高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架的3D打印

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (43): 6914-6921.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.005

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高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架的3D打印

袁景^1，2，甄平¹，赵红斌¹

1解放军兰州军区总医院全军骨科中心，甘肃省兰州市 730050；2甘肃中医学院研究生院，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2014-09-20 出版日期:2014-10-15 发布日期:2014-10-15
通讯作者: 甄平，博士，教授，主任医师，硕士生导师，解放军兰州军区总医院全军骨科，甘肃省兰州市 730050
作者简介:袁景，男，1980年生，甘肃省庆阳市人，汉族，甘肃中医学院在读硕士，主要从事创伤骨科，骨组织工程材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81371983)，基金名称：多孔β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球的构建及其抗结核成骨作用研究

High-performance porous beta-tricalcium phosphate bone tissue engineering scaffolds using 3D printing

Yuan Jing^{1, 2}, Zhen Ping¹, Zhao Hong-bin¹

1Department of Orthopedics, General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 2Graduate School, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Received:2014-09-20 Online:2014-10-15 Published:2014-10-15
Contact: Zhen Ping, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Yuan Jing, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; Graduate School, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371983

摘要/Abstract

摘要：

背景：虽然采用溶液浇铸/离子洗出法、原位成型法、静电纺丝法、相分离/冻干法、气体成孔法等制备骨组织工程支架可以获得比较满意的效果，但在精确性、孔隙均匀性、空间结构复杂性、支架个性化等方面略显不足。
目的：利用3D打印制备β-磷酸三钙骨组织工程支架。
方法：利用3D打印制备载药β-磷酸三钙支架，观察其结构，测量其孔隙率和力学强度。将载药β-磷酸三钙支架置入模拟体液中15周，观察其质量变化。将载药β-磷酸三钙支架与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7 d，观察细胞黏附与形态变化。分别采用载药β-磷酸三钙支架浸提液与含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞，培养24，48，72 h检测细胞A值，并确定细胞毒性分级；同时成骨诱导培养1周，检测两组细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：实验制备的支架微观孔隙呈不规则形，孔隙率高，孔隙分布均匀，孔隙连通率高，抗压强度大。载药β-磷酸三钙支架在15周内基本降解完全，与松质骨缺损修复时间相当。大鼠骨髓间充质干细胞黏附于载药β-磷酸三钙支架表面，并深入支架内部，生长良好，增殖活跃，细胞碱性磷酸酶活性有提高，说明载药β-磷酸三钙支架具有良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 孔隙率, 抗压强度, 细胞相容性, 有限元分析, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although the preparation of bone tissue engineering scaffolds can achieve satisfactory results by solvent casting/particulate leaching, in situ molding method, electrospinning, phase seperation/freeze drying, gas foaming, there are still some deficiencies in the accuracy, pore uniformity, spatial structure complexity, personalized stents.
OBJECTIVE: To prepare β-tricalcium phosphate bone tissue engineering scaffolds using 3D printing.
METHODS: Drug-loaded β-tricalcium phosphate scaffolds were prepared with 3D printing, and the structure was observed to measure its porosity and mechanical strength. The scaffold was immersed in simulated body fluid for 15 weeks to observe the quality change. The scaffold was co-cultured with rat bone marrow mesenchymal stem cells for 7 days to observe cell adhesion and morphological changes. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in extracts of drug-loaded β-tricalcium phosphate scaffold and low-glucose Dulbecco's modified Eagle’s medium containing 15% fetal bovine serum for 24, 48, and 72 hours, to determine the absorbance values and cytotoxicity grading, respectively. Meanwhile, the cells were subjected to osteogenic culture for 1 week, and
the alkaline phosphatase activities in two groups were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The prepared scaffold showed irregular micropores, high porosity, uniform pore distribution, high pore connectivity rate, and large compressive strength. The drug-loaded β-tricalcium phosphate scaffold degraded completely with 15 weeks, and cancellous bone defect repair was completed in the same period. Rat bone marrow mesenchymal stem cells adhered to the surface of drug-loaded β-tricalcium phosphate scaffold and went deep into the scaffold, showing good growth and proliferation. The activity of alkaline phosphatase was also improved. These findings indicate that the drug-loaded β-tricalcium phosphate scaffold has good biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: calcium phosphates, tissue engineering, finite element analysis

中图分类号:

R318

袁景，甄平，赵红斌. 高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架的3D打印[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(43): 6914-6921.

