转录因子c-fos/c-jun调控成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (11): 1673-1677.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.11.007

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转录因子c-fos/c-jun调控成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的表达

唐培娟¹，王长磊²，宫春梅¹，唐培倩³，郝建忠²

¹潍坊医学院口腔学院，山东省潍坊市 261053；²潍坊医学院附属医院口腔科，山东省潍坊市 261031；³昌乐县中医院妇产科，山东省潍坊市 262400

修回日期:2015-01-17 出版日期:2015-03-12 发布日期:2015-03-12
通讯作者: 郝建忠，主任医师，硕士生导师，潍坊医学院附属医院口腔科，山东省潍坊市 261031
作者简介:唐培娟，女，1988年生，山东省潍坊市昌乐县，汉族，潍坊医学院在读硕士，主要从事牙体牙髓病的研究。

c-fos/c-jun regulates extracellular matrix metalloproteinase 20 expression in ameloblasts

Tang Pei-juan¹, Wang Chang-lei², Gong Chun-mei¹, Tang Pei-qian³, Hao Jian-zhong²

¹Institute of Stomotalogy, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China; ²Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031, Shandong Province, China; ³Department of Gynecology and Obstetrics, Changle Hospital of Integrative Medicine, Weifang 262400, Shandong Province, China

Revised:2015-01-17 Online:2015-03-12 Published:2015-03-12
Contact: Hao Jian-zhong, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031, Shandong Province, China
About author:Tang Pei-juan, Studying for master’s degree, Institute of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：基质金属蛋白酶20是在成釉细胞中特异性表达的一种蛋白酶，其在牙齿釉质发育过程中具有重要作用。从分子角度研究基质金属蛋白酶20可受到的调控机制，为进一步做动物实验奠定基础。

目的：通过研究转录因子c-fos/c-jun对小鼠成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的调控作用，初步确定c-fos/c-jun在牙釉质发育中的作用。

方法：首先构建c-fos真核表达载体重组质粒，分别利用双荧光素酶基因检测报告系统和定时定量RT-PCR法分析c-jun、c-fos转染成釉细胞对基质金属蛋白酶20基因活性的影响；并利用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统进一步分析c-jun、c-fos对基质金属蛋白酶20基因活性的影响。

结果与结论：双荧光素酶基因检测报告系统和定时定量RT-PCR法分析显示c-jun、c-fos转染转染小鼠成釉细胞后，基质金属蛋白酶20基因表达显著上调；突变基质金属蛋白酶20启动子的AP1结合位点后，c-fos/c-jun失去上调基质金属蛋白酶20启动子的转录活性的作用。结果提示c-fos/c-jun对基质金属蛋白酶20基因表达具有重要的调节作用，表明其在釉质发育过程中有其重要的生物学意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 转录因子c-fos, 基质金属蛋白酶20, 双荧光素酶基因检测, 实时定量RT-PCR

Abstract:

BACKGROUND: Matrix metalloproteinase 20 is a protease specifically expressed in ameloblasts, which has an important role in dental enamel development. To study the regulatory mechanisms for matrix metalloproteinase 20 at the molecular level lays the foundation for further animal experiments.

OBJECTIVE: To explore the regulatory effects of transcription factor c-fos/c-jun for matrix metalloproteinase 20 in mouse ameloblasts and to preliminarily confirm the role of c-fos/c-jun in enamel development.

METHODS: First of all, a recombinant plasmid containing c-fos was established, and then dual-luciferase reporter assay system and RT-PCR were used to analyze the effects of c-fos, c-jun transfection of ameloblasts on the activity of matrix metalloproteinase 20. Furthermore, the effect of c-fos, c-jun on matrix metalloproteinase 20 was explored based on gene site-directed mutation and dual-luciferase reporter assay system.

RESULTS AND CONCLUSION: Double luciferase report assay system and RT-PCR analysis showed that the mRNA expression of matrix metalloproteinase-20 was significantly upregulated after c-fos, c-jun transfection of ameloblasts, but c-fos/c-jun could not upregulate the transcriptional activity of matrix metalloproteinase 20 promoter when mutation occurred at AP1 binging site. These findings indicate that c-fos/c-jun has significant effects in regulating the mRNA expression of matrix metalloproteinase 20, which shows c-fos/c-jun plays an important biological meaning in enamel development.

