分化，而RANKL的增加则会促使破骨细胞的增殖分化，且两者都通过与RANK结合后发挥相应生物学效应。OPG/RANKL比率的改变是显示破骨细胞活化增殖的最直接指标，该实验结果显示OPG增加明显而RANKL则表现出抑制的现象。因此，补肾中药通过抑制破骨细胞增殖诱导剂RANKL的表达而降低其活性，同时又能显著促进成骨细胞相关基因如碱性磷酸酶，Runx2和OPG等表达，表明其成骨活性较强。

在中医理论“肾主骨，生髓”的理论指导下形成了补肾接骨的中药组方^[17-19]。中医理论认为“肾主骨，生髓” ^[20-21]，在此理论指导下形成了补肾接骨的中药组方。本方以淫羊藿、补骨脂共为君药，旨在补肝肾、续筋骨。《本草从新》述淫羊藿可以“疗骨痿”、“补伤折”。欧阳露等[12]认为补骨脂可以增加转化生长因子β1在骨痂组织中的表达，提高成骨细胞的活性和数量，从而增加骨痂厚度，提高骨折愈合质量。赵亮等^[13]的实验结果表明补肾中药能促进基质钙化、促进骨痂生长、加快骨痂的改建。

实验结果发现，共育系统促进成骨细胞碱性磷酸酶的阳性表达^[22]。作者在实验中发现，成骨细胞和破骨细胞共育培养24 h后，共育体系中成骨细胞碱性磷酸酶的阳性表达明显高于单纯的成骨细胞培养。证明此时，成骨细胞、破骨细胞共育系中碱性磷酸酶的增加将促进骨量的生成。其次，实验证明，补肾接骨中药在共育体系中对细胞中Runx2及OPG等有促进作用，并和剂量成正向的关系，OPG的增加较大的抑制了RANKL的表达，对RNAK的生成有明显的促进作用。另外，实验还发现，低剂量组和中剂量组比较，其成骨活性没有明显差异，统计无显著性意义，而当使用高剂量时，成骨活性则明显增加，证实补肾中药在早期对成骨能力相对较弱，而当药物累及到一定程度时，其促进骨形成的能力则明显增加。

老年人骨折治疗应在活血祛瘀的基础上配以补益肝肾^[23-26]。骨折虽多为气滞血瘀之证，但老年人体质特殊，多为肝肾不足，致筋骨衰弱，故老年人骨折多为虚实夹杂^[27-28]，不可一味以实证论治，而应在活血祛瘀的基础上配以补益肝肾^[29]。

补肾接骨中药补益肝肾，补血健骨，与骨代谢中成骨-破骨耦联动态平衡有异曲同工之妙，通过动态调节 OPG-RANKL-RANK传导通路，对促进骨组织重建与恢复有着积极的作用^[30-40]。具体更加深入的机制仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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补肾接骨中药对骨折修复的成骨作用及机制

Osteogenesis effects and mechanisms of Kidney Chinese Herbs after fractures

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