Yuan Jing, Zhen Ping, Zhao Hong-bin . High-performance porous beta-tricalcium phosphate bone tissue engineering scaffolds using 3D printing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(43): 6914-6921.

图/表（结果） 3

2.1 β-磷酸三钙骨组织工程支架的外观结构、表面显微结构及孔隙率制备的β-磷酸三钙立体支架截面结构如图2A所示，正中剖面呈现条束状排列结构，为含有微观孔隙的β-磷酸三钙，宏观孔隙400-500 μm，宏观孔隙相互连通。环境扫描电镜观察显示该材料在支架区有微观多孔隙结构，微孔分布均匀，微观孔隙互相连通，大小相仿，孔径2-8 μm，如图2B所示。经检测，三维多孔β-磷酸三钙支架总孔隙率检测为(61.76±2.53)%，其中宏观孔隙率约为42.5%，微观孔隙率为19.26%。

2.2 烧结后多孔β-磷酸三钙支架材料的物相分析烧结后的β-磷酸三钙支架X射线衍射分析图谱见图3B，纳米β-磷酸三钙粉末用同样方法获得X射线衍射分析图谱见图3A。经过对2个图谱主要波峰对比可知，样品烧结前后物相组成没有明显变化，经过1 100 ℃煅烧后支架的物相组成为β-磷酸三钙，没有出现相转变，证明1 100 ℃高温烧结2 h后得到了结晶度较高的β-磷酸三钙多孔支架材料。

2.3 多孔β-磷酸三钙支架抗压强度及有限元分析取烧结后的β-磷酸三钙支架通过抗压强度测试，最大压缩强度为(3.31±0.64)MPa，力学性能可以达到松质骨的抗压强度2-12 MPa^[19]。随机抽取1支架的压缩应力-应变曲线见图4A，曲线上的第一个峰为支架的抗压强度。β-磷酸三钙支架第一主应力分布云图显示，当第一主应力作用时受力最大的部位在材料中部，见图4B。

2.4 模拟体液pH值变化和组织工程支架的质量变化前4周，浸有样品的模拟体液pH值变化不大，pH值在7.4左右；而从第4周到第6周，模拟体液的pH值呈直线下降，pH值在5.5左右，说明支架降解产生的酸性降解产物主要在这个阶段从支架扩散到模拟溶液中；15周时，pH值略有升高，说明材料降解趋于完毕，出现了pH有所回升的现象，变化情况见图5A。在体外降解过程中，材料质量随着时间变化而逐渐降低，在15周时材料降解质量趋于0，降解曲线见图5B。

2.5 活细胞增殖率与成骨活性测定结果实验组与阴性对照组细胞碱性磷酸酶活性分别为(63.4±3.4)，(143.3±1.4)金氏单位/L，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。MTT 检测结果见表1。实验组细胞24，48，72 h的细胞相对增殖率分别为107%，104%，104%，对应的细胞毒性级别均为0。实验组材料上生长良好，有少量细胞长入孔隙，实验组与阴性对照组相比无差异。

2.6 多孔β-磷酸三钙支架上细胞黏附与生长形态观察

显微镜观察材料边缘细胞情况观察：实验组24 h后，见材料边缘有大鼠骨髓间充质干细胞，生长态势良好，细胞较稀疏，三四个细胞簇拥在一起，见图6A；培养48 h后，见材料边缘细胞数量显著增加，布满整个视野，细胞之间紧挨，生长旺盛，并在材料边缘有向上生长，有的细胞进入支架内部，见图6B；72 h后，见细胞有重叠生长，细胞向材料空间内部生长，细胞生长旺盛，在材料边界细胞生长密集，见图6C。通过单位面积计数，发现实验组24，48，72 h细胞数量和阴性对照组无明显差异，两组细胞形态、细胞之间距离均无明显差异。