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Key words: Proto-Oncogene Proteins c-fos, Matrix Metalloproteinase 20, Dental Enamel

中图分类号:

R318

唐培娟，王长磊，宫春梅，唐培倩，郝建忠. 转录因子c-fos/c-jun调控成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(11): 1673-1677.

Tang Pei-juan, Wang Chang-lei, Gong Chun-mei, Tang Pei-qian, Hao Jian-zhong. c-fos/c-jun regulates extracellular matrix metalloproteinase 20 expression in ameloblasts [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(11): 1673-1677.

图/表（结果） 2

2.1 小鼠c-fos基因的克隆 小鼠c-fos基因PCR扩增后产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的条带大小与目的片段大小一致。目的片段割胶回收后与pcDNA3.1/myc-hisA连接，重组质粒pcDNA3.1/myc-c-fos做双酶切鉴定目的条带与预测结果一致(图1)。

并将初步鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1/myc-c-fos送至南京金斯瑞生物科技公司进行序列分析，得到的基因测序结果经BLAST分析后，与GenBank中小鼠c-fos基因序列完全一致，无碱基的点突变及移码发生。构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/ myc-c-fos。

2.2 双荧光素酶报告基因检测转录因子c-fos/c-jun对小鼠基质金属蛋白酶20启动子转录活性的影响 检测转录因子c-jun转染成釉细胞时发现，基质金属蛋白酶20启动子的荧光素酶活性改变，根据结果显示小鼠转录因子c-jun对基质金属蛋白酶20启动子的转录活性有抑制作用(P < 0.05)。c-fos/c-jun共转染时对基质金属蛋白酶20启动子活性有促进作用(P < 0.05)。而当用c-fos转染成釉细胞时发现，基质金属蛋白酶20启动子的荧光素酶活性无明显改变(图2)。

2.3 实时定量RT-PCR检测c-Jun/c-fos调控基质金属蛋白酶20 mRNA的表达活性 为进一步确定c-Jun/c-fos调控基质金属蛋白酶20基因表达中的作用，利用real time RT-PCR技术发现，在c-Jun转染成釉细胞后，基质金属蛋白酶20 基因的表达水平下降(P < 0.05)，c-fos与c-Jun共转染成釉细胞后，基质金属蛋白酶20 mRNA表达水平得到上升(P < 0.05)。

c-fos转染成釉细胞时发现，基质金属蛋白酶20 mRNA表达水平无明显改变(图3)。

2.4 双荧光素酶报告基因检测c-jun/c-fos调控基质金属蛋白酶20基因启动子野生型和突变型转录活性 借助生物信息分析软件找到启动子区-356至-157内存在的潜在的AP1结合位点，根据设计的基因突变引物，以本实验室的重组质粒PMD18-T-基质金属蛋白酶20(-356-+23)为模板，将特征性序列中碱基TC突变为GT，PGL3-基质金属蛋白酶20(-356-+23)突变质粒构建后通过酶切并且通过GenBank中的BLAST比对DNA序列分析进行鉴定。突变体测序结果表明在预期位点发生突变。

将基质金属蛋白酶20启动子(-356-+23)潜在的AP-1结合位点TTG GTC A突变，双荧光素酶报告基因检测，c-fos、c-jun、pcDNA3.1转染PGL3-基质金属蛋白酶20 (-356-+23)野生型和突变型，转染突变型后c-jun抑制作用消失，c-jun/c-fos促进作用消失，与野生型相比较作用改变明显(P < 0.05)(图4)。

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引言

牙齿中的釉质是人体中最硬的组织，它的形成是一个复杂的过程。首先是成釉细胞在牙间充质-上皮信号诱导下形成，然后是成釉细胞分泌釉基质蛋白等，最后则是蛋白等有机物的水解、清楚，无机物、矿物质的沉积，最终形成了透明、高强度的牙釉质。

基质金属蛋白酶20是一种成釉细胞特异表达的基质金属蛋白酶^[1]，它是一个由20个氨基酸构成的信号肽，位于人11号染色体的q臂上。在成釉细胞的分泌期参与降解牙釉质蛋白，决定了釉质最终的矿化程度及坚硬度。在基质金属蛋白酶20基因敲除的小鼠牙齿中，牙釉质矿化程度及硬度会显著降低^[2]。最近研究发现了2个能够导致牙齿釉质发育缺陷的基质金属蛋白酶20突变基因，进一步说明基质金属蛋白酶20在牙齿釉质发育形成过程中的重要作用。另外，大量的实验也证明了摄入氟过量能够导致牙齿釉质中矿物质及蛋白质结构的改变，从而使基质金属蛋白酶20水解作用的特异性降低。

原癌基因c-jun、c-fos属于AP1基因家族，在受到外在刺激如血清、表皮生长因子作用等均能引起其转录激活。c-fos及其他fos家族成员在它们发挥作用时最常与jun家族成员如c-jun等形成异源二聚体AP-1的形式存在而发挥作用，因而是转录因子^[3]。有资料表明c-fos、c-jun基因的表达与细胞的分化、增殖有关^[4]。在牙齿中c-fos、c-jun主要表达于成釉细胞、成牙本质细胞、成骨细胞、牙囊细胞等。

以前本实验室曾探讨过MEF2C、Runx2家族等多个转录因子家族对成釉细胞中调控基质金属蛋白酶20基因的作用^[5-12]。本实验则利用基因克隆、基因定向突变、定时定量RT-PCR、双荧光素酶基因报告检测系统等方法观察转录因子c-fos/c-jun在小鼠成釉细胞中调控基质金属蛋白酶20基因表达的作用，并在将基质金属蛋白酶20基因启动子上的AP1位点突变后，进一步检测转录因子c-fos/c-jun与该位点的关系。本实验为明确基质金属蛋白酶20在成釉细胞中可能受到的调控通路，探索牙齿釉质发育形成的调控机制，实现为临床工作进行指导，解除牙病患者的痛苦奠定坚实的基础。

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2013年10月至2014年4月在潍坊医学院新校区口腔实验室完成。

实验方法：

小鼠c-fos基因的克隆及重组质粒pcDNA3.1/myc-c-fos的构建：小鼠成釉细胞系为日本秋田大学Sugiyama教授馈赠。将传至第4代以上的小鼠成釉细胞用RNAiso Plus裂解细胞提取小鼠成釉细胞Total RNA，再用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂反转录合成cDNA作为PCR反应的模板。根据Genbank中小鼠c-fos基因序列及oligo软件引物设计原则，利用Primer primer5.0软件设计引物。C-fos上游引物：5’-GG AAG CTT ATG ATG TTC ACC GC-3’(HindIII)，下游引物：5’-AC GGA TCC TTA AAG AGT TAG CAG-3’(BamHI)。引物由TaKaRa工程(大连)有限公司合成，预扩增c-fos mRNA的1 094个碱基DNA片段。C-fos的PCR反应条件为：98 ℃ 2 min，1个循环；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 4 min，1个循环。分别经双酶切、连接、转化等步骤构建重组质粒pcDNA3.1/myc-c-fos，并进行双酶切及测序鉴定(南京金斯瑞公司)，鉴定正确的命名为pcDNA3.1/myc-c-fos。

双荧光素酶检测系统检测转录因子c-fos/c-jun对小鼠基质金属蛋白酶20启动子转录活性的影响：用培养至4代以上状态稳定的ALC细胞铺板用于实验，待铺板20 h后细胞密度长至70%-80%时按照TransFast^TMTransfection Reagent说明书进行转染。转染空质粒pcDNA3.1/myc- hisA(100 ng)作为阴性对照，实验组分为3组，分别为①pcDNA3.1/myc-c-jun (100 ng)。②pcDNA3.1/myc-c-jun (50 ng)+pcDNA3.1/myc-c-fos(50 ng)。③pcDNA3.1/myc- c-fos(100 ng)。实验共计4组，每组4个复孔。