金相显微镜观察支架材料表面细胞：共同培养48 h取出材料后，荧光染料CFSE对支架材料进行染色，见图7，可见细胞生长于多孔材料表面和孔隙中。

扫描电镜观察材料表面：共同培养48 h，可见在β-磷酸三钙孔隙有大鼠骨髓间充质干细胞，细胞呈梭形和不规则形，与材料表面黏附，在材料表面细胞贴壁、密集生长，长势活跃，并伸出伪足附着材料表面，见图8。

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引言

骨组织工程支架的制备，以往常采用溶液浇铸/离子洗出法、原位成型法、静电纺丝法、相分离/冻干法、气体成孔法等^[1-5]，这些制备方法获得了比较满意的效果，但在精确性、孔隙均匀性、空间结构复杂性、支架个性化等方面不尽人意。磷酸三钙固态时呈晶体结构，根据其内部原子排列的具体形式即晶格不同，分为α-磷酸三钙和β-磷酸三钙，其钙磷比约为1.5，与正常骨组织的钙磷比1.66很接近，具有良好的生物相容性，与骨组织结合好，无排异反应^[6]，在人的骨骼中普遍存在，是一种良好的骨修复材料^[7]。磷酸三钙植入人体后，能在体内降解为新骨的形成，提供较丰富的Ca、P^[8]，由于此特性，以磷酸三钙为基料的人工骨材料的研究与应用也是当今骨组织工程支架发展的活跃领域。目前生物活性材料的研究与应用一般选择β-磷酸三钙而非α-磷酸三钙，其中主要原因是α-磷酸三钙的溶解度过大，植入人体后降解过快，降解和成骨不能很好匹配，导致人工骨材料不能较好地发挥作用^[9-11]。3D打印技术最早于1989年由美国麻省理工学院的Emanual Sachs等报道，由于其性能优越，很快被应用于骨组织工程支架的制备^[12]。3D打印技术制备骨组织工程支架，可选用多种材料^[13]。如果用喷涂式3D打印机自由成型材料，材料必须满足以下条件：材料为打印机墨水时，应为内部均匀不含晶粒的液态状或胶浆状，以保证从管道中流出；流出的材料在一定时间内凝固，以保证喷涂出材料后能保持所设计模型的几何形态。纳米β-磷酸三钙没有水化后凝固的能力，而且和水混合后有小晶粒出现，一度不能做为喷涂式3D打印机的材料应用。经过研究发现用一定浓度的柠檬酸调配，在一定温度下保持一段时间，β-磷酸三钙会变成内部性状均匀的口香糖状喷涂态，还有了自行凝固能力，这为β-磷酸三钙材料能做为喷涂式3D打印机的墨水奠定了基础，使3D打印机能够用喷涂的方式构建计算机软件设计复杂几何形状的骨组织工程支架。本实验以纳米β-磷酸三钙为基础材料，利用3D打印制备了一种高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架，通过以下实验，为后期实验提供实验数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：材料学体外实验。

时间及地点：于2013年9月至2014年7月在解放军兰州军区总医院骨科研究所完成。

材料：SBF模拟体液由实验室配制提供，含有的离子和浓度为Na⁺ 142.0 mmol/L、K⁺ 5.0 mmol/L、Mg²⁺ 1.5 mmol/L、Ca²⁺ 2.5 mmol/L、Cl^- 147.8 mmol/L、HCO₃^- 4.2 mmol/L、HPO₄^2-1.0 mmol/L，SO₄^2- 0.5 mmol/L，pH值：7.4。