每个样品各加入构建的PGL3-基质金属蛋白酶20 (511 bp)质粒300 ng。在37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下培养24 h，无血清饥饿刺激3 h后收板，各孔用100 μL细胞裂解液裂解成釉细胞，微离心30 s后取20 μL上清用于检测，首先加入100 μL的Luciferase Assay Reagent混匀可检测到萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)激发底物释放荧光的数值(U1)，再加入100 μL的stop＆Glo Reagent混匀可检测到海肾荧光素酶(Renilla luciferase)激发底物释放荧光的数值(U2)。每一样品所测的数值U1/U2的比值为该质粒报告基因的荧光素酶相对活性。利用实验数据计算每组平均值和误差后作图并采用SPSS 12.0进行统计学分析。本实验每一样品均重复3次。

实时定量RT-PCR检测转录因子c-fos/c-jun调控基质金属蛋白酶20 mRNA的表达水平：用培养至4代以上状态稳定的ALC细胞铺板用于实验，细胞培养20 h后长至80%，实验组分为4组，每组6个复孔。分别为：①pcDNA3.1/myc-c- jun(100 ng)。②pcDNA3.1/myc-c-jun(50 ng)+pcDNA3.1/ myc-c-fos(50 ng)。③pcDNA3.1/myc-c-fos(100 ng)。 ④pcDNA3.1/myc-hisA(100 ng)作为空白对照。

每个样品各加入构建的PGL3-基质金属蛋白酶20 (511 bp)质粒300 ng。转染完成后细胞培养22 h，无血清饥饿刺激培养3 h后以此成釉细胞的总RNA反转录的cDNA为模板，进行实时定量PCR。

引物序列：内参对照GAPDH，F：5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’；R：5’- TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’；基质金属蛋白酶20， F：5’-GGC GAG ATG GTG GCA AGA G-3’；R：5’-CTG GGA AGA GGC GGT AGT T-3’。

反应条件95 ℃ 4 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，80 ℃ 15 s采集荧光，40个循环后72 ℃延伸1 min。反应在IQ5^TM PCR仪进行，每个样本3个复孔，用配对t 检验分析实时定量RT-PCR结果。

小鼠基质金属蛋白酶20基因启动子AP1位点的定点突变及双荧光素酶报告基因载体的构建：根据MutanBEST Kit试剂盒说明设计5’端邻接，3’端方向相反的引物，用以导入突变位点。将AP1结合位点由“TTG GTC A”突变为“TTG GGT A”。上游引物P1：5’-TGG GTA ATC ACA AAG AAT GAA GC-3’；下游引物P2：5’-AAT CAT AAA GGG AGA GAA ATG G-3’，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

以本实验室克隆并保存的鼠基质金属蛋白酶20启动子序列(-356-+23)为模板；将导入突变位点的启动子序列连至PGL3-basic，送至南京金斯瑞生物科技公司进行DNA序列分析测序鉴定正确后，命名质粒为PGL3-基质金属蛋白酶20(-356-+23)-AP1-MUT。

利用双荧光素酶报告基因检测转录因子c-fos和c-jun转染基质金属蛋白酶20基因野生型和突变型时启动子转录活性：实验分为6组：①pcDNA3.1/myc-hisA(100 ng)+ PGL3-基质金属蛋白酶20-WT(300 ng)。②pcDNA3.1/ myc-c-fos(50 ng)+pcDNA3.1/myc-c-jun(50 ng)+PGL3基质金属蛋白酶20-WT(300 ng)。③pcDNA3.1/myc-c-jun (100 ng)+PGL3-基质金属蛋白酶20-WT(300 ng)。④pcDNA3.1/myc-hisA(100 ng)+PGL3-基质金属蛋白酶20 (-356-+23)-AP1-MUT(300 ng)。⑤pcDNA3.1/myc-c-fos (50 ng)+pcDNA3.1/myc–c-jun(50 ng)+PGL3-基质金属蛋白酶20(-356-+23)-AP1-MUT(300 ng)。⑥pcDNA3.1/ myc- c-Jun(100 ng)+PGL3/-基质金属蛋白酶20(-356-+23)- AP1-MUT(300 ng)。转染完成后细胞培养24 h，无血清饥饿刺激3 h后收板，进行双荧光素酶报告基因检测进行检测。

主要观察指标：①小鼠c-fos基因的克隆结果。②小鼠基质金属蛋白酶表达活性的检测。③基质金属蛋白酶20基因启动子AP1位点的成功突变。④基因突变后表达活性的检测。