高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架体外实验的主要试剂与仪器：
试剂和仪器	来源
纳米β-磷酸三钙、磷酸氢二钾、二氧化硅、氧化锌、石蜡	美国Sigma公司
LGJ冷冻干燥机	解放军军事医学科学院实验仪器厂
超速离心机	美国Backman 公司
IX70倒置相差显微镜	日本Olympus公司
Imager A2电脑型正置金象显微镜	德国 ZEISS公司
AG- 2000G万能材料试验机	日本 Shimadzu 公司
JSM – 5600LV扫描电镜	日本Jeol公司
莱卡硬组织切片机	德国Leica公司
Agient 1100高效液相色谱仪	美国惠普公司
3D-Bioplotter3D打印机	德国EnvisionTEC公司
LD4-F2A医用离心机	北京医用离心机厂
马弗炉	中国科学院上海光学精密机械研究所
Heal ForceCO₂细胞培养箱	力新仪器有限公司
G1115A分光光度计	美国HP公司
X’Pert Pro X射线衍射仪	荷兰PANalytical公司
Dellta 320PH值测定仪、AE 200 电子天平	瑞士Mettler-Toledo公司

实验方法：

墨水配方：在纳米β-磷酸三钙粉末里加入稀柠檬酸，搅拌至稀糊状，加入定量磷酸二氢钾、二氧化硅、氧化锌、直径2-8 μm石蜡微球，搅拌均匀后，37 ℃保存72 h，即得打印墨水。

3D打印：采用计算机辅助设计(CAD)构建了一种多孔支架模板，见图1A。支架13根×13根×5层。3D打印机(3D-Bioplotter^®)采用500 μm喷头，行走速度为100 mm/min，每层厚度500 μm，中间孔隙宽度400 μm。根据CAD模型在三维打印机控制软件上设置好打印参数。在计算机控制下，3D打印机主要完成β-磷酸三钙溶浆在X，Y，Z轴上的喷涂工作，最终完成设计的β-磷酸三钙支架半成品。将打印好的支架1 100 ℃恒温烧结2 h^[14]，致孔剂石蜡微球在烧结过程中被去除，得到β-磷酸三钙骨组织工程支架成品。制成的多孔β-磷酸三钙支架见图1B，C所示。

形貌观察和扫描电镜观察：采用反射式正置金相显微镜观察支架材料的界面结构。正中水平剖开制备的载药三维多孔β-磷酸三钙，取一个层面，倒置相差显微镜和金象显微镜观察支架和微球结合情况，并置于铜台上喷金，用环境扫描电子显微镜，观察支架、微球超微结构。

物相分析：用X射线衍射仪对材料粉体进行物相分析，以确定其相组成，有无在烧结过程中产生相转变。采用Cu 靶Kα射线，电压40 kV，电流150 mA，探测器以一定的角速度在选定的角度范围内连续扫描，获得衍射图谱，扫描步长为0.033°，步进时间为10.16 s。

孔隙率测定、抗压强度和有限元分析：测定未载药支架总孔隙率(即微观孔隙率和宏观孔隙率之和)和测定载药支架总孔隙率均用质量测定法^[15]。随机取本实验制备样品(n=10)，称质量记为m₀；比重瓶内加满乙醇，称质量记为m₁；把样品在比重瓶乙醇中脱气，乙醇将样品的孔隙充满，加满乙醇，称质量记为m₂；将孔隙含有乙醇的样品取出比重瓶，称质量记为m₃。总孔隙率=[(m₂-m₃-m₀)/(m₁-m₃)]× 100%。

利用万能材料试验机，对样品(n=5)进行静态压缩力学性能(压缩力学强度)测定，样品在37 ℃ PBS中浸泡36 h，压缩加载速度为0.1 mm/min，温度为25 ℃。由于β-磷酸三钙生物陶瓷是脆性材料，断裂即失效^[16]，用最大拉应力理论作为其断裂准则，ANSYS14.0有限元分析软件进行分析，最大拉应力对应于第一主应力，将β-磷酸三钙支架的极限拉应力作为有限元分析的临界第一主应力进行有限元分析，根据压力-应力曲线获得数据，查文献获得泊松比为0.28^[17]。由于此样品通过三维软件设计，通过计算可以得知理论宏观孔隙率，故微观孔隙率=总孔隙率-宏观孔隙率。

体外降解实验：随机抽取载药支架10块，质量(482.0±3.4) mg，浸入装有50 mL模拟体液的锥形瓶中，放入37 ℃培养箱^[18]。每周测装有样品的模拟体液的pH值并换液，每周将样品取出冻干，测定质量变化，共测定15周时间。

材料体外细胞生物相容性实验和成骨检测：

多孔β-磷酸三钙支架样品浸提液的制备：样品经辐照灭菌后，将样品按1 mg∶5 mL 的比例，置入含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基(低糖)，37 ℃恒温箱中静置浸提3 d 过滤除菌，取上清液，4 ℃冰箱保存备用。

骨髓间充质干细胞的分离培养：取40 d龄雄性Wistar大鼠1只，体质量187 g，SPF级，由甘肃中医学院动物中心提供，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。对大鼠行安乐死，乙醇浸泡尸体15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清低糖DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用含体积分数10%胎牛血清的DMEM配成混悬液，接种在100 mL培养瓶中，体积分数5%CO₂、37 ℃、饱和湿度培养24 h，换液，去除未贴壁细胞，2 d换液1次，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化后，用血球计数仪计数细胞、传代，P2代用于实验。通过贴壁法体外分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察，大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主，呈放射状排列的细胞集落。分离培养的骨髓间充质干细胞CD44、CD90、CD105呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达，可以认为是合格干细胞。

MTT法测定活细胞增殖率：按细胞生长情况不同，准备好细胞浓度为1×10⁶L^-1的第2代大鼠间充质干细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板内，于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中培养1 d，待细胞贴壁后，各取15孔作为实验组和阴性对照组。实验组加入200 μL制备的样品浸提液和普通含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置换孔内原培养液；阴性对照组加入200 μL普通含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置换孔内原培养液。继续在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。然后共同孵育24，48，72 h吸出样品浸提液，加入20 μL 5 g/L的MTT液，继续培养4 h，然后吸出，加入100 μL DMSO，振荡10 min，用酶联免疫检测仪以570 nm波长测定吸光度值。细胞相对增殖率(RGR)=实验组吸光度值/阴性组对照吸光度值×100%。毒性分级为：细胞相对增殖率≥100%为0级，80%-99%为1级，50%-79%为2级，30%-49%为3级，0-29%为4级。

试剂盒法检测碱性磷酸酶水平评价成骨能力：实验组将高温高压消毒的β-磷酸三钙支架材料(n=10，体积 2 mm×2 mm×2 mm) 置于培养皿内，取第 2 代大鼠骨髓间充质干细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于材料，每块材料接种10 μL细胞悬液，细胞数量为1×10³个。将材料静置于细胞培养箱4 h后，转移至24孔培养板的10孔内，每孔加入200 μL成骨条件培养液(基础培养液中加入10^-⁸ mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油钠和10^-⁴ mol/L维生素C)培养1周。阴性对照组为24孔培养板的10孔内接种10 μL细胞悬液，细胞数量为1×10³个，每孔加入200 μL成骨条件培养液，放入细胞培养箱培养1周。按照说明书用试剂盒检测两组碱性磷酸酶水平。

细胞相容性实验：将第2代大鼠骨髓间充质干细胞以1×10⁶L^-1的细胞浓度接种于实验样品(n=10)，静置2 h，加入低糖DMEM培养液，培养液将样品完全浸没，培养后取不同时间点倒置显微镜观察培养皿内细胞情况。培养48 h时随机取出1支架材料，用金相显微镜观察支架上细胞情况，将支架从培养液取出后，用荧光染料CFSE免疫荧光染色后用金相显微镜观察支架上大鼠骨髓间充质干细胞情况，将得到的骨髓间充质干细胞普通图像和荧光图像用显微镜自带软件进行叠加观察细胞数量；用不加支架材料加入相同量骨髓间充质干细胞单独培养做为对照组进行对照研究。随机取培养48 h接种大鼠骨髓间充质干细胞支架1块，以2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，喷金电镜扫描观察支架上细胞情况。