统计学分析：利用实验数据计算每组方差并采用SPSS 12.0进行统计学分析，组间比较用配对t 检验，本实验每一样品均重复3次。

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讨论

原癌基因c-fos是1982年由Curran在成骨肉瘤病毒FBJ-MSV中首次发现的，1983年在人体内发现同源的DNA序列。人类的c-fos基因位于14 q，长度为3.5 kb，由4个外显子和3个内含子组成编码相对分子质量为62 000^[13]。人类的c-jun基因是1987年由Bohmann发现，位于染色体1q^[14]。

大量文献报道哺乳动物fos家族中以c-fos最重要，fos家族在调节AP-1活性和肿瘤发生发展过程等方面具有重要作用^[15-17]。C-fos、c-jun基因分别属于核转录因子AP1家族下的fos家族和jun家族。AP-1蛋白以同源二聚体(jun-jun)或异源二聚体(fos-jun)的形式发挥转录激活作用，在人体内fos家族蛋白则不能形成同源二聚体。当细胞受到生理和病理因素刺激时，如细胞因子、生长因子、应激信号、感染、致癌剂等的刺激，细胞中的AP-1将以c-fos和c-jun异源二聚体为主^[18]，其表达水平和活性均迅速升高，激活下游信号转导通路，在多种肿瘤的生长、侵袭和转移中发挥重要作用^[19-20]。AP-1作为对外界信号发生反应的转录因子而且位于信号级联反应的末端，使外界信号和细胞功能之间建立起一定的联系，因此已作为抗肿瘤药物开发的重要靶标之一。

作者以前曾研究过c-jun调控成釉细胞中基质金属蛋白酶20的作用^[21]，发现c-jun能够抑制基质金属蛋白酶20的表达。所以以此为切入点设计此实验来研究c-fos和c-jun在成釉细胞中的表达以及对基质金属蛋白酶20表达水平的影响，为以后进一步研究AP1家族对成釉细胞的调控作用做准备。本实验首先构建了c-fos真核表达载体重组质粒，用c-jun、c-fos转染基质金属蛋白酶20启动子，根据双荧光素酶报告基因系统和RT-PCR法检测显示100 ng时c-jun对PGL3-基质金属蛋白酶20(511 bp)表达抑制作用明显；50 ng的c-jun、c-fos对PGL3-基质金属蛋白酶20(511 bp)表达具有促进作用；而100 ng的c-fos对PGL3-基质金属蛋白酶20(511 bp)无明显作用。然后利用生物学信息工具分析了基质金属蛋白酶20启动子的基因序列，发现在启动子 -356至-157区域存在潜在的AP1结合位点“TTGGTCA”；再利用基因定点突变将“TC”突变为“GT”，然后利用双荧光素酶报告基因检测c-fos和c-jun转染PGL3-基质金属蛋白酶20(-356-+23)-WT和PGL3-基质金属蛋白酶20 (-356-+23)-AP1-MUT后观察启动子活性变化，100 ng的c-jun转染野生型时抑制启动子区转录活性，但是转染突变型后抑制作用消失；50 ng的c-fos和c-jun转染野生型时启动子活性表达显著上调，但是转染突变型后促进作用明显消失。所以推测c-fos与c-jun形成异源二聚体AP1可能与特异性结合位点结合，突变位点阻断了AP1诱导基质金属蛋白酶20启动子转录活性的作用。

根据以上实验推测c-jun可以形成同源二聚体AP1核转录因子对基质金属蛋白酶20活性表达具有抑制作用，c-fos因为无法形成同源二聚体所以无法影响基质金属蛋白酶20的活性。但是c-jun与c-fos共存时形成异源二聚体对基质金属蛋白酶20基因启动子活性表达有促进，所以二者在牙釉质发育方面都起很重要的作用。本实验研究表明小鼠转录因子c-Jun/c-fos与成釉细胞内基质金属蛋白酶20启动子的特征性序列相互结合从而调控基质金属蛋白酶20的表达水平，以及c-Jun/c-fos结合作用对釉质活性表达的影响；为进一步研究AP1家族基因在牙釉质形成过程中发挥的作用奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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