主要观察指标：β-磷酸三钙骨组织工程支架的表征、降解与细胞相容性。

统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件包进行分析, 数据以x(_)±s表示。组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

3D打印技术最突出的优点是无需机械加工或模具，就能直接从计算机图形数据中生成任何形状的物体，从而极大地缩短产品的研制周期，提高生产率和降低生产成本。随着3D打印技术在构建骨组织工程材料方面的发展^[13]，能将材料构建成复杂空间结构的支架，孔隙规则均匀。本实验设计的立体空间结构β-磷酸三钙支架，支架中含有微观孔隙和宏观孔隙。其中微观孔隙2-8 μm的多孔孔隙结构，宏观孔隙间隙约400 μm。在打印墨水中加入直径2-8 μm的石蜡微球，可以使支架有微观孔隙；宏观孔隙为打印机喷头根据模型的几何数据喷涂而构建。

3D打印CAD软件设计骨组织工程，在打印之前，如粉末的堆积密度，粉末流动性，每层厚度，黏合剂的液滴体积，黏合剂和粉末的吸水性等这些参数至关重要；打印过程中墨水流动性是关键，流动性主要是由颗粒大小、粒度分布、表面粗糙度和形状确定。喷头一旦将打印墨水喷出，要求在短暂时间内形状固定，这个时间决定了打印喷头移动的速度。这些因素共同影响着打印的分辨率^[20]。在计算机控制下，通过CAD文件数据创建喷头轨迹文件的指令，打印头喷头将生物材料做成的墨水一层一层堆积起来，最终完成整个打印过程^[21]。

β-磷酸三钙骨组织工程材料能够有效促进和诱导骨组织再生，大约3个月可达到重建^[22]。作者采用β-磷酸三钙作为骨组织工程支架材料，而非α-磷酸三钙，其中主要原因是α-磷酸三钙的溶解度过大，植入人体后降解过快，不能较好地发挥作用；β-磷酸三钙支架在成骨效果、降解速率方面有显著优势^[23-25]。致密型β-磷酸三钙生物力学性能较好，但不利于材料在体内降解，因而实际应用不多^[6]。多孔β-磷酸三钙生物陶瓷巨大的比表面积可以促使材料在体内降解，增大了与体液的接触面积，孔隙支持细胞穿过和代谢物流通。这主要是由骨组织的特点决定，如果植入骨基质的材料为骨单位提供支持框架，则骨单位可以此为依托生长，骨缺损可以重建和修复；如果为骨缺损提供的骨基质材料在孔隙形貌和结构上与骨单位及脉管连接方式一致，则植入材料能促进骨组织的重建^[26]。β-磷酸三钙植入体内后，首先在体液作用下进行物理解体，其表现为体液浸泡材料，材料解体为微粒；下一个过程是化学溶解，在体液中水、离子作用下，磷酸三钙生成Ca²⁺、HPO₄^2-、PO₄^3-等，是体液介导的过程，生成的离子可以给成骨细胞呈递营养物质；再一个过程是细胞过程，体内的巨噬细胞、破骨细胞、多核细胞对材料进行吞噬^[27]，导致材料降解。β-磷酸三钙的降解在体内主要受上述因素影响，但降解速率快慢，和β-磷酸三钙材料的孔隙率、致密程度、与其他物质复合、宿主的个体差异、植入部位等多因素有关。本实验构建的β-磷酸三钙支架降解时间约90 d，和松质骨缺损的修复时间相当，修复骨缺损降解和成骨达到了很好的匹配^[28]。

本实验通过3D打印制备的β-磷酸三钙支架在力学性能上达到了松质骨的抗压强度，打印墨水中的磷酸二氢钾为黏结剂，在β-磷酸三钙烧结时产生黏结效应^[29]。二氧化硅、氧化锌的添加有助于改善材料的力学性能^[18^，^30]。最近的研究表明，磷酸钙支架增加添加一些成分后，可以调节支架降解速率、致密程度、机械强度和生物相容性等^[22^，^31-32]。0.5%的SiO₂和0.25%的ZnO添加入β-磷酸三钙支架材料后可使其抗压强度增加2.5倍、细胞存活率增加92%以上^[32]。研究发现，Zn和Si可提高Ⅰ型胶原COL1基因表达和细胞外信号调节激酶的分泌，正调节血管生成、成骨细胞增殖与分化和形态发生^[33]。

本实验所制备的支架含有宏观孔隙和微观孔隙，有利于骨细胞长入，细胞附着，微血管长入，利于新骨生成与重建，以及营养物质代谢。Woodard等^[34]制作的羟基磷灰石支架同时含有宏观孔隙和微观孔隙，通过观察宏观孔隙(250-350 μm)和微观孔隙(2-8 μm)发现，同时含有两种孔隙支架的新骨形成优于仅含有宏观孔隙的支架。Tarafder等^[32]发现3D打印的β-磷酸三钙支架烧结后，具有大于60%的孔隙率，增加了成骨细胞的活性，加快了新骨形成，同时抗压强度达到(10.95±1.28) MPa。Lu等^[35]通过3D打印的β-磷酸三钙支架孔隙约400 μm，证实此宏观孔隙在骨细胞成长、新骨形成、代谢物新陈代谢、血管长入方面是比较适合的。

β-磷酸三钙骨组织工程支架可用负载有生长因子、药物、基因或等^[36-39]，在骨组织工程材料中占有非常重要的位置。本实验用3D打印成功构建了立体结构、高度连通孔隙的β-磷酸三钙支架，含有宏观孔隙和微观孔隙。如何构建和骨质缺损几何形状相一致的支架，以及支架负载其他成分提高其力学性能将是继续探索的目标。本实验的不足之处在于，所构建的支架力学性能还不是很高，体外降解实验还不能模拟破骨细胞、巨噬细胞、多核细胞对β-磷酸三钙的吞噬作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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β-磷酸三钙骨组织工程材料能够有效促进和诱导骨组织再生，大约3个月可达到重建。作者采用β-磷酸三钙作为骨组织工程支架材料，而非α-磷酸三钙，其中主要原因是α-磷酸三钙的溶解度过大，植入人体后降解过快，不能较好地发挥作用；β-磷酸三钙支架在成骨效果、降解速率方面有显著优势。致密型β-磷酸三钙生物力学性能较好，但不利于材料在体内降解，因而实际应用不多。多孔β-磷酸三钙生物陶瓷巨大的比表面积可以促使材料在体内降解，增大了与体液的接触面积，孔隙支持细胞穿过和代谢物流通。这主要是由骨组织的特点决定，如果植入骨基质的材料为骨单位提供支持框架，则骨单位可以此为依托生长，骨缺损可以重建和修复；如果为骨缺损提供的骨基质材料在孔隙形貌和结构上与骨单位及脉管连接方式一致，则植入材料能促进骨组织的重建。β-磷酸三钙植入体内后，首先在体液作用下进行物理解体，其表现为体液浸泡材料，材料解体为微粒；下一个过程是化学溶解，在体液中水、离子作用下，磷酸三钙生成Ca²⁺、HPO₄^2-、PO₄^3-等，是体液介导的过程，生成的离子可以给成骨细胞呈递营养物质；再一个过程是细胞过程，体内的巨噬细胞、破骨细胞、多核细胞对材料进行吞噬，导致材料降解。β-磷酸三钙的降解在体内主要受上述因素影响，但降解速率快慢，和β-磷酸三钙材料的孔隙率、致密程度、与其他物质复合、宿主的个体差异、植入部位等多因素有关。本实验构建的β-磷酸三钙支架降解时间约90d，和松质骨缺损的修复时间相当，修复骨缺损降解和成骨达到了很好的匹配。

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高性能多孔β-磷酸三钙骨组织工程支架的3D打印

High-performance porous beta-tricalcium phosphate bone tissue engineering scaffolds using 3D printing

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